Fragenkatalog Genetik 1 PDF

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Ausgefüllter Fragenkatalog für Genetik 1 aus der Vertiefung Genetik
5. Semester, Preiss...

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Fragenkatalog BSc Modul GI 2401-210 Allgemeine Genetik 1. Molekulare Mechanismen der Replikation 1) Was braucht es für die DNA Synthese? - DNA-Matrize 3‘ → 5‘ - dNTPs - Primer - DNA-abhängige DNA-Polymerase 2) Wozu dient die 3’->5’ und wozu die 5’->3’ Exonukleaseaktivität von Pol I? 3‘ → 5‘: Proofreading; Reparatur 5‘ → 3‘: Entfernen der Primer 3) Was verstehen Sie unter ‚Klenow-Fragment’? = große Untereinheit der DNA-Polymerase I » besitzt 3‘ → 5‘ Exonukleaseaktivität zum Proofreading 4) Sie amplifizieren ein 3kb großes DNA Fragment mit Taq-Polymerase. In wievielen der neuen Moleküle erwarten Sie mindestens einen Fehler bei 30 Zyklen? Wieso kann die Fehlerrate sehr viel höher sein? 3000 × 10−5 × 230 = 32212254,72 Moleküle mit Fehlern Die Fehlerrate kann höher sein, weil die Taq-Polymerase keine 3‘→5‘-Exonukleaseaktivität und damit kein Proofreading hat. 5) Was verstehen Sie unter ‚konditional letalen’ Mutanten? Wozu werden sie eingesetzt? = Mutanten, die unter permissiven Bedingungen wachsen, bei restriktiven Bedingungen aber sterben. Z.B. Bakterien, die temperatursensitiv sind und bei 37°C wachsen (permissiv), bei 42°C jedoch letal sind (restriktiv). Sie werden eingesetzt, um z.B. die molekulare Struktur & Funktion der DNA-Polymerase bei der Replikation zu untersuchen. Zell-letale Mutanten würden sich ja nicht untersuchen lassen, da sie sich nicht teilen können. Durch konditional letale Mutanten kann man Zelllinien bekommen und untersuchen. 6) Welche Komponenten werden zur Replikation benötigt, und welche Rolle spielen sie? - Topoisomerasen z.B. Gyrase (Verhindern von Torsionsspannung) - Helicase (Aufwinden des Doppelstrangs) - single strand binding proteins SSB (bedecken Einzelstrang, damit er nicht wieder hybridisiert) - Polymerase III (synthetisiert Leit- und Folgestrang) - Primase (lagert RNA-Primer als Ansatzpunkt für Pol III an) - Pol I (entfernt Primer und füllt Lücken) - DNA-Ligase (verbindet Okazaki-Fragmente) 7) Beschreiben Sie die Vorgänge der Replikationsinitiation am OriC. OriC = Origin of Replication bei E.coli Zunächst wird die DNA am Replikationsursprung geöffnet und von der Helicase entwunden (durch Auftrennen der Wasserstoffbrückenbindungen). Dadurch entsteht die sogenannte Replikationsgabel und SSB-Proteine bedecken den Einzelstrang. Durch die Entwindung der DNA kommt es zu einer verstärkten Verdrillung des gesamten DNA-Doppelstranges. Um dieser Torsionsspannung entgegenzuwirken, läuft die Topoisomerase vor der Replikationsgabel und nimmt so die Spannung aus der dsDNA. Im Anschluss erfolgt das Priming. Die Primase setzt ein Franziska Brändle

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kurzes RNA-Stück, den Primer als Starthilfe für die Replikation, da diese nur an einer freien 3´OH-Gruppe beginnen kann. Die DNA-Polymerase kann nun mit der Anlagerung der Nucleotide beginnen. 8) Wie kann die gleichzeitige Synthese von Leit- und Folgestrang erfolgen? Die DNA-Polymerase III ist ein großer multimerer Proteinkomplex, der unter anderem 𝜏-Proteine zur Dimerisierung enthält, sodass Leit- und Folgestrang gleichzeitig repliziert werden können. Dabei wird der Leitstrang kontinuierlich in 3‘ → 5‘-Richtung abgelesen (Synthese 5‘ → 3‘) und repliziert. Eine 𝛽-Klammer umschließt diesen Strang dauerhaft, um die Polymerase an der Matrize zu halten. Am Folgestrang muss die DNA „rückwärts“ synthetisiert werden, da dieser in der gegenläufigen Orientierung vorliegt. Dazu bildet sich eine Schleife und es werden einzelne Abschnitte repliziert (Okazaki-Fragmente), wobei für jedes Fragment eine neue 𝛽-Klammer auf den Folgestrang geladen wird. So können beide Stränge gleichzeitig synthetisiert werden. 9) Wie werden die Chromosomen vor dem Replikationsverlust geschützt? Durch ihre Endstücke (Telomere), die bei der Replikation kürzer werden. Diese Verkürzung wird verhindert, indem ein Enzym namens Telomerase die Enden der Chromosomen verlängert. Die Telomerase besteht aus einer reversen Transkriptase (TERT) und einer RNA (TERC). Die RNA ist komplementär zum 3‘-Überhang am Chromosomenende, der durch die Replikation entsteht, und dient der reversen Transkriptase als Primer zur Verlängerung des Überhangs. An dieser Verlängerung kann ein Primer angebracht und das fehlende Stück durch die DNA-Pol III synthetisiert werden. Telomere werden auch geschützt, indem sich das freie 3‘-Ende in den DNA-Doppelstrang drängt. Die so einstehenden Loops werden von diversen Proteinen stabilisiert und bilden eine Art Schutzkappe vor Nukleaseattacken am einzelsträngigen 3‘-Überhang. 10) Was verstehen Sie unter Hayflick limit? Säugerzellen haben nur eine limitierte Teilungsfähigkeit. Die Obergrenze der möglichen Teilungen wird als Hayflick limit bezeichnet. So kann sich eine Mäusezelle z.B. 12 mal teilen, eine menschliche Zelle sogar 30 – 40 mal, bevor sie in die Seneszenz übergeht und schließlich abstirbt. Die Teilungsfähigkeit wird durch die Telomeraseaktivität der entsprechenden Zelle begrenzt. Wenn die Telomere eine kritische Länge unterschreiten, wird das Protein p53 (ein Wächter des Zellzyklus) aktiviert, der alle weiteren Zellteilungen hemmt. Die Zelle hat das Hayflick limit erreicht. HA 1) Wie wir gesehen haben, erlauben konditionale Mutanten die genetische Analyse zellletaler Funktionen in Einzellern wie z.B. der Hefe. Überlegen Sie, welche Funktionen Sie mit konditionalen Mutanten in Vielzellern wie z.B. Drosophila untersuchen könnten. Wie würden Sie vorgehen? Vorsicht! Es geht nicht darum, wie man die Mutante erzeugt, sondern wie man mit der Mutante umgeht! Bei konditionalen Mutanten geht man davon aus, dass das Protein selbst wegen Mutation temperatursensitiv ist. Man kennt sich noch nicht gut genug mit Proteinen aus, um solche Mutationen gezielt einzuführen! Vorgehensweise: ts-Shift-Experimente um die phänokritische Phase eines Gens zu untersuchen. » brauche ich ein embryonal wichtiges Gen später auch noch? » wie lange brauche ich die Genwirkung?

Franziska Brändle

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2. Rekombination und Mosaikanalyse 1) Wann und wo findet Rekombination statt? Oder anders gefragt: was ist die Voraussetzung für eine Rekombination? Rekombination neben der Meiose auch in der Mitose stattfinden. Die Voraussetzung für Rekombination ist eine Anlagerung der Homologen und das Aufbrechen des DNA-Doppelstrangs einer der Homologen, sodass Crossing-over stattfinden kann. 2) Wie kann man erklären, dass Rekombination basengenau und verlustfrei stattfindet? Durch das ds-Bruch-Modell. In einem der Homologen findet ein Doppelstrangbruch statt, an der Bruchstelle wird durch eine Exonuklease verdaut (5‘-3‘-ss-Abbau), wodurch eine Lücke mit 2-ssEnden entsteht. Diese freien 3‘-Enden dringen in das homologe Chromosom ein und es kommt zum basengenauen Strangaustausch ohne Verluste. Die beiden Einzelstränge werden im Homologen jeweils aufgefüllt und es kommt zur Genkonversation. 3) Erklären Sie den Unterschied zwischen Einzelstrangbruch- und Doppelstrangbruch-Modell Einzelstrangbruch-Modell: in beiden Homologen bricht der Einzelstrang an derselben Stelle, die Einzelstränge lagern sich in das Homolog ein und bilden einen Heteroduplex, dann Neusynthese. Doppelstrangbruch-Modell: nur in einem Homolog findet ein Bruch statt, hier dafür ein Doppelstrangbruch. An der Bruchstelle wird verdaut, sodass einzelsträngige Stücke entstehen, die sich in das Homolog einlagern können, indem sie den dortigen Strang verdrängen. 4) Wie kann man die Gültigkeit des Doppelstrangbruchmodells nachweisen? Wenn man einer Zelle Enzyme zugibt, die Doppelstrangbrüche einleiten (z.B. Spo11), kommt es vermehrt zur Rekombination. 5) Welche Methoden gibt es um ein Gen seinem Genort (Lokus) bzw. der Kopplungsgruppe (Chromosom) zuzuordnen? Genkartierung durch die Rekombinationsfrequenz » in alten Aufschrieben nachschauen!!!! 6) Welche Faktoren beeinflussen die Rekombinationsfrequenz? - Abstand der 22 Genorte auf dem Chromosom - Aktivität von DSB-einführenden Enzymen? 7) Wie viele Nachkommen müssen Sie untersuchen, um ein Rekombinationsereignis zwischen zwei Genen zu finden, die 100 kb voneinander entfernt sind in a) M. musculus, b) D. melanogaster, c) E. coli? Rekombination in E. coli??? 8) Wodurch wird mitotische Rekombination ausgelöst? Nennen Sie mögliche Ursachen! Durch das Enzym Spo11 oder durch ionisierende Strahlung IR 9) Was wissen Sie zur FLP-Rekombinase (Flipase)? Das FLP/FRT-System kommt aus der Hefe. Es erlaubt das gerichtete Ausschneiden von Gensequenzen, die von FRT-Stellen flankiert sind (diese kann man vor das gewollte Gen klonieren!) und wird verwendet, um mitotische Rekombinationen (also Zellklone unterschiedlichen Genotyps) zu erzeugen. Durch die Flipase kann man ein Gen entweder inaktivieren (indem man es ausschneidet oder den Promotor entfernt o.ä.) oder aktivieren (indem man einen Inhibitor ausschneidet). Die Flipase kann durch einen Hitzeschock-Promotor kurzfristig und gezielt aktiviert werden, sodass man z.B. homozygot mutante Zellklone erzeugen kann.

Franziska Brändle

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10) Welche Fragestellungen lassen sich mit klonaler Analyse angehen? Z.B.: relative Klongröße, Phänotyp (zellautonom?), früh letale Mutationen (Wirkung in späteren Stadien?), Zellkompetition, Zellautonomie (Reichweite?)

3. Transkription 1) Wie ist der Ablauf der Transkription? 1. Transkriptionsinitiation durch Transkriptionsfaktoren » positionieren die Pol II an der DNA / am Promotor des entsprechenden Gens 2. Elongation » Transkription des Genabschnitts, Erzeugung einer hnRNA 3. Termination durch Terminationsfaktoren oder RNA-Konformation 2) Promotoraufbau in E.coli vs. Eukarya! E. coli: hochkonservierter Promotor mit Konsensussequenz, bestehend aus der -35 Region/Box (TTGACA), der -10 Region mit der Pribnow-Box (TATAAT) und schließlich dem Start bei +1 (über 90% der Fälle ein Purin, oft CAT). Eukaryoten: Promotorregion aus Basalpromotor und Minimalpromotor (oft auch mit Silenceroder Enhancer-Sequenzen vom Gen entfernt). Es gibt TATA- und TATA-lose-Promotoren. TATAlose-Promotoren besitzen statt einer TATA-Box oft eine DPE-Box stromab. 3) Was verstehen Sie unter einer Konsensussequenz? Eine Konsensussequenz ist ein Durchschnitt einer Sequenz, der meistens, aber nie 100% identisch auftaucht. Bei Konsensussequenzen im Promotor gilt z.B. je ähnlicher die tatsächliche Sequenz dem Konsensus ist, desto stärker ist der Promotor. So können Promotorstärken reguliert werden. 4) Der Phage T7 erkennt eine spezifische Promotorsequenz von 20bp. Welchen Vorteil bietet dies dem Phagen und welchen dem Molekularbiologen? Der Vorteil für den Phagen ist, dass nur die eigenen Gene transkribiert werden, weil die Wirtspromotoren von dem Phagen nicht erkannt werden. Der Vorteil für Molekularbiologen ist, dass sie die Enzyme für in vitro Transkription verwenden können, indem sie vor das Gen den entsprechenden Promotor klonieren. 5) Sie sollen die Expression eines Gens X in D. melanogaster nachweisen. Wie gehen Sie vor? Man kann direkt die RNA, die aus dem Gen entsteht, nachweisen. Dazu führt man eine in-situHybridisierung durch, d.h. man bringt eine zur mRNA komplementäre und markierte Sonde in den Organismus ein und kann dann über die Markierung (z.B. Digoxigenin) die Genexpression im Gewebe nachweisen. Oder: Nachweis des entstehenden Proteins in situ oder per Western BLot Oder: Nachweis durch ein Reportergen 6) Welchen Vorteil bietet Ihnen der ‚Bandshift’ (EMSA) gegenüber dem ‚Footprint’ und umgekehrt? Bei einem Bandshift kann man ein DNA-Bindeprotein aufreinigen bzw. isolieren. DNA, die ein Protein gebunden hat, läuft langsamer als „nackte“ DNA, d.h. man kann die Bande mit dem Protein selektionieren. Dadurch kann man aber nur nachweisen, dass das Protein an die DNA bindet, aber nicht wo. Beim Footprint wird nach Mischung der DNA mit dem Protein (wie oben) ein DNAse-Verdau durchgeführt. Hierbei wird gebundene DNA durch das Protein geschützt, während „nackte“ DNA in Fragmente aufgeteilt wird. Bei einem Footprint weiß man dann, an welchen Stellen das Protein sitzen könnte, kann es aber nicht isolieren weil man nicht weiß, Franziska Brändle

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welches von den vielen Fragmenten jetzt ein Protein gebunden hat und welches nicht. Dafür sind weitere analytische Experimente nötig. 7) Unterscheiden Sie Enhancer von Promotor. Promotoren sind Sequenzen, die notwendig sind, um die Transkription zu starten. An ihnen bindet der Transkriptionsinitiationskomplex mit der Polymerase. Enhancer sind Sequenzen, die die Transkriptionsrate und die zeit-/raumspezifische Aktivität eines Gens erhöhen, indem sie Faktoren binden, die durch Schleifenbildung den Transkriptionsinitiationskomplex am Promotor stabilisieren und so die Transkription erleichtern. 8) TFIIA und TFIIB knicken die DNA – wozu? Die Biegung der DNA dient dem Aufschmelzen. 9) TFIIH spielt eine wesentliche Rolle bei der Transkriptionsrate! Inwiefern? TF II H gewährleistet die Promotor-Clearance. Neben seiner Helicase-Aktivität besitzt er eine Kinase-Aktivität, mit der er die C-terminale Domäne (CTD) der Pol II phosphoryliert. Durch die Phosphorylierung „entkommt“ die Pol II dem Promotor und die Elongation beginnt. Der Initiationskomplex zerfällt und kann mit einer neuen Polymerase am Promotor neu aufgebaut werden. D.h. mit wenig TF II H würde der Promotor nur sehr langsam frei geräumt werden und die Transkriptionsrate wäre entsprechend niedriger. 10) Vergleichen Sie die Transkriptionstermination in Eu- und Prokarya. Prokaryoten: es wird entweder in der entstehenden mRNA eine Haarnadel gebildet (intrinsischer Terminator), auf die eine poly-U-Serie folgt, die durch die schwache Bindung zum Ablösen der mRNA führt, oder es wird Rho-abhängig terminiert, d.h. der Terminationsfaktor Rho bindet an Creiche Sequenzen auf der DNA und läuft von dort aus unter ATP-Verbrauch bis zur RNAPolymerase, um diese von der Matrize zu lösen. Eukaryoten: die Pol II liest über ein p(A)-Signal, was zu AAUAAA in der mRNA führt. CPSF bindet das p(A)Signal in der RNA, die Endonuklease spaltet ca. 30 Nukleotide stromab. Die Poly(A)Polymerase PAP bindet, CPSF dissoziiert. PAP synthetisiert einen Poly(A)-Schwanz an die mRNA. Die Exonuklease Xrn2 degradiert die naszierende RNA, löst sie von der Pol II und diese von der Matrize. (Torpedo-Modell) HA 3) Sie haben einen Northernblot mit einer Sonde hybridisiert. Es zeigen sich drei Signale, die auf drei unterschiedlich lange mRNAs hinweisen! Erklären Sie das Zustandekommen unterschiedlich langer Transkripte von einem Gen. Es gibt 3 Erklärungsmöglichkeiten! 1. Durch alternatives Spleißen, bei dem unterschiedliche Transkripte entstehen, die aber alle noch gut genug mit der Sonde hybridisieren 2. Man kann in einem Gen unterschiedliche Poly(A)-Stellen haben, sodass die Transkription an unterschiedlichen Stellen beendet werden kann → es ändert sich nur die Länge des untranslatierten Endes (3’UTR) 3. Man kann unterschiedliche Promotoren haben, die z.B. in unterschiedlichen Stadien genutzt werden (einer in der Larve, einer im Imago usw.). → es kann Promotor 1 – Exon 1 – Promotor 2 – Exon 2 … sein, sodass die entstehenden kodierenden Sequenzen unterschiedlich sind → es kann aber auch sein, dass zwischen den Promotoren kein Exon ist und so nur der Vorspann (5’UTR) länger ist, dann wäre das Protein gleich » Unterschiedliche 3‘-Bereiche verändern die Translation, unterschiedliche 5‘-Bereiche können das Protein verändern.

Franziska Brändle

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4. Transkriptionsregulation 1) Unterscheiden Sie ‚Upstream’- von ‚Basal’faktoren. Nennen Sie Beispiele! Upstream-Faktoren: allgemeine Genaktivatoren, ubiquitär » Position vorgegeben, Abstand und Orientierung variabel » steigern die Effizienz der Initiation, je mehr Bindestellen desto besser Bsp.: NF1, Sp1, Oct1 Basalfaktoren: notwendig für Bildung des Initiationskomplexes » Position, Abstand und Orientierung vorgegeben Bsp.: TF II B 2) Wie können Sie eine ‚heterologe Wirkung’ nachweisen? Indem man das „Objekt“ (z.B. Protein), dem man die heterologe Wirkung zuschreibt, in andere Zellen oder Spezies einbringt und schaut, ob die Wirkung immer noch eintritt. Man kann z.B. Upstream-Faktoren von menschlichen Genen in Drosophila einbringen und beobachten, dass auch hier die Genexpression verstärkt wird. Die Faktoren sind also hochkonserviert. Durch swap-Experimente lässt sich z.B. die heterologe Wirkung von Aktivatordomänen von Genregulatoren nachweisen. 3) Ist ein Minimalpromotor orientierungsabhängig? Warum? Vergleichen Sie mit einem Basalpromotor! Der Minimalpromotor ist orientierungsunabhängig. Er hat eine Art „Magnetfunktion“ für Faktoren, die die Transkriptionsaktivität erhöhen. Dabei ist es egal, in welcher Orientierung der Minimalpromotor vorliegt, da die bindenden Faktoren auf den Transkriptionsinitiationskomplex wirken. Der Basalpromotor ist die „Plattform“ für den Transkriptionsinitiationskomplex. Er ist stark orientierungsabhängig und kann nicht umgekehrt werden, da die Polymerase sonst in die falsche Richtung läuft. 4) Was sind Reaktionselemente (RE)? Worauf reagieren diese z.B.? Wieso ist es für den Molekularbiologen nützlich, REs zu kennen? Reaktionselemente befinden sich in induzierbaren Genen. Sie reagieren auf Umwelteinflüsse wie z.B. Hitzeschocks, Schwermetalle o.ä., aber auch auf zeitlich/räumlich spezifisch erzeugte Faktoren. REs können auch in Enhancern auftauchen. Durch die Kombination unterschiedlicher REs und Upstream-Faktoren wird die Genaktivierung kontextabhängig. Molekularbiologen können durch einklonieren von REs bestimmte Gene zu bestimmten Zeitpunkten an- oder ausschalten. Oft wird hier das Hitzeschockelement (HSE) verwendet. 5) Wie wirken Genaktivatoren? Und Genrepressoren? Genaktivatoren stabilisieren z.B. den Transkriptionsinitiationskomplex am Promotor. Genrepressoren können den Komplex destabilisieren, den Promotor blockieren usw. Allgemein kann man sagen, dass Aktivatoren und Repressoren zeitlich/räumlich exprimiert bzw. aktiviert werden und auf den Basalkomplex, andere Genregulatoren, die Chromatinstruktur oder kombinatorisch wirken können. 6) Wieso kommt ein Organismus mit einigen Dutzenden Genregulatoren aus, obwohl viele tausende Gene reguliert werden müssen? Weil jedes Gen durch eine bestimmte Kombination von Genregulatoren reguliert wird. Nach dem „Telefonnummermodell“ kann durch Kombinatorik jedes Gen „individuell“ reguliert werden. Kein Regulator wirkt alleine, sondern ist immer in Kombination mit anderen wirksam. Da spezifische Regulatoren raum-/zeitspezifisch exprimiert werden, haben unterschiedliche Zellen eine unterschiedliche Ausstattung an Genregulatoren. Franziska Brändle

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7) Wieso braucht es nur sehr wenige allgemeine Koaktivatoren und Korepressoren in der Zelle? Nennen Sie Beispiele für Koaktivatoren und Korepressoren! Weil Ko-Aktivatoren und –Repressoren mit vielen Transkriptionsfaktoren zusammen wirken (d.h. an viele verschiedene binden) können. Die Spezifität wird durch die DNA-Bindedomäne des TFs gegeben. Bsp.: CBP / p300 oder Gal4/Groucho 8) Welchen Vorteil bringt die Dimerisierung von Transkriptionsregulatoren? Heterodimere erlangen unterschiedliche Spezifität durch den Bindungspartner (Kombinatorik). D.h. man braucht eine geringere Anzahl an Proteinen, um eine hohe Anzahl an Effektoren zu erzeugen. 9) Was ist der Unterschied zwischen Chromatinremodelling und Chromatinaktivierung? Chromatinremodelling: Verschiebung von Nukleosomen durch ATP-abhängige CRM-Komplexe und Modifizierung von Histonen in den Nukleosomen (Histon-Code, dadurch ändert sich die Beweglichkeit). Chromatinaktivierung: Modifikation von Histonen durch De-/Acetylierung (Teil des Remodellings) 10) Nennen Sie Beispiele für aktivierende bzw. für inhibierende Histonmodifikation! Aktivierend: - Histon-Acetylierung durch HAT (Histon-Acetyltransferase) - selten: Methylierung » Lysin-Acetylierung oder Methylierung » Arginin-Methylierung Inhibierend: - Histon-Deacetylierung durch HDAC (Histon-Deacetylase) » Lysin-Methylierung HA 4) Sie haben ein ‚Swap-Experiment’ durchgeführt und die DNA-Bindedomäne des FliegenGenrepressors Krüppel (Kr-DB) mit der des VP16-Aktivators von H. simplex (VP16-BD) ersetzt. Wie muss ein Reportergen aussehen, damit es auf dieses Fusionsprotein reagiert? Erwarten Sie Genaktivierung oder Repression...