Histologia Ross 7 edicion PDF

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1 Técnicas GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS MICROSCOPÍA / 12 UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA / 1 Microscopía óptica / 12 PREPARACIÓN DEL TEJIDO / 2 Examen de un preparado histológico en el Tinción con hemaxotilina y eosina con fijación microscopio óptico / 13 en formalina / 2 Otros sistemas ópticos / 16 Otros...

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Técnicas GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA / 1 PREPARACIÓN DEL TEJIDO / 2

Tinción con hemaxotilina y eosina con fijación en formalina / 2 Otros fijadores / 2 Otras técnicas de tinción / 3

HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA / 3

Composición química de las muestras histológicas / 3 Fundamentos químicos de la tinción / 5 Digestión enzimática / 7 Histoquímica enzimática / 7 Inmunocitoquímica / 8 Técnicas de hibridación / 10 Autorradiografía / 12

GE N E R A L I D A D E S D E L A S T É CN I C A S U T I L I Z A D A S EN HI STO L O G Í A El objetivo de un curso de histología es conducir al estudiante a comprender la microanatomía de las células, tejidos y órganos y a correlacionar la estructura con la función. Histología [Gr., ἱστός, histos = tejidos; λογíα, logía = ciencia], también llamada anatomía microscópica, es el estudio cientí-

fico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del cuerpo. La histología moderna no es sólo una ciencia descriptiva sino que también incluye muchos aspectos de la biología molecular y celular, que ayudan a describir la organización y función celular. Las técnicas utilizadas por los histólogos son diversas en extremo. La mayor parte de los contenidos de un curso de histología se puede formular en términos de la microscopia óptica. En la actualidad, los estudiantes en los laboratorios de histología utilizan ya sea microscopios ópticos o, con mayor frecuencia, microscopía virtual, que representa métodos para examinar muestras microscópicas en la pantalla de un ordenador o dispositivo móvil. Anteriormente, se realizaba una interpretación más detallada de la microanatomía con

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MICROSCOPÍA / 12

Microscopía óptica / 12 Examen de un preparado histológico en el microscopio óptico / 13 Otros sistemas ópticos / 16 Microscopía electrónica / 18 Microscopía de fuerza atómica / 21 Microscopía virtual / 22 Cuadro 1-1 Correlación clínica: biopsias por congelación / 4 Cuadro 1-2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometría de Feulgen / 7 Cuadro 1-3 Correlación clínica: anticuerpos monoclonales en medicina / 9 Cuadro 1-4 Consideraciones funcionales: uso correcto del microscopio óptico / 15

HISTOLOGÍA 101. Puntos esenciales / 23

un microscopio electrónico (ME) – tanto con el microscopio electrónico de transmisión (MET) como con el microscopio electrónico de barrido (MEB). Hoy, el microscopio de fuerza atómica (MFA) también puede proporcionar imágenes de alta resolución que son comparables o incluso mejores que las obtenidas a través del MET. Tanto el ME como el MFA, debido a su mayor resolución y más útil aumento, suelen ser el último paso en la adquisición de datos a partir de muchas técnicas auxiliares de la biología celular y molecular. Estas técnicas auxiliares incluyen:

• histoquímica y citoquímica, • inmunoquímica y técnicas de hibridación, • autorradiografía, • cultivo de tejido y órganos, • separación de células y orgánulos por centrifugación diferencial, • microscopios y técnicas microscópicas especializadas. Es posible que los estudiantes se sientan distantes de estas técnicas y procedimientos experimentales debido a que no suele estar contemplada una experiencia directa con ellos en los programas actuales de la asignatura. Sin embargo, es im-

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CAPÍTULO 1 

Técnicas    P R E PA R A C I Ó N D E L T E J I D O

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portante saber algo acerca de los procedimientos y los datos que proveen. Este capítulo proporciona un estudio de técnicas y una explicación de cómo los datos aportados por éstas pueden ayudar al estudiante a comprender mejor la función de las células, tejidos y órganos. Un problema que enfrentan los estudiantes de histología es comprender la índole de la imagen bidimensional de un preparado histológico de una micrografía electrónica y cómo la imagen se relaciona con la estructura tridimensional de la cual proviene. Para salvar esta brecha conceptual, primero debemos presentar una descripción de las técnicas mediante las cuales se producen los preparados y las muestras de la microscopia electrónica.

PRE PA R A C I Ó N D E L T E J ID O Tinción con hematoxilina y eosina con fijación en formalina El corte de rutina teñido con hematoxilina y eosina es la muestra que se utiliza con mayor frecuencia.

El grupo de preparados que se entrega a cada estudiante junto con el microscopio óptico contiene por lo general muestras fijadas en formalina, incluidas en parafina y coloreadas con hematoxilina y eosina (H&E). Cas todas las fotomicrografías ópticas en las secciones del atlas de esta obra son de preparados de estos mismos grupos. Además, la mayor parte de las fotomicrografías utilizadas para ilustrar tejidos y órganos en la cátedra de histología y en conferencias se obtienen de estos preparados. A veces se utilizan otras técnicas de tinción para mostrar componentes específicos de las células y los tejidos; varias de estas técnicas se describen más adelante. El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la fijación para conservar la estructura. La fijación, obtenida en general mediante una sustancia química o una mezcla de sustancias químicas, conserva de forma permanente la estructura del tejido para tratamientos posteriores. Las muestras deben sumergirse en el fijador inmediatamente después de extraerse del organismo. La fijación se utiliza para:

• abolir el metabolismo celular, • impedir la degradación enzimática de las células y tejidos por la autólisis (autodigestión), • destruir microorganismos patógenos tales como bacterias, hongos o virus y • endurecer el tejido como resultado de la formación de

enlaces cruzados o de la desnaturalización de moléculas proteicas.

El fijador de uso más común es la formalina, una solución acuosa de formaldehído al 37 %, en diluciones variadas y en combinación con otras sustancias químicas y amortiguadores (buffers). El formaldehído conserva la estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las proteínas (con frecuencia los enlaces cruzados de residuos de lisina). Debido a que el formaldehído no altera su estructura tridimensional de forma significativa, las proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos. Esta propiedad es importante en

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TA B LA 1-1 Equivalencias en las medidas de longitud 1 picómetro (pm)

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0,01 angstroms (A)

1 angstrom

5

0,1 nanómetro (nm)

10 angstrom

5

1,0 nanómetro

1 nanómetro

5

1 000 picómetros

1 000 nanómetros

5

1,0 micrómetro (mm)

1 000 micrómetros

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1,0 milímetro (mm)

las técnicas de inmunocitoquímica (v. pág. 8). La solución comercial estándar de formaldehído amortiguado con fosfatos (pH 7) actúa con lentitud pero penetra bien en el tejido. Sin embargo, dado que no reacciona con los lípidos, es un mal fijador de las membranas celulares. En el segundo paso, la muestra se dispone para su inclusión en parafina con el fin de permitir su corte.

Para examinar una muestra se requiere de su infiltración con un medio de inclusión que permita realizar corte muy delgados, por lo general en el rango de 5 mm a 15 mm (1 micrón [mm] equivale a una milésima parte de un milímetro [mm]; v. tabla 1-1). Después de la fijación la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar alcohol al 100 %. En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales como el xileno o tolueno que son miscibles tanto en alcohol como en parafinas, para extraer el alcohol antes de la infiltración de la muestra con la parafina fundida. Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se empareja para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque se coloca en una máquina cortadora especial, el micrótomo que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje (pineno o resinas de acrílico) como adhesivo. En el tercer paso, la muestra se tiñe para permitir su examen.

Debido a que los cortes en parafina son incoloros, la muestra todavía no está lista para su examen bajo el microscopio óptico. Para colorear o teñir los cortes histológicos, la parafina debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones de alcohol de concentración decreciente. Después, el tejido sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua. Debido a que el colorante de contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra a través de una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con eosina en alcohol. En la figura 1-1 se muestran los resultados de la tinción con hematoxilina sola, con eosina sola y con ambos colorantes. Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para obtener un preparado permanente.

Otros fijadores La formalina no preserva todos los componentes de las células y los tejidos.

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CAPÍTULO 1 

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Si bien los corte teñidos con H&E de muestras fijadas en formalina son convenientes ya que muestran adecuadamente las características estructurales generales, no son específicos para dilucidar la composición química de los elementos celulares. Además, muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra. Para retener estos componentes y estructuras, se deben utilizar otras técnicas de fijación. Por lo general, estas técnicas se fundamentan en un conocimiento sólido de la química involucrada. Por ejemplo, los alcoholes y solventes orgánicos que se usan en preparados de rutina diluyen los lípidos neutros. Para conservar los lípidos neutros, como los de las células adiposas, se deben utilizar cortes por congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en grasa; para conservar las estructuras de la membrana, se utilizan fijadores especiales con metales pesados, como permanganato y osmio, que se unan a los fosfolípidos. El empleo de rutina de tetróxido de osmio como fijador en la microscopia electrónica es la razón principal del excelente estado de conservación de las membranas en las fotomicrografías electrónicas.

Otras técnicas de tinción La hematoxilina y la eosina se utilizan principalmente para poner en evidencia las características estructurales.

A pesar de los méritos de la tinción con H&E, el procedimiento no permite ver de forma adecuada ciertos componentes estructurales de los cortes histológicos tales como elastina, fibras reticulares, membranas basales y lípidos. Cuando se desea estudiar estos componentes, se pueden utilizar otros procedimientos de tinción, en su mayoría selectivos. Estos procedimientos incluyen el uso de orceína y fucsina- resorcina para el material elástico y la impregnación argéntica para fibras reticulares y las membranas basales. Pese a que no siempre se comprende el fundamento químico de muchas técnicas de tinción, estos procedimientos sirven. Es más importante

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saber lo que el método permite observar que conocer su funcionamiento.

H IS TO Q U ÍM IC A Y C ITO QUÍMICA Los procedimientos químicos específicos pueden proveer información acerca de la función de las células y de los componentes extracelulares de los tejidos.

  H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A

FIGURA 1-1 ▲ Coloración con Hematoxilina y eosina (H&E). Esta serie de muestras de cortes de páncreas seriados (contiguos) demuestran el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas o combinadas. a. En esta fotomicrografía se ve una tinción con hematoxilina sola. Si bien hay una tinción general de la muestra, aquellos componentes y estructuras con gran afinidad por el colorante se tiñen con una intensidad mucho mayor, por ejemplo, el ADN nuclear y el ARN citoplasmático. b. En esta fotomicrografía, la eosina, colorante de contraste, consigue una tinción general de los tejidos al usarse sola. Sin embargo, debe notarse que los núcleos son menos conspicuos que en la muestra teñida sólo con hematoxilina. Después de que la muestra se colorea con hematoxilina y que se le prepara para la tinción con eosina en solución alcohólica, la hematoxilina que no estaba unida con firmeza se pierde, y entonces la eosina tiñe esos componentes para los que tiene gran afinidad. c. Esta fotomicrografía muestra el efecto de la tinción con ambos colorantes (H&E). 480 Χ.

Técnicas 

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Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos pueden tener su fundamento en la unión específica de un colorante, en el uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente con un componente celular en particular o en la actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo de la célula. Además, muchas macromoléculas presentes en las células pueden detectarse mediante la autorradiografía, en la cual precursores moleculares marcados radiactivamente se incorporan en las células y en los tejidos antes de la fijación. Muchos de estos procedimientos pueden utilizarse en preparados tanto para la microscopia óptica como para la microscopia electrónica. Antes de comentar sobre la química de las tinciones de rutina y de las técnicas histoquímicas y citoquímicas, es conveniente describir brevemente la índole de un corte histológico de rutina.

Composición química de las muestras histológicas La composición química de un tejido listo para una tinción de rutina difiere de la del tejido vivo.

Los componentes que perduran después de la fijación son principalmente moléculas grandes que no se disuelven con facilidad, en especial después de aplicar el fijador. Estas moléculas, en particular las que reaccionan con otras moléculas semejantes

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CUADRO 1-1

Correlación clínica: biopsias por congelación

A veces, el patólogo necesita valorar de inmediato el tejido obtenido durante la cirugía, sobre todo cuando el diagnóstico patológico instantáneo puede determinar el paso siguiente en la cirugía. Hay varias indicaciones para realizar dicha valoración, que se conoce como biopsia por congelación. Por lo general, un cirujano en el quirófano solicita una biopsia por congelación cuando se carece de un diagnóstico preoperatorio o cuando hay que identificar hallazgos intraoperatorios inesperados. Además, el cirujano puede querer saber si se ha extirpado toda la masa patológica dentro del límite de los tejidos sanos y si el borde de la resección quirúrgica está libre de tejido enfermo. Las biopsias por congelación también se realizan en combinación con otros procedimientos como la endoscopia o la biopsia con aguja fina para confirmar si el material obtenido se podrá utilizar en otros estudios patológicos. Para realizar una biopsia por congelación se siguen tres pasos principales: •• Congelación del tejido. Se congelan muestras de tejido de tamaño pequeño mediante el uso de dióxido de carbono sólido o mediante inmersión en un líquido frío (isopentano) a una temperatura de –50 °C. El enfriamiento puede

lograrse en una cámara refrigeradora muy eficiente. La congelación endurece el tejido y permite el corte con un micrótomo. •• Corte del tejido congelado. El corte suele realizarse dentro de un criostato, una cámara refrigerada que contiene un micrótomo. Dado que el tejido está congelado, se puede cortar en rebanadas muy finas (5 nm a 10 mm). Después los cortes se montan sobre portaobjetos de vidrio. •• Tinción de los cortes. La tinción se realiza para diferenciar los núcleos celulares del resto del tejido. Las tinciones de uso más frecuente para las biopsias por congelación son H&E, el azul de metileno (fig. C1-1.1) y tinción de PAS. Todo el proceso de preparación y valoración de las biopsias por congelación puede tardar en completarse en un mínimo de 10 m. El tiempo total para obtener resultados depende en gran medida del tiempo de transporte del tejido desde el quirófano hasta el laboratorio de patología, de la técnica patológica utilizada y de la experiencia del patólogo. Los resultados se comunican directamente al cirujano que está esperando en el quirófano.

CAPÍTULO 1 

Técnicas    H I S T O Q U Í M I C A Y C I T O Q U Í M I C A

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FIGURA F1-1.1 ▲ Valoración de una muestra obtenida durante la cirugía y preparada mediante la técnica de congelación. a. En esta fo-

a para formar complejos macromoleculares, son las que suelen conservarse en un corte histológico. Los siguientes son ejemplos de complejos macromoleculares grandes:

• nucleoproteínas, formadas a partir de ácidos nucleicos unidos a proteínas; • proteínas intracelulares del citoesqueleto, en complejo con proteínas asociadas; • proteínas extracelulares en grandes aglomeraciones inso-

lubles, unidas a moléculas similares mediante enlaces cruzados de moléculas vecinas, como ocurre en las formación de las fibras de colágeno;

• complejos de fosfolípidos y proteínas (o hidratos de carbono) en las membranas.

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tomicrografía se ve una muestra obtenida del intestino grueso que se preparó mediante la técnica de congelación y se tiñó con azul de metileno. 160 Χ. b. Parte de la muestra se fijó en formalina y se procesó con una técnica de rutina que comprende la coloración con H&E. El examen de la biopsia por congelación permitió comprobar que el tejido era normal. El diagnóstico se confirmó más tarde mediante el examen del preparado de rutina teñido con H&E. 180 Χ. (Gentileza del Dr. Daniel W. Visscher).

Estas moléculas constituyen la estructura de las células y los tejidos; es decir, son los elementos morfógenos hísticos. Son la base de la organización del tejido que se observa con el microscopio. En muchos casos, un elemento estructural es al mismo tiempo una unidad funcional. Por ejemplo, en el caso de las proteínas que forman los filamentos contráctiles de las células musculares, ellos son los componentes estructurales visibles y además participan en el proceso de contracción. El ARN del citoplasma aparece como parte de un componente estructural (p. ej., el ergastoplasma de las células secretoras, sustancia de Nissl de las neuronas) y es también el participante activo en las síntesis de proteínas.

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Muchos de los componentes de los tejidos se pierden durante la preparación de rutina de los cortes teñidos con H&E.

Sin embargo, estas moléculas pueden conservarse utilizando fijadores no acuosos para el glucógeno o añadiendo agentes ligadores especiales a la solución fijadora que preserven las moléculas extracelulares que contienen hidratos de carbono. Los componentes solubles, iones y moléculas pequeñas también se pierden durante la preparación de muestras de parafina.

Metabolitos intermedios, glucosa, sodio, cloro y sustancias similares se pierden durante la preparación de muestras de rutina en parafina teñidas con H&E. Muchas de estas sustancias pueden estudiarse en preparados especiales, en ocasiones con una pérdida considerable de la integridad estructural. Estos iones y pequeñas moléculas solubles no constituyen los elementos morfógenos de un tejido; participan en procesos de síntesis o reacciones celulares. Cuando pueden conservarse y detectarse mediante técnicas específicas, aportan información muy valiosa sobre el metabolismo celular, transporte activo

Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte coloreada y se...