Informe de espectrofotometría y colorimetría PDF

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COLORIMETRÍA Y ESPECTOFOTOMETRÍA

MARÍA CRISTINA LUNA LÓPEZ (1541236) DIANA YURLEY BRAVO LÓPEZ (1543171) LUISA FERNANDA RIVERA FORERO (1543556) ANGÉLICA MARÍA ROJAS MAYOR (1543378)

PRESENTADO A: ÁNGELA MARÍA ESCUDERO R. MD. FACULTAD DE SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO METABOLISMO

SANTIAGO DE CALI, VALLE. ABRIL 21 DE 2016

Resumen. En esta práctica realizamos procedimientos experimentales utilizando el espectrofotómetro para la determinación del espectro visible de KMnO 4 en una solución de 5 mL con una concentración de 2.5 x 10 -4 M, obteniendo una absorbancia máxima de 0.528% y una transmitancia de 29.6% a una longitud de onda de 530 nm. Se comprobó experimentalmente la Ley de Beer-Lambert, además de aplicar dicha ley para determinar la concentración de una muestra problema de KMnO 4 con un resultado de 0.000134%. Palabras clave: absorbancia, concentración, espectrofotómetro, longitud de onda, transmitancia.

INTRODUCCIÓN Uno de los métodos de análisis más usados en la química clínica es la espectrometría, la cual está basada en la absorción de fotones por el analito. El espectro electromagnético se divide en tres distintas regiones de acuerdo con la longitud de onda: La región ultra violeta (UV), la región visible (Vis) es la región de longitudes de onda que puede ver el ojo humano; donde la luz aparece como color y la región del infrarrojo (IR). [1]

El instrumento utilizado para este método de análisis es el espectrofotómetro, sus componentes básicos son: una fuente de radiación que es el área general del espectro electromagnético que se usa de acuerdo a las longitudes de onda. El selector de longitudes de onda hace la separación y selección de longitudes de onda presentes en la muestra. Un haz de referencia se transmite al detector y el haz de muestra pasa a través de la misma antes de alcanzar el detector. Si esta muestra interactúa con una longitud de onda en particular, es absorbida y la intensidad del haz de muestra disminuye y el detector compara la intensidad de los haces de referencia y de muestra. [2] Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica, de absorción molecular (que comúnmente se conoce como espectrofotómetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un espectrómetro de masa. PROCEDIMIENTO

Al iniciar la práctica de laboratorio se verifico que el colorímetro estuviera en modo transmitancia y longitud de onda indicados, se ajustó la transmitancia en 0%T y se preparó un blanco con 5ml de agua destilada, el cual se introdujo en la celda del colorímetro y se ajustó a 100%T. Seguidamente se introdujo en la celda un tubo de vidrio con 5mL de KMnO 4 2.5 x 10-4 M y se leyó la absorbancia de esta solución cada 10 nm, en un rango de longitud de onda de 400-600 nm teniendo en cuenta calibrar cada vez que cambiara la longitud de onda con el blanco de agua, se determinó a cuál longitud de onda KMnO4. Presenta máxima absorbancia. Los datos fueron registrados en la Tabla 1.

Fig. 1. Espectrofotómetro MILTON ROY SPECTRONIC 20D+ ®.

λ(nm)

A

%T

λ(nm)

A

%T

400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

0.150 0.153 0.130 0.117 0.113 0.123 0.150 0.177 0.248 0.300 0.363

71.0 70.4 74.2 76.4 77.0 75.4 70.6 66.4 56.4 50.2 43.4

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

0.426 0.512 0.528 0.516 0.460 0.362 0.294 0.203 0.130 0.082

37.4 30.8 29.6 30.4 34.6 43.4 50.8 62.6 74.2 82.8

Tabla 1: Datos del espectro de KMnO4 2.5 x 10-4 M.

Posteriormente se realizó la curva de calibración de KMnO 4 experimental utilizando la longitud de onda donde se presentaba la máxima absorbancia (Tabla 1), a partir de la solución de KMnO4 2.5 × 10-4 M se prepararon 5 tubos con diferentes cantidades de volúmenes de agua destilada y KMnO4 2.5 × 10-4 M, luego se debía calibrar el espectrofotómetro con el blanco antes de cada muestra y así obtener su absorbancia y transmitancia, pero para encontrar la concentración de las muestras de los tubos se utilizó la siguiente formula: Vi C i = VF C F Y para la concentración de la muestra problema se obtiene mediante la gráfica de absorbancia vs. Concentración. Los datos se encuentran registrados en la Tabla 2.

experimentalista al observar los objetos de medición y dar una medida exacta (error sistemático); para disminuir aún más los errores sistemáticos, se pueden implementar mejorías en la calidad de los instrumentos y tener más cuidado al momento de leer, calibrar y hacer las mediciones volumétricas correspondientes de las soluciones.

CONCLUSIONES Tabla 2: Datos curva de calibración KMnO4.

RESULTADOS

Para encontrar la concentración de la muestra problema se debe realizar una gráfica de Absorbancia vs. Concentración mediante los datos obtenidos en el laboratorio extrapolándolos, dándonos así como resultado una concentración de 0.000134% aproximadamente de la muestra problema. Como se ve reflejado en la siguiente grafica:

Mediante el procedimiento utilizado para encontrar experimentalmente la absorbancia, transmitancia y concentración de la solución de KMnO4 y de otras muestras con diferentes cantidades de H 2O y de KMnO4 2.5×10-4 M, fue posible obtener resultados muy buenos, a pesar de los factores que pueden influir como la veracidad al realizar medidas por parte del experimentador y la mala calidad de los instrumentos utilizados durante el procedimiento. PREGUNTAS 1) Realizar la gráfica de espectro de KMnO4 2.5 x 10-4 M.

Fig. 2. Gráfico de Absorbancia vs. Concentración extrapolado.

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Al realizar un riguroso análisis de los resultados obtenidos durante la práctica, se observa que son satisfactorios, ya que en el momento de leer la absorbancia y transmitancia en cada 10 nm de rango de la longitud de onda de 400 a 600 nm fuimos muy cuidadosas porque en cada cambio que hacíamos, calibrábamos con el blanco a 100% de transmitancia (T); determinando así que la máxima absorbancia del KMnO 4 es de 0.528 con una transmitancia de 29.6% a una longitud de onda de 530 nm. Sin embargo algunos de los errores habidos a lo largo del experimento pueden atribuirse a la medición volumétrica de las soluciones ya que ésta podría variar por una mala lectura o mala observación al momento de pipetear estas soluciones (KMnO 4 y H2O destilada) con la pera. Se pueden presentar factores influyentes como: el deterioro y mala calidad del instrumento de medición, la veracidad del

Fig. 3 Grafico espectro de KMnO4 2) Realizar la gráfica de absorbancia vs concentración de KMnO4.

Fig. 4 Grafico de Absorbancia vs. Concentración

3) Realizar la gráfica transmitancia vs concentración de KMnO4.

ε=

−1 −1 0.528 % =2.112 mol ∗cm −4 mol ∗1 cm 2.5 x 10 L

8) ¿Qué importancia tiene realizar la curva de calibración en la clínica? r/. Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia y se utiliza para determinar proteínas, colesterol, creatinina y demás analitos del cuerpo humano.

Fig. 5 Grafico de Transmitancia vs. Concentración 4) Realizar la gráfica para la curva de calibración para el KMnO4 y halle la concentración de la muestra problema por extrapolación.

9) Investigue el método para la determinación de glucosa en sangre, y los valores normales en hombres y mujeres. r/. Se extrae sangre por medio de venopunción al paciente y se procede a realizar un método enzimático colorimétrico que emplea hexocinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Passey, R. 1977). La glucosa es oxidada a D-gluconato por la glucosa oxidasa (GOD), con formación de peróxido de hidrógeno. En presencia de peroxidasa (POD), el fenol y la 4-aminoantipirina (4-AA) se condensan por acción del peróxido de hidrógeno, formando una quinoneimina roja proporcional a la concentración de glucosa en la muestra (Trinder, P. 1969). Los valores normales de glucosa en sangre para hombres van desde 70 hasta 100 mg/dL; después de un ayuno de 8 horas de 70 a 125 mg/dL. En mujeres, los valores normales comprenden de 70 a 140 mg/dL, y en ayuno de 70 a 100 mg/dL. [4]

r/ Ver fig. 2 5) ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorbancia para el KMnO4? r/ La longitud de onda de máxima absorbancia para el KMnO4 según la lectura del espectrofotómetro es de 530 nm. 6) De acuerdo a la longitud de onda máxima a qué color corresponde la absorción de KMnO4. r/ Según la longitud de onda máxima el color que corresponde a la absorción del KMnO 4 según la Tabla 1: relación entre la longitud de onda y el color [3], es verdeamarillento con un color violeta reflejado. 7) Calcule el coeficiente de extinción molar del KMnO4. r/. Ley de Lambert-Beer. Cálculo del coeficiente de extinción molar. La ley de Lambert-Beer (A = ε·c·l) indica que la absorción de luz a una determinada longitud de onda es directamente proporcional a la concentración de una disolución de un compuesto. Despejando esta fórmula nos queda

ε=

A c∗l

Donde A= es la absorbancia máxima del KMnO4 = 0.528 C = la concentración utilizada en el laboratorio = 2.5 x 10 -4 M l = Longitud del trayecto luminoso = 1 cm

10) ¿Por qué en pruebas clínicas es necesario utilizar un estándar o patrón? r/ Un estándar o patrón es una prueba de referencia conocida como patrón de oro, se debe usar para determinar la validez de otras pruebas diagnósticas, su calidad, su capacidad de identificar una enfermedad o para seguir un tratamiento.

REFERENCIAS

[1] GARY, D CHRISTIAN. Química analítica. Ed 6. México, D. F.2009. [2] Philip S. Bailey , Christina A. Bailey . Química orgánica: conceptos y aplicaciones. Pearson Educación.1998. [3] Solórzano Martha. Prácticas de laboratorio Metabolismo. Universidad del Valle. Facultad de salud. Departamento de Ciencias fisiológicas. Cali, 2016. [4] https://www.lasalidi.info [consultado el 15 de abril de 2016, 4 pm]...