Poly TD OBM final 17-18 - Fascicule de TD L1S2 SdV Biologie moléculaire PDF

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Fascicule de TD L1S2 SdV Biologie moléculaire...

Description

UE « Biologie Moléculaire 2» L1S2 Biologie Moléculaire

2017/2018

Equipe pédagogique : Coline Arnoudt : [email protected] Pascale Belenguer: [email protected] Martine Briet : [email protected] Valérie Brunchault: [email protected] Nina Caillet : [email protected] Noélie Davezac : [email protected] (responsable UE) Tél : 05 61 55 65 76 Vincent Ecochard: [email protected] Estelle Espinos: [email protected] Manon Jaud: [email protected] Delphine Milhas : [email protected] Géraldine Mitou: [email protected] Roberto Pane: [email protected] Benjamin Portal: [email protected] Marie Poueymiro: [email protected]

Contenu de l’enseignement : Cours magistraux : 9 X 2 h Travaux dirigés : 6 X 2h

Contrôle des connaissances : Contrôle Continu1 (cours et travaux dirigés) (40%): 30 min Contrôle Terminal (cours et travaux dirigés) (60%): 1h

1

TD#N°1#:#PCR#(Polymerase#Chain#reaction)# Exercice n° 1 : Vous venez de retrouver dans un vieux congélateur du laboratoire une boîte contenant des oligonucléotides nommés "oligos bGeo", numérotés P1, P2, P3 et P4. Les séquences de ces oligonucléotides sont indiquées sur chacun des tubes (figure 1). D’autre part, vous avez connaissance de la séquence nucléotidique de l’ADN correspondant au gène bGeo (figure 1). A côté de ces tubes, dans la même boîte, vous trouvez un tube contenant de l’ADN génomique humain purifié provenant de cellules HeLa. Afin de savoir si vous allez conserver ou non ces oligonucléotides, vous envisagez de les tester en réalisant des expériences de PCR. Figure1 Matrice bGeo : 5’GGACTAGCTTGCATGCGTACTGCGG//…//GCTATGCTATCCCGATTGGTAGT 3’ 1 5 10 15 20 25 310 315 320 325 P1 : 5’ GACTAGCTTGCATGCGTA 3’ P2 : 5’ TAGCTTGCATGCGTACTG 3’

P3 : 5’ CAATCGGGATAGCATAGC 3’ P4 : 5’ TGCTATCCCGATTGGTAG 3’

1. Rappelez brièvement le principe de la technique PCR en insistant sur les points déterminants. Par quelle technique peut-on vérifier que la PCR a bien fonctionné ? 2. Est-ce que chacun de ces oligonucléotides s’hybride avec votre séquence ? Si oui sur quel brin s’hybrident-ils et à quel endroit ? 3. Donnez en le justifiant la taille des fragments PCR obtenus (s’ils existent) avec les six couples possibles d’oligonucléotides (P1P2, P1P3, P1P4, P2P3, P2P4 et P3P4). 4. Chaque cycle de PCR double la quantité d’ADN. L’amplification par un facteur 103 sera-t-elle obtenue après 10, 20 ou 30 cycles? Justifiez votre réponse. 1. Au cours du premier cycle d’une PCR faite sur de l’ADN génomique, les amorces ADN initient une synthèse qui ne s’achève que quand le cycle s’achève ou si, par hasard une extrémité de l’ADN est rencontrée. Pourtant, à la fin de 20 ou 30 cycles, le seul produit visible est précisément défini par les extrémités des amorces ADN. A partir de quel cycle un tel fragment d’ADN bicaténaire est-il généré ? 2. A votre avis, est ce que ces 4 oligonucléotides peuvent s’hybrider autre part dans le génome ? si oui, quels résultats pourraient être obtenus ? Comment pourrait-on alors améliorer la spécificité du résultat de la PCR en regard de l’obtention du fragment correspondant au gène bGeo ? Exercice n° 2 : En stage dans un laboratoire de recherche, votre encadrant vous demande d’amplifier par PCR une partie de la séquence du gène Th1 de souris représentée ci-dessous : 5’-ccaagacccg ttcgggatcc 1 11 tccttccaca tacggagcac 81 91 agctgaaagc atgaagacct 161 171 181

atggtgcagt 21 cgcgtccgag 101 tctg -3’

cctgctccgc 31 aggggctacg 111

ctacggctgc 41 tgatcctacc 121

2

aagaaccgct 51 aaatgactac 131

acgacaagga 61 tttgaaattg 141

caagcccgtc 71 ttgaagttcc 151

1.

Ecrivez la séquence (dans le sens 5’à 3’) des deux oligonucléotides (d’une longueur de 20 nucléotides) que vous devrez commander afin d’amplifier cette séquence d’ADN du nucléotide 11 au nucléotide 180.

Oligonucléotide1 : 5’…………………………………………………………………………3’ Oligonucléotide2 : 5’………………………………………………………………………….3’ 2. Quelle matrice d’ADN allez-vous utiliser pour faire cette expérience de PCR ? 3. Quelle devrait être la taille du fragment amplifié ? 4. Que feriez-vous afin de vérifier que la réaction de PCR vous a donné le fragment attendu ? 5. Représentez ce résultat.

TD#N°2#:#Analyse#quantitative#et#qualitative#des#acides#nucléiques#

Exercice n° 3 : On mesure l'absorption à 260nm (A260) d'une solution d'ADN chromosomique d’E.Coli purifié double brin à l’aide d’un spectrophotomètre. On obtient une absorption A260=3. Après une dilution au 1/10 on obtient une A260=0,6. A cette dilution, le rapport A260/A280=1,8. 1. Pourquoi mesure-t-on l’absorption à 260nm ? Quelle indication donne le rapport A260/A280? 2. Quelle valeur faut-il utiliser pour déterminer la concentration de la solution X ? 3. Déterminez cette concentration sachant que A260 = 1 correspond à 50µg/ml pour un ADN double brin 4. Quelle est la longueur en nm de l’ADN chromosomique d’E.Coli sachant que sa masse molaire est de 2,6 .109 g/mol, lorsqu'il est sous une forme d'hélice B. 1 tour d'hélice d'un ADN forme B est de 3,4nm et contient 10,4 pb par tour. On considèrera que la masse molaire d’un nucléotide est en moyenne de 330g/mol.

Exercice n° 4 : On désire étudier la concentration molaire d'un fragment d'ADN double brin (X) que l’on vient de purifier à partir d’ADN chromosomique d’E.Coli. Pour cela, on réalise une électrophorèse sur gel d'agarose. On a déposé sur la piste n°1 : 10µl d'un mélange équimolaire constitué de différents fragments dont les tailles (7,5 , 2 et 0,5 Kb) et la concentration (10ng/µl pour le mélange) sont connues. Et sur la piste piste n°2 : 10µl d'une solution contenant le fragment d'ADN (X) que l’on vient de purifier de concentration inconnue. L'intensité de la coloration des différentes bandes des pistes 1 et 2 a été quantifiée : Les intensités de fluorescence des bandes correspondant au fragment (X) purifié piste2 et au fragment de 2Kb de la piste1 sont identiques.

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1. Donnez les critères de migration et de séparation de l’ADN sur gel d’agarose. 2. Par quelles techniques peut-on révéler la présence de ces différents fragments d’ADN ? 3. Pourquoi l’intensité des bandes colorées sur la piste 1 décroit-elle ? 4. Calculez les concentrations molaires du fragment de 2Kb et du fragment de X. 5. A votre avis, pourquoi n’a-t’on pas utilisé le spectrophotomètre pour mesurer la concentration de cette solution d’ADN (X) ? Quelle valeur d’absorbance aurait dû être trouvée ? N.B. : Masse molaire moyenne d’un nucléotide 330g/mol. Kb : par usage on utilise Kb et non pas Kpb. Exercice n° 5 : Soit les séquences de deux oligonucléotides : 5'-cagtgagcatagcgattcgataggagctat-3' 5'-tccaatgcaggatacctgcattggatcgac-3' L’utilisation conjointe de ces deux oligonucléotides pour réaliser une amplification par PCR sur la matrice ADN appropriée ne donne aucun produit d’amplification ; pour comprendre les raisons de ce résultat négatif, les questions suivantes ont été posées: Q1)- Ces deux oligonucléotides peuvent-ils s’hybrider entre eux ? Q2)- Peuvent-ils adopter une quelconque structure ? Justifiez. Q3)- Quelle hypothèse peut-on énoncer ? Q4)- Quel type d’expérience permettrait de tester cette hypothèse ? Les deux oligonucléotides sont soit pris séparément soit mélangés en quantités équimolaires ; les tubes sont chauffés 2 min à 95 °C puis la température est progressivement abaissée jusqu’à 25 °C. Le contenu de chacun des tubes est alors réparti en 2 tubes, l’un est traité à la nucléase S1 - cette endonucléase digère les acides nucléiques naturellement simples brins ou restant simples brins après hybridation (mésappariement ou boucle)-, l’autre tube n’est pas traité ; les échantillons sont ensuite analysés sur 2 gels d’acrylamide l’un dénaturant, l’autre non dénaturant (natif) ; les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous.

4

Q5)- Que représentent les différentes bandes obtenues pour les différents échantillons dans les 2 types de gel ? Concluez sur l’étude de la structure des acides nucléiques. (Nota Bene : pour les besoins de l’exercice, on peut imaginer que l’expérience décrite ci-dessus ait été réalisée avec de grandes quantités de molécules afin de piéger assez d’intercalant pour permettre leur visualisation sous UV : les molécules simple brin retiennent moins d’intercalant qu’une même molécule double brin).

TD#N°3#:#Plasmides,#digestions#enzymatiques#et#clonage#de#fragments#de# restriction#

Exercice n° 6 : La séquence d’un fragment d’ADN bicaténaire d’une longueur de 900pb est partiellement reportée ci-dessous : 5’-ATACCAT…ACGGATCCGAGCTCTCGA……TTCGATGTCGGATCCGTGCA….GAAATTCC-3’ 1 201 401 900 1. Ecrire la séquence partielle correspondante du second brin de ce fragment et indiquez son orientation. 2. Quelle forme (mono ou bicaténaire) de l’ADN est reconnue par les enzymes de restriction ? 3. Le site reconnu par l’enzyme de restriction BamHI est le suivant :

4. Sur votre séquence d’ADN double brin encadrer le ou les sites BamHI en indiquant les sites de coupure. 5. Sachant que, sur cette séquence d’ADN, il n’y a pas d’autres sites BamHI que ceux identifiés ci-dessus, combien de fragments sont obtenus après digestion totale de votre fragment d’ADN par l’enzyme BamHI ? 6. Ecrire les séquences des extrémités des molécules d’ADN digérées. 7. Dessinez le profil de migration que vous attendez après avoir fait migrer l’ADN digéré sur un gel agarose révélé par une coloration au Sybrgreen. 8. Sachant que vous avez déposé 500ng d’ADN digéré, combien de molécules d’ADN se trouvent dans chacune des bandes obtenues ? N.B.: masse molaire moyenne d'un nucléotide : 330g/mol Exercice n° 7 : Des bactéries ont été transformées par le plasmide pTD1 représenté figure 1. Elles sont ensuite cultivées en milieu liquide. Puis 1ml de culture est centrifugé, les bactéries sont lysées et l’ADN plasmidique est purifié et remis en suspension dans 50µl d’eau. Le plasmide pTD1 (Figure 1) purifié est ensuite soit non digéré (piste 1), soit digéré pendant 1h à 37°C avec des concentrations croissantes d’enzyme de restriction BamHI (pistes 2 à 7). Les différentes digestions sont analysées par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 2). Pour 5

chaque piste, 100ng d’ADN sont déposés. Un marqueur de taille correspondant à de l’ADN linéaire est déposé piste M. 1. Décrivez en détail les différentes étapes de la transformation bactérienne et des conditions de culture. 2. Quel est le sens de migration du gel ? 3. Comment peut-on révéler ces différents fragments d’ADN ? 4. Pourquoi observe-t-on deux bandes dans la piste 1 alors que le plasmide n’est pas digéré ? 5. Expliquez la présence des différentes bandes dans chacune des pistes. 6. Quelle est la taille du plasmide ? 7. Que traduisent les différences de fluorescence observées dans les pistes 1 et 7 ? Peut-on estimer le rapport de fluorescence des bandes présentes dans chacune des deux pistes ? Le cas échéant, quel est-il ? 8. Par spectrophotométrie à 260nm on a dosé la solution d’ADN plasmidique purifiée après dilution au 1/10 et on a trouvé une D.O égale à 0,2. Sachant que pour de l’ADN double brin, une D.O égale à 1 correspond à une solution de concentration égale à 50µg/ml, calculez la concentration en µg/µl de votre solution d’ADN plasmidique purifié. Quel volume d’ADN plasmidique a été utilisé par digestion enzymatique ? 9. Sachant que la masse molaire moyenne d’un nucléotide est de 330g/mol, calculez la concentration molaire de votre solution d’ADN plasmidique purifié. Figure 1 BamHI Amp

pTD1

BamHI

ORI

Figure 2

1

2

3

4

5

6

7

M pb 5000 4000 3500 3000 2000 1000

6

Exercice n° 8 : Nous souhaitons cloner dans le vecteur pTD2 (figure1), le fragment EcoRI de 9kb obtenu après digestion d’un fragment d’ADN génomique de 45 kb (figure 2), lui-même provenant d’une banque d’ADN génomique (réalisée par digestion par l’enzyme XhoI). Ce nouveau clonage permettra de travailler sur un fragment d’ADN génomique de taille plus restreinte ! BamHI (2800)

Figure 1

Amp

EcoRI (1)

pTD2 (2900pb) SalI (500)

ORI

1- Combien de fragments d’ADN distincts obtient-on après digestion du fragment d’ADN génomique par EcoRI ? Quelles sont leurs tailles ? Comment peut-on isoler et purifier le fragment que l’on souhaite cloner ? 2- Décrire les différentes étapes du clonage. 3- Peut-on obtenir plusieurs types de plasmides recombinants ? Pourquoi ? Dessinez les résultats moléculaires.

TD#N°4#:#Southern#blot## Exercice n° 9 : TECHNIQUE DE SOUTHERN Q1 : Lors de la technique dite de SOUTHERN, l’ADN analysé par électrophorèse sur gel d’agarose doit être dénaturé. Pourquoi cette dénaturation ? Et comment pratiquement réaliser cette dénaturation ? Q2 : Une sonde marquée est utilisée lors du Southern. De quel type de molécules s’agit-il et comment réalise-t-on un tel marquage ? SOUTHERN SUR PLASMIDE L’ADN purifié d’un plasmide a été digéré par l’enzyme de restriction BamH1. L’ADN ainsi digéré a été analysé par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration au BET (Fig 1A et Fig 1B) Une sonde A (= fragment d’ADN de 200 paires de bases) a été marquée radioactivement 7

puis hybridée avec une membrane correspondant à un transfert du gel d’agarose préalablement réalisé. Le gel est représenté sur la Fig 1B et le résultat après hybridation, lavage et autoradiographie de la membrane est montré en Fig 1C.

Q3 : Analysez ces résultats. Positionnez même approximativement la sonde A sur la carte de la fig 1A. Une autre sonde (B = fragment d’ADN de 200 paires de bases, différent de A), a aussi été marquée et utilisée en hybridation sur une membrane de transfert identique à la précédente. Le résultat est montré sur la Fig 1D. Q4 : Analysez les résultats et positionnez aussi la sonde B. L’ADN purifié de ce même plasmide a été digéré par l’enzyme de restriction EcoR1. L’ADN digéré a été analysé par électrophorèse sur gel d’agarose puis transféré sur membrane et hybridé avec soit la sonde A (Fig 2A) soit la sonde B (Fig 2B).

Q5 : Proposez une carte physique pour l’ADN du plasmide positionnant sur celle-ci les sondes A et B ainsi que le(s) site(s) reconnu(s) par EcoR1. Q6 : Proposez une nouvelle expérience complétant ces deux résultats. SOUTHERN GENOMIQUE 10 µg d’ADN humain purifié ont été digérés en totalité par l’enzyme EcoR1 dont le motif reconnu est de 6 paires de bases (GAATTC). La taille de l’ADN génomique humain est de 3. 109 paires de bases. Q7 : Quel est le nombre approximatif de fragments différents d’ADN humain obtenus après une telle digestion enzymatique ? Expliquez votre raisonnement ainsi que le calcul. Ces fragments sont-ils tous de la même taille ? Q8 : Qu’observerait-on si on digérait avec l’enzyme de restriction Not1 dont le motif reconnu est de 8 paires de bases (GCGGCCGC) ? Q9 : Sur le même type de gel d’agarose que précédemment, comment se présenterait une électrophorèse d’ADN humain digéré par EcoR1 et coloré par le BrEt ? Expliquer.

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Une sonde (fragment d’ADN issu du génome humain, longueur =1000 paires de bases) a été marquée radioactivement pour être hybridée avec une membrane correspondant à un transfert (Southern) réalisé à partir d’un gel où l’ADN humain (10 µg) a été digéré soit par EcoR1, soit par BamH1, soit par les deux enzymes à la fois. Après hybridation, lavage et autoradiographie, le résultat est montré Fig 3.

Q10 : Analysez ces résultats. Q11 : Peut-on estimer combien de fois la séquence contenue dans le fragment de 1000 paires de bases est-elle présente sur l’ensemble du génome humain ? Q12 : A partir de ces résultats de ces digestions, construisez une carte physique de cette région du génome en y positionnant la séquence du fragment de 1000 paires de bases (sonde). Une autre sonde de 1000 paires de bases issue du génome humain a été utilisée pour le même type d’expériences de Southern. Les résultats sont montrés Fig. 4.

Q13/ Analysez ces résultats en les comparant à ceux de la figure précédente. Que pouvez-vous conclure quant aux séquences d’ADN contenues dans cette nouvelle sonde ? TD#N°5#:#Séquençage# Exercice n° 10 : Vous venez de réaliser un clonage par PCR de l’ADNc complet de la protéine de souris USB2 aux sites EcoRI et HindIII du plasmide représenté ci-dessous. La taille de cet ADNc est de 1,5kb. Vous souhaitez vérifier que la séquence amplifiée et clonée ne comporte pas de mutation par rapport à la séquence d’origine. 1. 2.

Expliquez brièvement le principe de la technique de séquençage de l'ADN selon Sanger (séquençage enzymatique aux didéoxyribonucléotides). Quel(s) oligonucléotide(s) (1, 2, 3 ou 4) choisira-t-on comme amorce pour séquencer le fragment hachuré ? (cf figure 1)

9

3. 4. 5. 6.

Auquel des deux brins d’ADN (A ou B) est identique la séquence obtenue par lecture directe de l'autoradiographie ? Lire la séquence ainsi obtenue et l’orienter. Sachant qu’on ne peut séquencer que 600pb par réaction, proposez une stratégie pour obtenir la totalité de la séquence du fragment de 1,5kb. Donnez les combinaisons des oligonucléotides 1, 2, 3 et 4 permettant d’obtenir un produit d’amplification PCR à partir du plasmide utilisé.

EcoRI B

3 4

A

HindIII 1

2

TD#N°6#:#PCR#(Polymerase#Chain#reaction),#clonage#par#PCR#et#séquençage# Exercice n° 11 : A) On souhaite cloner dans un plasmide la totalité du cadre de lecture codant la protéine TD6 (atg=codon d’initiation/ tga=codon stop). Pour cela une amplification par PCR sur le cDNA cidessous est réalisée. 1 ccaagacccg 51 aagaaccgct 101 tacggagcac 151 tttgaaattg

11 ttcgggatcc 61 acgacaagga 111 cgcgtccgag 161 ttgaagttcc

21 atggtgcagt 71 caagcccgtc 121 aggggctacg 171 agcatgaaag

31 cctgctccgc 81 tccttccaca 131 tgatcctacc 181 cttgaagacc

41 ctacggctgc 91 agtttcctct 141 aaatgactac 191 ttctg

Ecrivez la séquence (dans le sens 5’®3’) des deux oligonucléotides (d’une longueur de 20 nucléotides) qui permettront d’amplifier cette séquence d’ADNc des nucléotides 11 à 190. Oligonucléotide 1 : 5’…………………………………………………………………………3’ Oligonucléotide 2 : 5’………………………………………………………………………….3’ Quelle est la taille du fragment amplifié ?...........................pb

10

B) Ce fragment est cloné dans le plasmide pL1S2 dont la taille est de 3000pb. Ce plasmide contient un site de clonage multiple (MCS ou Polylinker) comportant les sites de restriction suivant :

XbaI%%%% %

%%%%PstI%%%%

EcoRI%%% %

%%%HindIII%%%%

EcoRV%

%%%ClaI%%%

%%%%SmaI

BamHI%%

%

%

%

Compte-tenu de la séquence que vous avez amplifiée, indiquez les deux sites de restriction que vous utiliserez afin de réaliser un clonage orienté de votre fragment amplifié.

C) Après avoir digéré votre plasmide pL2S4 et votre fragment PCR par les deux enzymes de restriction choisies, vous réalisez la ligation du fragment PCR et du plasmide digérés puis vous transformez des bactéries compétentes avec ce produit de ligation. Après transformation, vous isolez une colonie dont le plasmide correspond au plasmide recombinant souhaité. Dessinez sur le gel d’agarose schématisé ci-contre en respectant les intensités de fluorescence, les bandes attendues pour une digestion de ce plasmide par Pvu I (piste1) (pas de site Pvu I dans l’insert) ou par les deux enzymes de restriction correspondant aux sites de clonage (piste2). Vous considérerez que les digestions sont totales.

11

Exercice n° 12: On souhaite amplifier la région comprise entre les nucléotides 10 et 350 d'une matrice d'ADN linéaire double brin en vue d’un clonage. La séquence d’un des deux brins est donnée ci-desso...