OMS 7 - Prise de note des cours d\'UE1 : Oncologie et Maladies du Snag en 5ème année PDF

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Prise de note des cours d'UE1 : Oncologie et Maladies du Snag en 5ème année de Pharmacie à l'Université Paris Descartes.
Exhaustif, relu et sans faute....

Description

RONÉO 4A Matière : UE 1 - Oncologie et maladie du sang (partie oncologie) Cours n° : 7 Professeur : Ivan Bièche ([email protected]) Date : 26 septembre 2017 Nombre de pages : 24

Plan du cours

Méthodes innovantes de diagnostic I-

Introduction A. Tumeurs sporadiques et tumeurs héréditaires B. Etude des altérations génétiques

IIIIIIVVVIVII-

Le séquençage par la méthode de Sanger et Next Generation Sequencing (NGS) La technique Fluorescence in situ hybridization (FISH) La PCR et RT-PCR quantitative La CGH-arrays Le transcriptome Evolution vers de nouvelles techniques et essais

RT : Sophie NGUYEN RC : Anne DELACOURT Prochain cours le : jour même à 12h ( Généralités sur la chimiothérapie des cancers S.Michel)

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I-

Introduction Quelles sont les différences entre tumeurs sporadiques et tumeurs héréditaires ?

A. Tumeurs sporadiques et tumeurs héréditaires -

dans le cadre des tumeurs sporadiques , on regarde les altérations génétiques somatiques (celles qui sont acquises)  l’ADN, l’ARN est extrait de tumeurs . dans le cas de tumeurs héréditaires, on regarde les altérations génétiques constitutionnelles (celles qui sont héritées).  l’ADN est extrait de lymphocytes .

Sur les schémas, on constate un certain nombre d’altérations , et notamment une accumulation progressive d’altérations génétiques somatiques ( pour le schéma du haut par exemple ) .

B. Etude des altérations génétiques Le BUT de l’étude des altérations génétiques est la compréhension des mécanismes moléculaires de l’oncogenèse. Pour cela, nous disposons de plusieurs marqueurs en cancérologie clinique qui :  

sont impliquées dans la prédisposition aux cancers (dans le cas de mutations héritées ) mais aussi aident au dépistage du cancer, au diagnostic, au pronostic de la maladie, et à la prédiction de la réponse à une thérapie. Notion de thérapie ciblée .

Lorsqu’on observe le gène KRAS dans le colon, cela signifie une résistance aux anti-REGF, et lorsqu’on observe le gène EGFR dans le poumon, cela témoigne d’une sensibilité aux anti-REGF.

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Ceci nous mène donc à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, qui seront plus détaillées dans le dernier cours avec Monsieur Bièche , dans le cadre des biomarqueurs compagnons associés à des thérapeutiques ciblées . Voici en avance les exemples :  ERBB2 , identifié dans le cancer du sein, on a alors mis au point le Trastuzumab (Herceptin)  EGFR, identifié dans le cancer du poumon, on a alors mis au point l’Erlotinib (Tarceva) , ou encore le Gefitinib( Iressa)  KIT, identifié dans les tumeurs stromales gastro-intestinales, on a alors mis au point l’Imatinib( Glivec).

Les techniques indiquées en rouge seront abordées en cours ! En bas du tableau, on note la phrase « mise en évidence de l’hétérogénéité cellulaire », le professeur veut mentionner que les techniques marquées d’un astérisque sont réalisées sur une coupe de cellules, qui permettent de mettre en valeur l’hétérogénéité des gènes sur les cellules observées. II- Le séquençage par la méthode de Sanger et Next Generation Sequencing (NGS)

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IMPORTANT : il y a en réalité 2 étapes : 1) la PCR pour l’amplification génique 2) puis le séquençage Petite rectification sur la diapo : le cancer du côlon se retrouve dans plus de 40% des cas. Remarque : - On voit une mutation KRAS ? On n’a pas besoin de faire NGS , si la mutation est sur l’acide aminé 61 en prenant l’exemple de la photo, on voit que le codon qui code est sur l’exon 2 , on met une amorce de chaque côté , puis on fait notre PCR et notre séquençage ! - Sur l’électrophorégramme : notre oncogène est responsable d’une mutation hétérozygote, ce qui est suffisant pour activer KRAS sur 1 des 2 allèles. Attention aux partiels , pour une mutation ponctuelle, on ne fait pas de CGH array. En ce qui concerne le séquençage, on dispose de : - la technique de Sanger (ancienne) - NGS (Illumina, Pyrosequencing... etc) : cette technique permet de séquencer plus de gènes pour un coût moindre. On voit au fil des années qu’il y a un passage évolutif de Sanger (qu’on fait de moins en moins) à la NGS. Intérêt de NGS :  - meilleur criblage des exons (1000 exons au lieu de 10 dans Sanger). -FFPE signifie qu’il est possible de réaliser le NGS sur l’ADN congelé même si le plus souvent on réalise ces techniques sur des tumeurs fixées à la paraffine, puis on fait une coupe immunohistochimique selon la quantité d’ADN et d’ARN. - microméthode : on n’a besoin que 10 ng d’ADN (#100ng chez Sanger) Le NGS présente un débit 200 fois plus élevé pour un coût 100 fois moins élevé que Sanger.

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III- La technique Fluorescence in situ hybridization ( FISH) La méthode FISH (Fluorescence in situ hybridization) est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent. Elle permet de mettre en évidence les délétions, ou encore l’amplification génique, qui est un mécanisme d’activation d’oncogène comme ici (on a le cas du cancer du sein où on a une amplification du gene ERBB2 observée dans 20% des cancers du sein). On note qu’on regarde l’ADN et non la protéine à l’aide de 2 sondes fluorescentes .Comme ERBB2 est sur le chromosome 17, on a mis un contrôle dans le centromère du chromosome 17 pour compter les noyaux. Dans une cellule diploïde, on a 2 chromosomes 17, or là, avec la présence de ERBB2, on a plusieurs spots, au lieu d’avoir 2 copies, on en a 50 dûes à des répétitions en tandem. Exemple de translocation chromosomique ou inversions : translocation EML4-ALK et cancer du poumon : On utilise deux sondes suffisamment proches, une au niveau 5’ du gène ALK, et le deuxième dans le gène de ALK, de couleurs différentes (rouges et vert). Dans une cellule normale, ceux-ci sont suffisamment proches pour donner une couleur jaune sous le microscope. Lorsqu’il y a une inversion de fragment ou une translocation, ces sondes s’éloignent. A l’état hétérozygote, on voit donc deux points distincts dans la cellule. La translocation hétérozygote est suffisante pour activer un oncogène.

On fait un champ et on regarde les noyaux. Parfois, on constate une forte hétérozygotie des tumeurs, et surtout on retient qu’il n’y a pas de translocations dans toutes les cellules de la tumeur. Dans certaines, on constate qu’il y a une séparation nette de couleurs : rouge et verte sur 1 seul des 2 allèles.

IV- La PCR et RT-PCR quantitative La PCR se fait sur l’ADN( on parle en terme de nombre de copies d’ADN) alors que la RT-PCR (reverse transcriptase) se fait sur l’ARN (on parle en nombre de copies de transcrits ) : ces techniques permettent la quantification de millions de copies, chaque cycle amplifiant l’ADN.

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Quelques mots sur la RT-PCR : à partir d’un échantillon d’ARN, cette technique nous permet de faire la PCR. L’ARN est ensuite rétrotranscrit grâce à une transcriptase inverse, qui permet la synthèse de l’ADN complémentaire(ADNc) et cet ADNc est ensuite utilisé pour réaliser la PCR. Il y a une dizaine d’années ces techniques n’étaient pas adaptables au diagnostic. Maintenant, elles permettent de quantifier les acides nucléiques. Toutefois, on a une difficulté pour appréhender le nombre de copies de départ car la technique en soit n’est pas totalement efficace. Le but de départ était d’identifier un test simple, fiable, standardisée (ce qui pose parfois un problème de qualité au niveau des labos), automatisé, informatisé puis utiliser une très faible quantité d’ADN (on a des échantillons tumoraux de plus en plus petits). Deux évolutions ont permis d’atteindre cet objectif : - Agent intercalant SYBER Green : celui-ci émet une fluorescence quand il est fixé à l’ADN double brin. On a donc une corrélation entre l’émission de fluorescence et le nombre de copies au départ permettant de quantifier l’ADN présent dans l’échantillon grâce à un seuil C(T) (aussi appelé threshold) = nombre de cycle à partir duquel le produit PCR est détectable. On utilise cet agent dans la PCR en temps réel. ( + de PCR  + de fluorescence) - Il existe des automates permettant de faire la PCR (« cycler » thermique) et de détecter la fluorescence au cours de chaque cycle. La PCR se fait donc en temps réel et de manière instantanée. De plus cela permet de rester en cycle fermé sans ouvrir les tubes, nous évitant ainsi une éventuelle contamination. Récapitulatif de ce système intégré de haute reproductibilité pour la détection en temps réel des produits PCR Préparation des échantillons « cycler thermique »détection de la fluorescence analyse des résultats.

Lecture des résultats : L’échantillon mettant le moins de cycles à amplifier est forcément celui qui a le plus de copies à la base, (chaque cycle augmente le nombre de copie d’un facteur 2).

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Exemple 1 : si on lit C(T)=22.986, cela équivaut à dire qu’on a besoin de 23 cycle de PCR pour avoir l’émergence de fluorescence que l’appareil a considéré spécifique. Exemple 2 : Lorsqu’on dispose 2 échantillons dont C(t)1=23 et C(t)2=26, l’échantillon à C(t)1=23 a plus de nombre de copies au départ car on a eu besoin de moins de cycles pour émettre la fluorescence. Ainsi, on peut déterminer le nombre de copies qu’on a en plus dans un échantillon par rapport à l’autre. Pour cela, on réalise le calcul suivant : 2^(1+(C(t)2-C(t)1)). Ici, on a 2^(1+(26-23)), ce qui fait 16 copies dans le premier échantillon au lieu de 2. L’intérêt des PCR quantitative en temps réel : - spécifique  (copie unique par rapport à un génome haploide) - dosage précis et reproductible  ( vu le nombre de chiffres significatifs dans les valeurs) - automatisée et standardisée  - détection en tube fermés (moins de risque de contamination) car s’il y a une contamination, l’échantillon serait négatif.  - grande capacité : possibilité d’analyser plus de 4000 échantillons par jour.  ( On a des plaques de 284 puits). - microméthode (utile pour les petites tumeurs, ponctions ..)  Ordre de grandeur : 10ng d’ADN - large échelle de mesure: la technique marche même si on a une grande  amplitude de nombre de copies entre les échantillons.  ( de 1 copie à 10000 copies) - système ouvert : on peut dessiner nos propres amorces  pour étudier ce gène et dire tel exon amène à tel épissage. Exemples d’applications en clinique :  - Dans le cancer du sein (20%), on observe amplification du gène ERBB2 par PCR, une surexpression du transcrit ERBB2 par RT-PCR. Et on détecte par FISH l’ADN et la protéine par immunohistochimie. Le traitement est l’Herceptin ( Trastuzumab). Il s’agit ici d’une altération quantitative. - Dans la leucémie myéloïde chronique : le transcrit de fusion BCR-ABL est mis en  évidence par RT-PCR. Cette leucémie touche le chromosome 22, on met une amorce entre les chromosomes 9 et 22. On donne dans ce cas le Glivec à notre patient (notre fameuse thérapeutique ciblée). Si la personne n’avait pas la leucémie myéloide chronique il n’y aurait pas eu de signal fluorescent. Remarque : le séquençage préliminaire est considéré comme complet en 2004, mais il y a eu déjà de grandes avancées dès 2001. D’autres méthodes sont plus globales :  Celles-ci sont plus utilisées dans des essais cliniques ou recherches translationnelles. Chez l’Homme, il existe 20 000 gènes, 100 000 ARN et donc 500 000 à 1 000 000 protéines (mais qu’on ne peut pas analyser simultanément). Cette différence de nombre est due aux épissages alternatifs, des modifications post-traductionnelles au niveau des étapes de transcription et traduction.

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V- La CGH-arrays

 C’est une technique d’hybridation permettant de faire des caryotypes moléculaires. Elle utilise la puce pangénomique, contenant des oligonucléotides répartis sur l’ensemble du génome. Il existe des puces avec 250 000 voire 1 000 000 sondes, donnant une résolution qui va de 10kb jusqu’à 3kb au niveau de gènes. Cela veut dire qu’on peut pratiquement appréhender une anomalie au niveau de quelques exons intragéniques. Il existe des puces commerciales telles qu’Agilent ou Affymetrix pour réaliser la CGH au labo. On connaît la localisation chromosomique même si on dispose les oligonucléoties au hasard.

Méthode: On utilise les ADNs extraits à partir de tumeur du patient (ADN2) et des lymphocytes témoins (prélevés chez le même patient, appelé ADN1). On les marque avec des fluochromes : ADN1 diploïdes en vert, ADN2 tumoral en rouge. On les met en compétition pour l’hybridation sur la puce et par un jeu de couleur (rouge, vert, ou jaune) on observe des duplications, délétions et translocations non équilibrées de l’ADN. S’il y aura beaucoup plus de fragment d' ADN ERBB2 en rouge que vert et donc cela veut dire que le gêne est amplifié. S'il y a autant de vert que rouge, il n'y a pas de variation du nombre de copie dans la tumeur. S'il y a moins de fluorescence par rapport à un témoin (pour une autre pathologie qu'ici) sur un spot cela veut dire qu'il y a délétion .

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Cette technique connaît des limites : - Polymorphismes de grande taille : CNV (copy number variation) au sein des  populations à distinguer de cas pathologique. Mais cela peut être réglé par  l’intégration de l’ADN normal du patient = ADN contrôle (ici le lymphocyte témoin).  - Cette technique ne détecte pas les anomalies qualitatives telles que les  translocations réciproques et les inversions équilibrées (la solution alternative est FISH) ainsi que les mutations ponctuelles (possible par séquençage). Par contre, les anomalies de nombre comme les polyploidies, les trisomies et monosomies ou encore les anomalies de structure comme les délétions, les microdélétions , les duplications, et amplifications de l’ADN c’est possible. !!!!!

Le résultat est souvent présenté sur une l’échelle de log2(ratio).  - En temps normal tous les points restent au niveau de 0 témoignant  l’absence de duplication ou délétion.  - Si log2(ratio)= -1, on a une délétion hétérozygote car il reste une copie de  gène chez le patient : log2(1 copie chez le patient/2 copies chez le  contrôle) = log2(0.5)=-1.  - Si log2(ratio) = 1, on a une duplication  - Si log2(ratio) = - infini, c’est-à-dire un effondrement de points verts, dépassant largement -1, on a une délétion homozygote. Explication: log2( 0 copies de patient / 2 copies de contrôle) = log2(0) = moins infini.

Intérêt : - permet l’étude du génome avec moins de recours à l’expertise (technique  plus facile à interpréter que le cytogénétique)  - très bonne résolution : on peut appréhender des remaniements très fins tels  que intra-cytogénétiques, voir délétions intragéniques ( de 10 Mb 1Mb100 kb10 kb ( 3Kb) - permet de s’affranchir de la culture cellulaire ( on peut prendre l’ADN extrait de

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la tumeur) - microméthode : ne nécessite pas beaucoup d’ADN (1ug)  - automatise l’interprétation des résultats  VI- Le transcriptome C’est l’ensemble des ARNm d’un tissu cellulaire, il est issu de l’expression d’une  partie du génome. Les gènes sont exprimés différemment : - dans l’espace : propre à un type cellulaire, tissulaire ou d’organe  - dans le temps : propre à un stade de développement  ( à l’état embryonnaire) - pour un état donné : normal, en réponse à un stimulus particulier ou  pathologique (cancers)  Analyse du transcriptome :

On prend du tissu sain et du tissu tumoral, on les met en compétition sur des puces différentes avec des oligonucléotides spécifiques des parties codantes puis on observe si les gènes ont été sur ou sous exprimés. Ex : Dans le cancer du sein, on s’est rendu compte que plus de 2000 gènes créaient des variations par rapport au tissu sain (50 étaient connus à la base).

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On a essayé de voir l'intérêt d’une telle analyse pour le pronostic : par exemple dans le cancer du sein, une tumeur moins de 5 cm sans envahissement axillaire est une tumeur de très bon pronostic, donc pas de chimiothérapie agressive. Malheureusement, 10-20% de ces femmes qui vont quand même rechuter.

Donc si on prend un échantillon et qu'on analyse nos 21 000 gènes par transcriptome , il y a des tumeurs de bon pronostic. On a identifié une signature moléculaire de 70 gènes, qui était différente entre les tumeurs qui donnaient des métastases dans les 5 ans, par rapport aux tumeurs qui donnaient une absence de métastase. Dès 2002 une signature génomique de transcrit de 70 gènes a été identifiée pour déterminer le risque de métastase pour ces patientes. L'intérêt est de faire une désescalade thérapeutique : si le pronostic est bon, on ne fera pas de chimiothérapie pour rien.

VII- Evolution vers de nouvelles techniques et essais

Protéome : Les protéines sont des principes actifs doués de fonction dans la machinerie cellulaire. Un même gène peut coder plusieurs protéines. ll n’y a pas forcement de corrélation entre le niveau d’expression d’un ARNm et de sa protéine dues aux modifications post-traductionnelles (clivage protéolytique, modifications biochimiques)...

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Diapo importante !!!!

Un ligand (ex : facteur de croissance) se fixe sur le récepteur, et active la voie des MAP kinases. On remarque ainsi une cascade de phosphorylation par rapport au tissu adjacent qui est normal. Au niveau protéique, il n’existe pas de technique array pour appréhender des millions de protéines au niveau tumoral. Pour l’instant on utilise la spectrométrie de masse pour appréhender 7500 protéines au maximum, pour le moment. De nouvelles techniques voient le jour : -

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le WES (whole exome sequencing) : concerne exclusivement les exons (100Mb, 3%du génome). Il est moins cher et permet de voir des mutations, amplifications, délétions d’exons. L’amplification est déterminée par la profondeur de séquençage. le WGS (whole genome sequencing) plus complet mais aussi plus cher. Pour l’instant on est freinés par le prix mais cela se fera de plus en plus dans le futur. Ces techniques permettent de mettre en avant de nouvelles mutations par exemple dans la compaction de la chromatine, ce sont de nouvelles cibles thérapeutiques. En plus des altérations au niveau des exons, on peut voir des translocations, des mutations dans les introns, les promoteurs et des mutations intragéniques (ex: cis-régulateurs). Pour l’instant vu le prix (3000 euros), on n’en fait pas pour le diagnostic !

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La figure présentée au-dessus est appelée « Circos » . Elle permet de voir toutes les altérations d’une tumeur sur une seule figure. On voit les mutations ponctuelles, les duplications/délétions, les réarrangements. Cela a permis de définir, selon le profil de tumeur, quelle thérapie ciblée était la meilleure selon les altérations.

- Le petit tiret au bord, marque des mutations sur le chromosome correspondant (dans l’anneau extérieur - La variation du nombre de copies (amplification/délétion) est présentée sur la partie grise. - Les translocations sont présentées avec des courbes qui vont d’un chromosome à un autre => ex: translocations interchromosomique entre 12 et 22. - Une inversion ou translocation interchromosomique est présenté avec un trait droit sur la partie du milieu.  Ancienne question aux partiels : quand on voit l’image, ne pas répondre génome HCV ou régulation du cycle cellulaire mais dire que c’est un caryotype pour voir toutes les altérations ou on peut dire aussi une représentation pour voir les altérations sur tous les types de chromosomes.

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-Un essai SHIVA a été fait :

Dans cet essai on étudie tous les types de tumeurs métastatiques, on procède d’abord à un CGH-array pour observer les amplifications-délétions puis on sélectionne un panel de 60 gènes par NGS afin d’orienter le patient vers la meilleure thérapie ciblée selon le profil de la tumeur. Plus récemment : Essai MAPPYACTS en pédiatrie (2016-actuel) Il s’agit d’un essai au niveau national vient de commencer dans le domaine de la pédiatrie : On a d’abord réalisé un WES sur l’ADN de la tumeur pour voir des modi...