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UNIVERSIDAD PRIV PRIVADA ADA ANTENOR ORREGO FACULTAD DE MEDICI MEDICINA NA HUMANA Y CIENCIAS ESCUELA PROFESI PROFESIONAL ONAL DE MEDICINA HUMANA

PRÁCTICA DE LABORATORIO 4 Estudiante Aguirre Castillo, Karen Valeria Asignatura Bioquímica y Nutrición Humana Docente Bardales Vásquez, Cecilia NRC 4446 ID 000234608

TRUJILLO-PER TRUJILLO-PERÚ Ú 2020

LABORATORIO N° 4 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES 1. Introducción Las proteínas son macromoléculas, cuyas unidades estructurales son los aminoácidos unidos por enlaces peptídico. Participan en las estructuras y diversidad de funciones como transporte, hormonal, inmunológica, etc. Las proteínas séricas totales comprenden la albúmina y las globulinas, que pueden ser alfa1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gammaglobulinas al separarlas por electroforesis. Son sintetizadas en el hígado con excepción de las inmunoglobulinas. La albúmina es la principal proteína sérica. Las proteínas séricas totales pueden disminuir (hipoproteinemia) generalmente secundarias a hipoalbuminemia o aumentar (hiperproteinemia) generalmente por aumento de las globulinas. Las globulinas aumentan en procesos inflamatorios, infecciosos., en las hepatitis crónicas y cirrosis. En la cirrosis se tiene la inversión de la relación albúmina/globulina. La inmunoglobulina IgG. aumenta en la hepatitis autoinmune, la IgM en la cirrosis biliar y la IgA en la enfermedad hepática alcohólica. Las gammaglobulinas pueden aumentar en forma policlonal como en la cirrosis o monoclonal como en el mieloma múltiples. 2. Fundamento Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra. 3. Reactivos Reactivo A: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido de sodio 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP). Estándar (Suero Patrón): solución de albúmina y globulinas de origen bovino, con título conocido de proteínas y albúmina. Proteínas: 6 g/dl. Albúmina: 4 g/dl 4. Muestra: Suero 5. Procedimiento Armar el siguiente sistema: Blanco Estándar (S) Desconocido (D) Agua

50 ul

Estándar Proteínas Muestra

---------

50 ul

--------

--------

50 ul

Reactivo A

3,5 ml

3,5 ml

3,5 ml

Mezclar Incubar a 37 °C por 15 min. Leer a 540 nm llevando a cero con el blanco el D y S Cálculo: D x factor Factor: Concentración. Estándar Proteínas Absorbancia Estándar Resultados Blanco: 0,00 Absorbancia del Estándar: 0,300 Absorbancia del Problema: 0, 200 Factor = 20 Concentración del problema = 4 g/dl 6. Valores de referencia: 6,1 a 7,9 g/dl 7. Interpretación Vemos que el valor obtenido, el cual es 4 g/dl esta por menor de los valores normales los cuales son 6,1 a 7,9 g/dl, eso significa que hay una disminución de las proteínas totales y como posibles hipótesis de por qué pasó esto es que ocurre una hipoproteinemia, debido a una mala nutrición, donde no se llegan a incluir alimentos ricos en proteínas ya sean de origen vegetal o animal, también por un daño en el intestino donde no se absorben correctamente los aminoácidos esenciales, así como también fallas renales donde haya una pérdida de proteínas en la orina. 8. Cuestionario ¿En qué se diferencia el ssuero uero de dell plasma? ¿Cómo se obtienen? La principal diferencia entre suero y plasma es sus factores de coagulación. Donde el fibrinógeno, esencial para la coagulación, está presente en el plasma, mientras que el suero vendría ser la parte que no se coagulará. Otra diferencia que podemos encontrar es su contenido, mientras que en el plasma encontramos eritrocitos, leucocitos y los factores de coagulación (plaquetas), el suero es principalmente agua y en este se disuelven proteínas, hormonas, minerales, siendo una fuente importante de electrolitos. Como se obtienen: PLASMA: Para obtenerlo tenemos que proceder a una extracción de sangre, la cual es colocada en un tubo de ensayo en donde coagulará. Se tendrá que impedir la coagulación, actuando sobre algunos puntos de la cascada de la coagulación, o simplemente se le puede añadir una sustancia quelante del calcio (ésta atrapa el calcio de la sangre impidiendo la coagulación). Posteriormente se centrifuga, obteniéndose dos fracciones: El primer precipitado en el fondo del tubo corresponde a las células de la sangre. Un sobrenadante, parte líquida que corresponde al plasma. SUERO: Para su obtención se extrae sangre, se coloca en un tubo de ensayo, dejando que coagule, se procede a la activación de la cascada de ensayo, para

obtener fibrina (células de la sangre, coágulo gelatinoso), posteriormente se exprime y se libera el líquido, éste será el suero (parte líquida de la sangre después de la coagulación). ¿Cuáles son las proteínas plasmáticas? Las proteínas plasmáticas se pueden dividir en dos grupos: albúminas con 60% y las globulinas que se subdividen en alfa 1, alfa 2, beta y gamma (inmunoglobulinas G, M y A). ¿Qué proteínas son alfa2 globulinas? El grupo de las alfa-2 globulinas está compuesto de ceruloplasmina (transporte de cobre), Alfa-2 macroglobulina (inhibidora de la proteasa y acción antiinflamatoria), Haptoglobina (efectos antibacterianos y proteína de unión de la hemoglobina), Alfa-2 lipoproteína LDL (transpote de lípidos y triglicéridos). ¿Qué proteína proteínass son beta globulinas? Se pueden clasificar en dos grupos beta 1 y 2 globulinas. Dentro de beta-1 globulina, encontramos Trasferrina (transporte de hierro del intestino a tejidos) y Hemopexina (fija y transporta de la parte hemo de la hemoglobina al hígado). En beta-2 globulina está beta 2- lipoproteína (transporte de lípidos: colesterol, se eleva por hipercolesterolemia) y Complejo C3 (acción de inmunidad: lisis de bacterias). ¿Qué tipo de gammag gammagllobulinas conoce? También llamadas inmunoglobulinas o anticuerpos, aquí encontramos IgA (presente en las membranas mucosas de las vías respiratorias, el tracto gastrointestinal, saliva y lágrimas), IgM (Se encuentra principalmente en la sangre y líquido linfático, es el primero que se genera ante una infección), IgG (es el más abundante en los líquidos corporales, brinda protección contra las bacterias e infecciones virales), IgD y IgE (asociado a reacciones alérgicas, lo encontramos en los pulmones, piel y membrana mucosa). Señale cinco enfermedade enfermedadess pueden caus causa ar hipoproteinemia hipoproteinemia.. ✓ Pancreatitis crónica ✓ Enfermedad de Crohn ✓ Síndrome nefrótico ✓ Hepatitis ✓ Cirrosis hepáticas ✓ Enfermedad de Whipple Señale cinco enfermedade enfermedadess que pueden causar hipe hiperprote rprote rproteinemia inemia ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

Amiloidosis Hepatitis B y C VIH/ sida Mieloma múltiple Deshidratación

DETERMINACIÓN DE ALBÚ ALBÚMINA MINA 1. Introducción La albúmina es la principal proteína del plasma, mantiene la presión coloido osmótica del plasma, transporta bilirrubina, calcio, ácidos grasos y otras sustancias. La hipoalbuminemia puede deberse a defectos de síntesis (hepatitis crónica, cirrosis), a menor aporte (desnutrición, kwashiorkor), proteinuria o pérdida intestinal. 2. Fundamento La albúmina reacciona con la forma aniónica del 3,3’,5,5’ tetra bromosulfon cresol ftaleína con aumento de la absorbancia a 625 nm 3. Reactivos Reactivo B: solución de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftaleína (en polioxietilén lauril éter S. Standard (Suero Patrón): solución de albúmina y globulinas de origen bovino, con título conocido de proteínas y albúmina 4. Muestra: suero 5. Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo Blanco Estándar Desconocido Estándar

10 ul

Muestra Reactivo TBCSF

10 ul 3,5 ml

3,5 ml

3,5 ml

Mezclar Incubar a temperatura ambiente (15 a 28 °C) por 15 minutos. Leer a 625 nm llevando a cero con el blanco reactivo Leer dentro de los 20 minutos Cálculo: D x f F= Concentración del Estándar de Albúmina (g/dl) Absorbancia del Estándar Resultados Resultados: Blanco: 0,00 Estándar: 0,400 Desconocido: 0, 280 Factor = 10 Concentración de desconocido: 2.8 g/dl 6. Valores de referencia 3.5-4.8 g/dl

7. Interpretaci Interpretación ón De acuerdo con el resultado vemos que está disminuido, debido a que no está dentro de los rangos normales, los cuales son 3.5 a 4.8 g/dl, esto nos indicaría un caso de hipoalbuminemia y esto se puede deber a distintas causas como una deficiente ingesta de proteínas, un inflamación intestinal o daños por una bacteria que esté impidiendo que se absorban debidamente los aminoácidos, otra puede ser un daño hepático donde no se está produciendo la suficiente cantidad de albúminas y un daño renal donde no se filtre correctamente la sangre y haya una pérdida de esta proteína. 8. Cuestionario ¿En qué patologías se produ produce ce hipoalbu hipoalbuminemia? minemia? Estado nutricional deficiente: No hay ingesta suficiente de proteínas. Aumento en la pérdida en los siguientes casos: o Disfunción renal (puede que se esté liberando albúmina en la orina) o Presencia de hepatitis o cáncer al hígado o Enfermedad inflamatoria intestinal o linfoma o Sarcoma o amiloidosis o Quemaduras y hemorragias ¿En qué casos se produce hipe hiperalbumin ralbumin ralbuminemia? emia? • •

La hiperalbuminemia se produce en los siguientes casos: • Deshidratación severa • Trastorno de la médula ósea • Inflamaciones crónicas • Mieloma múltiple • Amilosis • VIH/sida ¿Cuál es la relación entre los niveles de albúmin albúmina a y grados de desnutrición? La albúmina es utilizada como marcador nutricional para identificar la desnutrición en el paciente con por ejemplo enfermedad renal crónica o daño hepático. DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS TRANSAMINASA GLUTÁMICO-PIRÚVICA AMINOTRANSFERASA

O

ALANINA

1. Introducción Alanina aminotransferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico-Pirúvica o GPT, exclusivamente citoplasmática y es más específica de daño hepático o renal También presente en el tejido muscular. Aumento: - Hepatitis aguda, GPT>GOT, generalmente >500 U/l. - Hepatitis crónica: GPT>, 2, sugestivo. - Ictericia obstructiva: discreto aumento. Otras causas: daño muscular la AST aumenta en forma significativa y la ALT menos, igualmente con la hemólisis. La AST aumenta en el infarto de miocardio Fundamento L-alanina + alfa cetoglutarato --------L- glutamato + piruvato El piruvato reacciona con la fenilhidrazina dando compuesto coloreado en medio alcalino que se lee a 505 nm Reactivos Sustrato ALT (Reactivo A): alanina 200 mM, alfacetoglutarato 2mM, buffer fosfato 100 mM pH 7.4 Reactivo B: difenilhidrazina 1 mmol en HCL 1 M Reactivo C. NaOH 0,4 M Estándar de piruvato de sodio 2 mM Muestra: Suero Procedimiento: Reactivo Blanco Desconocido Sustrato GPT

0,5 ml

0,5 ml

Pre incubar a 37 °C por 5 minutos Suero Agua

100 ul 100 ul

Mezclar e incubar exactamente 30 minutos a 37 °C Reactivo B

0,5 ml

0,5 ml

Mezclar e incubar a 37°C por 10 minutos. Luego agregar Reactivo C

5 ml

5 ml

Mezclar, sacar del baño y leer después de 2 minutos a 505 nm Obtener concentración de curva de calibración Resultados: Absorbancia de Blanco: 0,200 Absorbancia del Desconocido: 0,678 Absorbancia neta del Desconocido: 0.478 Curva de Calibración de GPT Se construyó usando diferentes concentraciones del Estándar (piruvato de sodio) de acuerdo con el protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes absorbancia para las unidades señaladas

Actividad: Unidades (U/l) 0

Absorbancia

Absorbancia neta

0,200

0,00

9

0,261

0,061

18

0,329

0,129

25

0,380

0,180

37

0,454

0,254

46

0,510

0,310

56

0,564

0,364

79

0,678

0,478

113

0,780

0,580

Calcular la absorbancia neta de cada actividad. Graficar curva de calibración.

Curva de calibración de GTP 0.7

0.6

ABSORVANCIA NETA

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0 0

20

40

60 UNIDADES (U/L)

80

100

120

CONCENTRACIÓN DE GTP Concentración Unidades (U/I)

Absorción neta

Factor= CONC/ABS. Neta

0

0

0

9

0.061

147.54

18

0.129

25

0.180

37

0.254

46

0.310

56

0.64

79

0.478

113

0.580

194.83

Sumatoria

1167.62

Factor promedio

129.74

Valor de concentración de GPT

62.02

139.53 138.89 145.67 148.39 87.50 165.27

GPT del paciente: 62.02 U/l 6. Valores de referencia: hasta 12 U/l 7. Interpretación de los resultados Dados los resultados obtenidos de GTP podemos decir que está muy elevado tomando el valor de referencia que es hasta 12 U/l, podemos decir que esto ha sucedido debido a problemas hepáticos y daño en el páncreas. TRANSAMINASA GLUTÁMICO OXALACÉTICA O ASPARTATO AMINOTRANSFERASA 1. Introducción Introducción. Aspartato aminotransferasa (AST) o Transaminasa Glutámico Oxalacética o GOT, es una enzima citoplasmática y mitocondrial presente en los hepatocitos, pero también en las células de otros tejidos como corazón, músculo esquelético y riñón. Se emplea en el diagnóstico de hepatitis aguda igual que la TGP. En hepatitis alcohólica y cirrosis la relación GOT/GPT se invierte 2. Fundamento L-aspartato + alfa cetoglutarato --------L- glutamato + oxalacetato El oxalacetato se convierte en piruvato reacciona con la fenilhidrazina dando compuesto marrón en medio alcalino que se lee a 505 nm 3. Reactivos

Sustrato AST (Reactivo A): aspartato 200 mM, alfacetoglutarato 2mM, buffer fosfato 100 mM pH 7.4 Reactivo B: difenilhidrazina 1 mmol en HCL 1 M Reactivo C. NaOH 0,4 M Estándar de piruvato de sodio 2 mM 4. Muestra: suero 5. Procedimiento Reactivo

Blanco

Desconocido

Sustrato GOT

0.5 ml

0.5 ml

Preincubar a 37 °C por 5 minutos Suero Agua

100 ul 100 ul

Mezclar e incubar exactamente 30 minutos a 37 °C Reactivo B

0.5 ml

0.5 ml

Mezclar e incubar a 37°C por 10 minutos. Luego agregar Reactivo C

5 ml

5 ml

Mezclar, sacar del baño y leer después de 2 minutos a 505 nm Resultados: Absorbancia de Blanco: 0,220 Absorbancia del Desconocido: 0,504 Absorbancia neta del Desconocido: 0.284 Curva de Calibración de GOT Se construyó usando diferentes concentraciones del Estándar de acuerdo con el protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes absorbancias para las unidades señaladas Actividad: (U/l) 0 7 12 20 28 37 48 81

Absorbancia

Absorbancia neta

0,220 0,267 0,290 0,325 0,355 0,386 0,423 0,504

0,00 0,047 0,070 0,105 0,135 0,166 0,203 0,284

Calcular la absorbancia neta de cada actividad. Graficar curva de calibración.

Curva de calibración de GOT 0.3

ABSORVANCIA NETA

0.25 0.2 0.15

0.1 0.05 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

ACTIVIDAD (U/L)

CONCENTRACIÓN DE GTP Concentración Unidades (U/I)

Absorción neta

Factor= CONC/ABS. Neta

0

0

0

7

0,047

148.94

12

0,070

171.43

20

0,105

190.48

28

0,135

207.41

37

0,166

222.89

48

0,203

236.45

81

0,284

285.21

Sumatoria

1462.80

Factor promedio

182.85

Valor de concentración de GPT

51.93

90

GOT del paciente: 51.93 U/l 6. Valores de referencia: hasta 12 U/l 7. Interpretación de resultados Utilizando el valor de referencia, el cual es 12 U/l podemos decir que el valor obtenido del paciente es sumamente grande, como posible hipótesis de lo que está sucediendo es que haya un daño a nivel del corazón (cardiaco) 8. Cuestionario ¿Cuál es el rol de la transamina transaminación ción en el metabolismo nitrogenado? Son reacciones donde se traspasa el grupo amino desde un α-aminoácido a un α-cetoácido, convirtiéndose el 1º en α-cetoácido, y el 2º en un αaminoácido. Las enzimas que catalizan estas reacciones son las transaminasas y necesitan el piridoxal fosfato (PLP) como coenzima. Cuando predomina la degradación, la mayoría de los aminoácidos cederán su grupo amino al α-cetoglutarato que se transforma en glutamato (GLU), pasando ellos al α-cetoácido correspondiente. Hay dos transaminasas, GOT y GPT, cuyos niveles en suero tienen un importante significado en el diagnóstico clínico. Estas enzimas, abundantes en corazón e hígado, son liberadas cuando los tejidos sufren una lesión, por lo tanto, sus niveles altos en suero pueden ser indicativos de infarto de miocardio, hepatitis infecciosa, u otros daños orgánicos.

¿Cuál es el rol del piridoxal fosfato en la transamina transaminación? ción? El PLP actúa como coenzima en todas las reacciones de transaminación, y en ciertas reacciones de descarboxilación, desaminación, y racemización de aminoácidos. El grupo aldehído del PLP forma una estructura tipo base de Schiff (una aldimina interna) con el grupo ε-amino de una lisina ubicado en el sitio activo de la aminotransferasa. El grupo α-amino del aminoácido sustrato desplaza al grupo ε-amino de la lisina ubicada en el sitio activo en un proceso conocido como "transaldiminación". Podemos decir que las transaminasas necesitan el piridoxal fosfato para ejercer su función; actúa como transportador del grupo amino entre los sustratos, alternando su estructura entre la forma aldehídica (piridoxal fosfato, PLP) y la forma aminada (piridoxamina-5-fosfato, PMP).

¿Cuál es la utilidad de las transaminas transaminasas as en el diagnóstico? El uso de las transaminasas en los exámenes bioquímicos, específicamente en un análisis de sangre, es que es utilizado como un indicador, ya que se miden teniendo en cuenta valores de referencia o rangos establecidos, si se ve una elevación o disminución de la cantidad de las transaminasas nos indicaría un daño a nivel tisular, sean las células hepáticas, del corazón, del músculo o del riñón. 9. Referencias bibliográficas 1. Harper, Bioquímica Ilustrada, 30 ed, 2016 2. Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina 3. Harrison, Medicina Interna, 19 edición, 2016

4. Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018 5. METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS. Tema 20-1.- Aspectos generales de la degradación de aminoácidos: Reacciones de desaminación, transaminación y descarboxilación. [Internet]. Www3.uah.es. [Citado el 23 de octubre de 2020]. Disponible en: http://www3.uah.es/bioquimica/Tejedor/bioquimica_quimica/RT20-1-Rgenerales.pdf Enlaces de video 1.

Determinación de proteínas totales:

https://www.youtube.com/watch?v=hcXe7nTz3jY 2. Determinación de TGP o ALT https://www.youtube.com/watch?v=lLvBWkRfl-4...