Fasc Biom B TP automne 2020 PDF

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UE BIOMOLECULES B : TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE TP AA : ACIDES AMINES - PROPRIETES IONIQUES TP ADN : EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

LIRE TRES ATTENTIVEMENT LES PAGES SUIVANTES Consignes page 1-2 Rappels page 3-4 TP Acides aminés page 5-8 CR TP Acides aminés page 9-12 TP ADN banane page 13-14 CR TP ADN banane page 15-17 IMPORTANT :

1- Vous devez IMPERATIVEMENT consulter la liste de votre groupe pour connaître vos 2 dates de TP (sur CLACO /Biomolécules B /Cours, TD, TP /TPs /Dates et ordre de réalisation des TP) AVANT LES TPs 2- Vous devez PREPARER VOS TP AVANT de vous y rendre et répondre aux questions marqués avec un astérisque * (4 par TP). Il faut préparer les questions de manière individuelle, en feuille séparée du reste de fascicule et les rendre au début du TP à l’enseignant. 3- Salle de TP : JACOB ET MONOD, bâtiment Grignard, RdC. CONSIGNES A RESPECTER EN SALLE DE TP ATTENTION : Le non respect des consignes concernant le port de la blouse, l’état de la paillasse et de la vaisselle sera sanctionné (-2 points sur la note). En préparant la manipulation chez vous, faire des annotations (par exemple par le soulignement au moyen de couleurs différentes) afin de : - mettre en évidence les temps d'attente, en vue d'organiser au mieux le travail à la paillasse. - distinguer les volumes de solution à mettre ou à prélever avec précision (à la pipette) de ceux qui sont au contraire approximatifs (à l'éprouvette). - prévoir tous les essais à blanc (pratiquement toutes les manipulations en demandent un). Généralités - Barreau aimanté : régler correctement sa vitesse de rotation. En présence d'une électrode, il ne doit jamais la heurter. - Dilution : précise, elle doit être faite dans une fiole jaugée, dans l'eau (sauf indication contraire). - Dosage : outre l'essai à blanc, deux essais au minimum doivent être menés en parallèle pour le produit à doser. 1

- Matériel jaugé (pipettes, fioles, etc.) : il est interdit de le chauffer. - Paillasse : la laisser propre. - Vaisselle : après lavage à l'eau du robinet, la rincer à l'eau déminéralisée. Mettre les tubes à essais ou à hémolyse en position d'égouttage sur un porte-tubes métallique. Pesée - Utiliser un bécher ou une capsule à la dimension de la quantité à peser. - Eteindre la balance lorsque la pesée est terminée. - Transvaser le solide pesé et rincer le récipient de pesée. - Faire figurer dans vos résultats : pesée théorique et pesée réelle. Pipette - Avant de l'utiliser, regarder si elle est à écoulement total ou non. - Aspirer au-delà du zéro, essuyer l'extrémité qui a été immergée, ajuster à zéro puis transférer. - Sale, elle doit être posée sur la paillasse en attendant d'être lavée et remise sur son support. - Blouse, lunettes et masque : leur port est obligatoire. VOUS DEVREZ APPORTER VOS LUNETTES. Quelques paires de lunettes de protection seront à votre disposition en salle de TP si vous n’avez pas encore, par contre nous ne pourrons pas vous admettre en salle de TP si vous n’avez pas votre blouse (en coton) ou votre masque. -Ne pas jeter n’importe quel produit à l’évier ! En cas de doute, demander à l’enseignant. Utiliser les flacons de récupération prévus à cet effet.

EVALUATION DE VOS RESULTATS Avant aller en TP il faut préparer les 4 QUESTIONS MARQUEES avec un astérisque et les rendre en début de séance. Pendant le TP, vous devez remplir 2 feuilles des QUESTIONS (COMPTE RENDU). L’enseignant vous expliquera la façon de les remplir. Vous devrez indiquer vos résultats expérimentaux et répondre à quelques questions (théoriques ou d’interprétation de vos résultats). Ces QUESTIONS seront corrigés et notés par l’enseignant pendant la séance (1 par binôme). Vous aurez un « examen écrit de TP » en fin de semestre. Il vous est vivement recommandé de vous y préparer en travaillant bien le fascicule de TP avant et après la séance de TP.

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RAPPELS A PROPOS DE L’UTILISATION DES PIPETTES AUTOMATIQUES (MICROPIPPETES)

Avant utilisation, choisissez la pipette adaptée en fonction du volume désiré : -de 0.5 à 10 μL, utiliser une P10 (10 µl maxi) -de 5 à 20 μL, utiliser une P20 (20 µl maxi) -de 20 à 200 μL, utiliser une P200 (200 µl maxi) -de 200 à 1000 μL, utiliser une P1000 (1000 µl maxi). -de 500 à 5000 μL, utiliser une P5000 (5000 µl maxi).

Il est ABSOLUMENT INTERDIT d'utiliser les P10, P20, P200, P1000 et P5000 en dehors des gammes de volumes précisés ci-dessus! Aucun liquide ne doit pénétrer dans le corps de la micropipette. La micropipette doit toujours être maintenue verticale et l'extrémité inférieure vers le bas. Ne pas laisser la pipette munie d’un cône posée sur la paillasse (toujours enlever le cône avant de poser la pipette !). Pour prélever un échantillon : la pipette étant verticale et munie d’un cône adapté, appuyez doucement sur le bouton-poussoir jusqu'à la 1ère butée (B). Immergez le cône de 1 à 5 mm dans le liquide à prélever, pour aspirer relâchez lentement le bouton-poussoir sans à-coup jusqu'à la position de repos (A). Retirez le cône du liquide. Pour distribuer, positionnez la pointe du cône contre la paroi du récipient. Délivrez la solution en appuyant doucement et sans à-coup jusqu'à la 1ère butée (B) puis jusqu’à la 2ème butée (C). Retirez la pipette du récipient puis relâchez le boutonpoussoir jusqu'à la position de repos (A, relâché). Ejectez le cône dans une poubelle.

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RAPPELS A PROPOS DES DOSAGES SPECTROPHOTOMETRIQUES Un grand nombre de molécules d'intérêt biologique absorbent en lumière ultraviolette (200 à 320 nm) ou visible (320 à 800 nm). D'autres molécules n'absorbent pas mais peuvent donner avec un réactif approprié un composé possédant un spectre d'absorbance, permettant ainsi un dosage spectrophotométrique. 1. LOI DE BEER-LAMBERT Soit un faisceau lumineux monochromatique de longueur d'onde λ et d'intensité lumineuse I0, traversant sur une épaisseur l une substance en solution, de concentration c, dans un solvant transparent. Si IT est l'intensité transmise on a :

I0

IT

l IT − α.l.c T = T étant la transmission = e I0 On appelle absorbance le logarithme décimal de l'inverse de la transmission. 1 α 1 I I A = log = log 0 = .l.c . Ln 0 = T I T 2, 3 IT 2 , 3 On pose ε = α/2,3. Et donc :

A = ε .l.c

l = épaisseur de la cuve en cm (en général 1 cm) c = concentration en mol.L-1 ε = coefficient d'absorption molaire du produit considéré (L.mol-1.cm-1)

N. B. : Si c est exprimée en g.100 mL-1 : A = E.l.c

avec E = coefficient d'absorption spécifique

On peut donc doser un produit en mesurant l'absorbance de la solution si on connaît son ε à la longueur d'onde utilisée.

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TP AA ACIDES AMINES - PROPRIETES IONIQUES MATERIEL - 1 appareillage pour électrophorèse - 1 burette 2 mL (avec réservoir) - 2 béchers 150 mL hauts et étroits - 1 pH-mètre - 1 éprouvette de 20 mL

PRODUITS Monochlorhydrate d’His x H2O HCl 2 mol.L-1 NaOH 2 mol.L-1 (80 g.L-1) Solution de ninhydrine 1% dans acétone/acide acétique 96/4 v/v Mélange d'acides aminés pour l'électrophorèse Tampon véronal pH 8,8 : véronal sodé 9,3 g + HCl 2 mol.L-1 3 mL qsp 500 mL Solution étalon pH =7

Dans les manipulations qui suivent nous nous proposons : 1/ de réaliser une électrophorèse à partir d’un mélange d’acides aminés. 2/ de révéler vos résultats en utilisant la ninhydrine 3/ de réaliser la courbe de titration de l’histidine 4/ de manipuler des données scientifiques (calculs de volumes équivalents, de pH, méthode des tangentes...) Tout au long de ce TP vous allez développer des compétences scientifiques et techniques qu’il est nécessaire d’identifier pour les valoriser tout au long de votre cursus universitaire et dans votre vie professionnelle. 1. ELECTROPHORESE D'UN MELANGE D'ACIDES AMINES 1.1 Principe L'électrophorèse est une technique permettant la séparation de molécules chargées, en solution, sous l’effet d’un champ électrique. Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette, ainsi les anions (-) se déplacent vers l’anode (+) et les cations (+) vers la cathode (-). 1.2 Cas des acides aminés Les acides aminés présentent tous au moins deux groupements ionisables : acide carboxylique et amine, sur leur carbone α (certains possèdent un groupement ionisable supplémentaire dans leurs chaînes latérales R). En milieu très acide, toutes les fonctions ionisables sont protonées. La charge globale portée par la molécule est alors positive. En milieu très basique, toutes les fonctions ionisables sont déprotonées. La charge globale portée par la molécule est alors négative. pH#faible#(acide)

pH#fort#(basique)

R +

H3 N

CH COOH cation

R

R +

-

H 3 N CH COO α

H2 N

-

CH COO anion

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Chaque groupement ionisable a une valeur de pK, qui correspond au pH auquel il y a équilibre entre la forme protonée et la forme déprotonée, ainsi l’état d’ionisation de chaque groupement ionisable dépend du pH dans lequel il se trouve. Chaque acide aminé est caractérisé par son point isoélectrique, qui correspond à une valeur de pH à laquelle la charge globale portée par la molécule est nulle : c’est le pH isoélectrique. Ainsi :

- Si pH > pHi la charge globale portée par l'acide aminé sera négative. - Si pH < pHi la charge globale portée par l'acide aminé sera positive. - Si pH = pHi la charge globale portée par l'acide aminé sera nulle.

En conséquence, à un pH donné, si l'on applique un champ électrique, les acides aminés chargés positivement se déplaceront vers la cathode (pole -) et les acides aminés chargés négativement se déplaceront vers l'anode (pole +), selon leur charge globale. 1.3 Mode opératoire L’enseignant vous donnera un mélange de 3 acides aminés (Pro, Lys, Asp) pour que vous réalisiez leur séparation grâce à une électrophorèse. a) Prendre la bande de cellulose à l’aide d’une pince (IMPORTANT : l’utilisation de gants est obligatoire pour ne pas salir la membrane) b) A l’aide d’un crayon à papier, marquer une ligne de dépôt au milieu de la bande de cellulose, et indiquer le sens de migration en localisant les pôles + et -. c) A l’aide d’une pince, tremper la bande de cellulose dans le tampon véronal pH=8,8 et la déposer sur son support, puis caler la bande de cellulose (avec l’aide de l’enseignant). d) Prélever 8 µl du mélange d’acides aminés à l’aide de la P10 (l’enseignant fera une démonstration de la bonne utilisation d’une pipette automatique) et les déposer au milieu de la ligne de dépôt. e) Effectuer une électrophorèse sous 155 V pendant 20 minutes (5 mA). f) Libérer la bande de cellulose de son support et l’asperger de colorant ninhydrine sous la hotte (révélateur des acides aminés, l’enseignant fera un rappel sur le principe de ce colorant). Puis, sécher la membrane à l’aide d’un sèche-cheveux jusqu’à l’apparition des taches correspondant aux 3 acides aminés. 2 COURBE DE NEUTRALISATION DE L'HISTIDINE 2.1 Principe Le dosage pH-métrique d’un acide aminé permet de calculer sa concentration molaire en soluté apporté et de retrouver les valeurs de pKs caractéristiques de la solution titrée. L’étude des graphes pH=f(Vacide ou base) permet, en utilisant la méthode des tangentes, de repérer les points d’équivalence et d’en déduire les caractéristiques des solutions.

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2.2. Mode opératoire Vider la burette d’eau et la remplir avec HCl 2 mol.L-1, en faisant attention à ne pas laisser des bulles d’air. a) Peser environ 800 mg de monochlorhydrate d'His monohydraté, puis les dissoudre dans environ 27 mL d'eau distillée. b) Ajouter un excès de NaOH 2 mol.L-1 (environ 5,5 mL). c) Mettre sous agitation magnétique en s’assurant que le barreau aimanté ne touche pas l’électrode. Pour cela, le faire tourner vers le bord et non pas au centre du bécher puis régler la vitesse d’agitation avant de plonger l’électrode vers le bord opposé, la boule devant être totalement immergée (si vous avez des difficultés, solliciter l’enseignant). d) A l’aide de la burette, faire des ajouts successifs de 0,2 mL d’HCl 2 mol.L-1 et lire la valeur du pH après chaque ajout. Continuer jusqu’à addition d’un excès d’HCl (environ 9 mL).

N.B. On donne la formule et les pKa de His (1,8; 6; 9,2 ).

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NOMS/PRENOMS :

GROUPE :

DATE :

COMPTE-RENDU TP AA ACIDES AMINES – PROPIETES IONIQUES, REPONDRE AUX QUESTIONS SUIVANTES: Les questions avec un astérisque

* (1, 2, 3.1, 3.2) sont à préparer avant la séance de TP

*1. But(s) du TP :

*2. Principe(s) des manipulations (énumérer):

3. Résultats : - TITRATION DE L’HISTIDINE

*3.1 Ecrire les équilibres ioniques de l’histidine :

- ELECTROPHORESE D’UN MELANGE D’ACIDES AMINES.

*3.2 Expliquer le principe de la coloration à la ninhydrine. Pourquoi la Proline est d’une couleur différente des autres acides aminés ?

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Les questions avec # (3.5, 3.6, 3.7 et 3.8) seront notées pendant la séance de TP - TITRATION DE L’HISTIDINE 3.3 Indiquer la quantité d’histidine que vous avez réellement pesée : m = ……... mg 3.4 Quel est le nombre de moles d’His pesé ? (Détailler le calcul)

#3.5 Combien vaut 1 volume équivalent d’HCl (en mL) ? (Détailler le calcul)

#3.6 Calculer l’excès de soude (en mL) ? (Détailler le calcul)

#3.7 Tracer sur papier millimétré (donné par l’enseignant) la courbe de neutralisation de l’histidine, en respectant les échelles suivantes : ordonnée : 2 cm / unité de pH (vous pouvez commencer à pH 0,5 ou 1 plutôt que 0) et abscisse : 2 cm / mL. Indiquer clairement sur le graphique: - les points d’équivalence et de demi-équivalence - le pourcentage des formes ioniques de l’histidine en ces différents points - déterminer graphiquement le volume de HCl 2 mol.L-1 qui représente un équivalent - déterminer graphiquement la quantité de NaOH qui a été mise en excès - comparer les résultats obtenus par rapport aux données théoriques (valeurs de pKa, volumes)

« Méthode des tangentes parallèles », consiste à tracer deux tangentes parallèles de part et d'autre du saut de pH, puis de tracer une troisième droite équidistante et parallèle aux deux premières. La méthode des tangentes permet de déterminer les points d’équivalence, on pourra ensuite en déduire de manière graphique les points de démi-équivalence. 11

- ELECTROPHORESE D’UN MELANGE D’ACIDES AMINES. #3.8 Coller l’électrophorégramme ici et le légender. Indiquer clairement: la ligne de dépôt et les pôles, le nom des acides aminés séparés. Indiquer la charge et le sens de migration de chaque acide aminé analysé (astuce : comparer le pH du tampon d’électrophorèse et le pHi de chaque acide aminé)

4. Conclusion (résumé TP, résultats principaux, schéma, critique constructive, autres techniques)

5. Compétences développées : Compétences scientifiques : Manipuler avec précision et en respectant les règles de sécurité du laboratoire. Manipuler des données chiffrées (réaliser des calculs de volume équivalent, de dilution, de pH…) Réaliser une électrophorèse (Acides aminés, ADN, protéines) Réaliser une courbe de titrage et l’exploiter Rédiger un compte rendu scientifique Suivre un protocole expérimental

Compétences transversales : Coopérer pour arriver à des objectifs Evaluer la pertinence de l'information trouvée, l'ordonner, la hiérarchiser, la synthétiser Gérer son temps, planifier, anticiper Identifier les sources d'erreurs Identifier, définir, hiérarchiser les activités à accomplir Savoir travailler en équipe

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TP ADN EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE MATERIEL - tubes de 50 mL, 15 mL et 5 mL - cuves spectromètre (UV) - mortier + pilon - spatule/cuillère - 1 entonnoir - papier filtre - pipettes Pasteur - petite poire

PRODUITS - Tampon d’extraction Tris-EDTA (TE 10X): 100 mmol.L-1 Tris-HCl, 10 mmol.L-1 EDTA, pH=8 - SDS 10% (sodium dodécyl sulfate) - NaCl 5 mol.L-1 - Ethanol absolu (95°) placé au congélateur - Solution de rinçage : Ethanol à 70% - TAE 10X (400 mmol.L-1, Tris-Acétate, 10 mmol.L-1 EDTA, pH=8)

1. INTRODUCTION : Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Ils jouent un rôle important dans le support et le transfert de l’information génétique. Ce sont des macromolécules pouvant atteindre une taille très élevée, ex : l’ADN de la bactérie Escherichia coli a un PM = 2x109 Daltons et dépasserait le millimètre s’il n’était pas compacté, alors que la cellule qui le contient n’a que 1 à 2 µm de diamètre. Excepté dans les globules rouges des mammifères, qui sont dépourvus de noyau, toutes les cellules d’un être vivant contiennent de l’ADN.

Dans les manipulations qui suivent nous proposons : 1/ d’extraire l’ADN à partir d’un tissu biologique, 2/ d’étudier une des propriétés physicochimiques : l’absorption dans l’ultra-violet, 3/ d’utiliser ces propriétés physicochimiques pour quantifier l’ADN contenu dans l’échantillon biologique, 4/ de manipuler des données scientifiques (calculs de dilutions et de concentrations, travail sur les unités, loi de Beer Lambert...)

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Tout au long de ce TP vous allez développer des compétences scientifiques et techniques qu’il est nécessaire d’identifier pour les valoriser tout au long de votre cursus universitaire et dans votre vie professionnelle. 2. MODE OPERATOIRE 2.1 Préparation de l’ADN a) Homogénéisation du tissu - A partir de la solution stock (TE 10X) concentrée fournie, préparer 50 mL de tampon TE 1X dans un tube Falcon de 50 mL. Réservez. - Peser le morceau de banane fourni et noter la masse. - Ecraser la banane dans le mortier en porcelaine avec une spatule/cuillère jusqu’à obtenir une purée homogène. - Ajouter 15 ml du tampon TE 1X et homogénéiser. - Transvaser l’homogénat de banane à un tube de 50 mL et centrifuger 5 minutes à 2000 tours par minute. b) Lyse des cellules - Filtrer le surnageant obtenu sur un papier filtre à l’aide d’un entonnoir dans un tube Falcon de 50 mL. Recueillir environ 10 - 15 mL (V1). Compléter si besoin avec de TE 1X. - Ajouter du SDS (10%) pour obtenir une concentration finale de 1% et agiter au vortex 1 minute. - Ajouter un volume de NaCl 5M égal à 1/2 V1. - Agiter fortement au vortex pendant 2 minutes. c) récupération de l’ADN - Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 3000 tours par minute. - Récupérer le surnageant dans un tube de 50 mL propre avec une pipette Pasteur et une petite poire, noter le volume (V2). - Ajouter lentement, le long des parois du tube, 2 volumes V2 d’éthanol froid (congélateur). - Après 1 ou 2 minutes une « méduse » d’ADN se forme à l’interface tampon/éthanol. Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer : 1) Un tube à essai contenant 3 à 4 mL d’éthanol 70%. 2) Préparer 10 mL de tampon TAE 1X (ATTENTION !!!) dans l’éprouvette graduée à partir du stock TAE 10X, et transvaser dans un tube Falcon de 15 mL. 3) Mettre 3 mL du TAE 1X dans un autre tube Falcon de 15 mL. - Récupérer l’ADN en l’enroulant autour d’une pipette Pasteur propre et le placer dans le tube à essai contenant l’éthanol à 70%. - Rincer l’ADN dans de l’éthanol 70% pendant 30 sec. - Placer la pelote d’ADN dans le tube Falcon de 15 mL contenant 3 ml de TAE 1X et vortexer pendant 1 minute. 2.2 Dosage - Diluer 600 µL de solution d’ADN que vous venez de préparer dans 2,4 mL de TE 1X (solution utilisée pour écraser la banane) dans le tube à essai restant. Vortexer. - Mesurer l’absorbance de cette solution dans une cuve adaptée à 260 nm et à 280 nm (penser faire le 0 avec de l’eau distillé, et à faire le blanc de l’essai avec le tampon TE 1X). Utiliser tout le temps la même cuve pour tous les dosages. Pour des solutions d’ADN pures, le rapport d’absorbance 260/280 est compris entre 1,8 et 2. Si ce rapport est inférieur à 1,8 l’extrait d’ADN est contaminé par des protéines. Si en revanche le rapport est supérieur à 2, l’extrait d’ADN est contaminé par de l’ARN. A 260 nm, le coefficient d’extinction spécifique (E...