Prác.determinación de actividad (9, 10 y 11) PDF

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Instituto PolitécnicoNacional.Escuela Nacional deCiencias Biológicas.Laboratorio de Bioquímica.Carrera: Ingeniería en Sistemas Ambientales.Grupo: 4AMPracticas No. 9, 10 y 11.Titulo de la práctica: "Determinación de actividades de LDH,SDH y Citocromos".Integrantes de la práctica: B...

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Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

Laboratorio de Bioquímica. Carrera: Ingeniería en Sistemas Ambientales. Grupo: 4AM1 Practicas No. 9, 10 y 11. Titulo de la práctica: "Determinación de actividades de LDH, SDH y Citocromos". Integrantes de la práctica:  Beltrán Altamirano Larissa  Hilario Hernández Edilberto  Reyes Vértiz Omar Francisco Fecha de realización de la práctica: 13 de Noviembre 2018 Fecha de entrega de la práctica: 20 de Noviembre 2018

"La técnica al servicio de la patria"

Introducción. La deshidrogenasa láctica (DHL) cataliza la conversión del piruvato a lactato y viceversa. En condiciones aeróbicas, el ácido pirúvico pasa del citoplasma al interior de la mitocondria por medio de una porina que se localiza en la membrana externa mitocondrial. Las enzimas generadas durante el metabolismo celular pueden modificar sus concentraciones frente a diversos fenómenos fisiopatológicos, siendo así válida su cuantificación en suero para precisar ciertos diagnósticos. Entre las más conocidas tenemos a la deshidrogenasa láctica (DHL), proteína enzimática que actúa sobre piruvatos y lactatos con una interconversión del dinucleótido de adenina-nicotinamida (DNA), así como de su forma reducida: DNAH +. Normalmente, hay cinco isoenzimas de la deshidrogenasa láctica presentes en células vivas y conformadas por la combinación entre polipéptidos-M y polipéptidos H. El incremento de la DHL refleja varios fenómenos tales como: actividad osteoblástica, hemolisis, daño y necrosis celular, proliferación neoplástica, etc. Las isoenzimas de la deshidrogenasa láctica Existen fracciones enzimáticas de la DHL con cierto valor en su detección y su asociación con determinados trastornos cuando se obtienen cifras elevadas. En el adulto, los rangos normales de cada una de ellas son:  DHL1: 22 a 36% de la actividad total (presente en miocardio y en eritrocitos)  DHL2: 35 a 46% de la actividad total (en miocardio y eritrocitos)  DHL3: 13 a 26% (en tejido pulmonar)  DHL4: 3 a 10% (en músculo estriado y en hígado)  DHL5: 2 a 9% (en músculo estriado y básicamente, en hígado) Por otra parte, la cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de óxidorreductasas y ferroproteínas. El ciclo de Krebs y la succínica deshidrogenasa (SDH) La enzima succinato deshidrongenasa (SDH), succinato coenzima Q reductasa o complejo II mitocondrial es un complejo protecio ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones, y que contiene FAD (flavín-adeníndinucleótido) unido covalentemente. La succínica deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada al grupo prostético FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, malato, oxalacético y oxálico. Actividad de citocromos. Los citocromos son proteínas que desempeñan una función vital en el transporte de energía química en todas las células vivas. Las células animales obtienen la energía de los alimentos mediante un proceso llamado respiración aeróbica; las plantas capturan la energía de la luz solar por medio de la fotosíntesis. Los citocromos intervienen en los dos procesos.

El complejo citocromo oxidasa es el componente final de la cadena y está constituido por el citocromo A y A3 y dos iones Cu +2. Aproximadamente 90% del consumo celular de oxígeno se debe a la acción de este complejo. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrónicos más fuertes como el cianuro, azida y monóxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimático y se interrumpe el transporte de electrones produciéndose una cianosis celular. Citocromo A, contienen hemo: A que es una forma modificada de la protoporfirina IX. Es importante mencionar que los citocromos A de la cadena de transporte están asociados a átomos de cobre, que serán oxidados o reducidos por los átomos de hierro de las porfirinas, pero nunca el cobre formara parte de los grupos hemo. Citocromo B, contienen hierro-protoporfirina IX (existen 15 clases de porfirinas aunque sólo la IX aparece en la naturaleza), conocida como hemo B. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH 2) en presencia del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.

Objetivos.  Observar la actividad de la enzima LDH y poner de manifiesto las reacciones de oxido reducción en donde participa.  Observar la actividad de la enzima SDH y poner de manifiesto las reacciones de oxido reducción en donde participa.  Observar y poner de manifiesto las reacciones de oxido reducción en dónde participan los citocromos.

Resultados en forma de tabla. 0 minutos

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2 minutos

2 minutos

Actividad de la LDH 3 minutos 4 minutos

5 minutos

Actividad de la SDH 5 minutos 10 minutos

7 minutos

25 minutos

Actividad del citocromo C y citocromo C oxidasa 0 minutos 1 minuto 2 minutos

Reacciones efectuadas en las prácticas correspondientes.

Ilustración 1.- Reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa.

Ilustración 2.- Forma oxidad y reducida de la coenzima nicotinamina adenina dinucleotido.

Ilustración 3.- Reacción de succinato deshidrogenasa.

Ilustración 4.- Estructuras de flavín adenín dinucleótido y falvín adenín mononucleótido oxidados y reducidos.

Ilustración 5.- Reacción de p-feniléndiamina con el citocromo C.

Interpretación de cada tubo y global de cada serie. Discusión Como sabemos, las isoenzimas de la LDH (Lactato Deshidrogenasa) catalizan la reacción reversible de piruvato a lactato, empleando la coenzima NADH + H +, por lo que el propósito de esta reacción radica en reoxidar al NADH + H +, es importante la colocación de una barrera orgánica que impida la oxidación del NADH + H + en condiciones fuera de la reacción dentro del tubo, el suministro de aceite vegetal en la parte superior es la opción más viable en este caso; Entonces para esta reacción es necesario los 3 reactivos ya mencionados por lo que en esta experiencia al evaluar la carencia o presencia de un compuesto observamos solo una decoloración del azul de metileno indicando una prueba positiva en los tubos número 1 y 3 y una prueba negativa en los tubos con el número 2 y 4, al analizar los componentes colocados en los tubos 2 y 4 notamos que en el tubo número 2 de los tres compuestos necesarios no se colocó NADH + H + y en el tubo número 4 no se colocó LDH entonces la reacción no se llevó a cabo; Analizando los compuesto presentes en el tubo 1 notamos la

presencia de todos los compuestos necesarios, sin embargo en el tubo número 3 aún sin la colocación del sustrato lactato se observa un notoria pero no completa decoloración, esto se debe a que la obtención de los compuestos fueron obtenidos en crudo por lo que si bien tenemos una mayoría de concentración de LDH en sus respectivo extracto, también tenemos en pequeña cantidad lactato pero suficiente para lograr una reacción parcial.

Durante la realización de la segunda experiencia tenemos como compuestos necesario en la reacción al Succinato de Sodio, al SDH-CIT y en un medio acuoso, por lo que se realizan distintas combinaciones de concentraciones, adición/no adición de compuestos y en esta ocasión la inclusión del Malonato de Sodio que funge como inhibidor competitivo de la SDH para observar el comportamiento, a todas las pruebas nuevamente se agrega aceite vegetal. En los tubos número 2, 3 y 4 no observamos una decoloración del azul de metileno indicando una prueba negativa de reacción, en el tubo número 2 se tiene carencia por completo de la SDH-CIT, en el tubo número 3 se tiene carencia del sustrato Succinato de Sodio y en el tubo número 4 no existe el medio acuoso que permita que se lleve a cabo la reacción. Prueba positiva en los tubos número 6, 7 y 1 numerados de menor a mayor, podemos considerar el tubo 1 como nuestro patrón para los tubos 6 y 7 pues se observa una decoloración casi completa; Donde el tubo 6 permanece con un color azulado mayor al del 7 debido a la menor cantidad de sustrato presente en relación con la cantidad de inhibidor. La presencia de SDH-CIT oxida a la p-feniléndiamina 1% debido a la presencia de citocromos, lo que la prepara para reaccionar con α- naftol y formar azul de indofenol, se espera una coloración opaca y como inhibidor enzimático se tiene a KCN 0-5%. En esta experiencia es difícil determinar las pruebas positivas y negativas pero se observa una prueba positiva en los tubos 4 y con menor opalescencia en el tubo 6 debido a la presencia del inhibidor KCN, en el tubo 4 sin embargo, se cuenta con el medio acuoso, sustrato, citocromo y α- naftol necesario para que la reacción se lleve a cabo completamente, en los tubos 1, 2 y 3 no se colocó α- naftol por lo que solo podemos especular que el tubo 2 hubiera dado una prueba positiva por presencia de citocromos en enzima y sustrato, en los tubos 5 y 7 se tiene una presencia variada de compuestos de los cuales la falta de Citocromo en enzima en los dos casos es la causa de una prueba negativa en estos tubos.

Conclusiones. La enzima lactato deshidrogenasa desempeña un papel importante en la respiración celular, el proceso en el cual la glucosa (azúcar) proveniente de los alimentos se convierte en energía que puede ser utilizada por las células. Su importancia biomédica radica en que las isoenzimas LDH se encuentran en concentraciones específicas en diferentes órganos y tejidos. Al medir los niveles de estas isoenzimas en la sangre, los médicos pueden tener una mejor idea del tipo, la ubicación y la gravedad del daño celular. Se puso en manifiesto la actividad de oxidación y reducción de manera artificial, simulando la actividad celular mediante la observación del color. Se concluye que la LDH realizó correctamente su actividad reductora por el cambio de coloración en tubo 1 y que en el tubo 4 no hay actividad ya que no cuenta con la enzima (ver tabla de resultados). La enzima succionato deshidrogenasa forma parte de una serie de reacciones químicas que se llevan a cabo dentro del ciclo de Krebs y tiene como función en la reorganización de moléculas a cuatro átomos de carbono hasta la regeneración del oxalacetato. Para que eso sea posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un carbonilo. Igual que en la LDH, en esta experiencia con SDH, se utiliza el indicador azul de metileno para hacer una detección cualitativa del estado de oxidación-reducción. Es un aceptor electrónico artificial coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se

reoxida la coenzima FAD. Se concluye que el objetivo en esta sección también fue exitoso debido a la observación del cambio de color en el tubo 1. Finalmente, se observó correctamente la actividad del citocromo c y citocromo C oxidasa; esta reacción fue más rápida que las anteriores y se observó el efecto del cianuro (CN -) que inhibe de manera competitiva el metabolismo aeróbico al unirse al grupo hemo binuclear de la citocromo c oxidasa

Bibliografía   

FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y P. Walter. (2006) Introducción a la Biología Celular. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana. COWGILL, R y PARDEE, A: Técnicas de Investigación Bioquímica, 1a Ed, Editorial Alhambra, Madrid, 1964. PLUMMER, D. T. Introducción a la Bioquímica Práctica. Editorial McGraw Hill Latinoamericana SA. Colombia....