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Practica 5

CINETICA ENZIMATICA

Objetivo 1. El objetivo de esta práctica consta en analizar y observar los efectos del pH y la temperatura como factores en la actividad enzimática durante una reacción. 2. Poder definir e identificar los efectos de temperatura y pH en la actividad enzimática una vez que se hacen varianzas sobre estos factores.

Materiales y métodos practica 5 CINÉTICA ENZIMÁTICA 2: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA REACTIVOS: Solución de Invertasa 0.001% Buffer de citratos pH: 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5

Sacarosa 0.03M 3,5 Dinitrosalicilato

PROCEDIMIENTO: Experimento No. 1 Efecto del pH 1.- etiquetamos 7 tubos con la descripcion de la sig tabla:

Tubo

1

2

Sacarosa 0.3 M

1.0 ml

1.0

Amortiguador pH = 2.5

0.5 ml

0

2.- agregamos 1.0 ml de sacarosa 0.3M a los 6 primeros tubos

tiguador pH = 3.5

0

0.5

tiguador pH = 4.5

0

0

rtiguador pH = 5.5

0

0

Amortiguador pH = 6.5

0

0

3.- agregamos 0.5 ml de amortiguador a cada tubo asi:

tiguador pH = 7.5

0

Invertasa

1.0 ml

Agua

0

0 1.0 0

5.- agregamos 1.5 ml de agua al tubo numero 7 A PH = 5 A PH 7.5= 6

6.- mezclamos bien e incubamos a 35 C durante 20 min

8.- mezclamos de nuevo y calentamos a baño de abullicion hasta que cambiaron de color 1.0 ml

1.0 ml

0

0

0

0 0

9.- dejamos enfriar 0

0

0.5 ml

0

0

10.- leimos a 540 nm ajutado a 000 con el tubo numero 7

RESULTADOS:

PH

Table 1 resultados de espectrofotometro

Serie 1 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

BLANCO

tubo 1

tubo 2

tubo 3

tubo 4

tubo 5

tubo 6

0

0

4.- luego agregamos 1.0

7.- agregamos 1 ml de Dinitrosaliciliato a todos los tubos

7

0 0 ml .5 ml

Practica 5

CINETICA ENZIMATICA Experimento No. 2 Efecto de la Temperatura (Clark J, 1964) 1.- etiquetamos los tubos deacuerdo a la sig tabla

4.-agregar 1.0 ml de invertasa a todos los tubos

2.- agregamos 1.0 ml de sacarosa 0.3M a los primeros 6 tubos

5.- agregamos 1.0ml de agua al tubo no.7

3.- agreamos 0.5 ml de amortiguador 4.7 a los 7 tubos

8.- meclamos y calentamos a ebullicion hasta que cambio de color

1-4 2-26 3-37 4-45 5-60 6-100 7-25

6.- incubamos deacuerdo 7.- agregamos 1 ml de dinitrosalicilato a a la temperatura indicad todos los tubos x 20 min

9.- Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 7

Tubo

1

2

3

4

5

6

7

Sacarosa 0.3 M

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0

Amortiguaor pH = 4.7

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Invertasa

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Agua

0

0

0

0

0

0

1.0

Temperatura °C

4

26

37

45

60

100

25

temp

RESULTADOS:

temp

Table 2 resultados de espectrofotometro

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

BLA NC O

tubo 1

tubo 2

tubo 3

tubo 4

tubo 5

tubo 6

DISCUSION DNS; El método DNS determina la presencia de grupos carbónicos libres (C=O) de los azucares reductores. El procedimiento se basa en una reacción redox, que ocurre en la utilización de ácido 3,5 dinitrosalicílico para provocar la oxidación de los azucares y al mismo tiempo su propia reducción endotérmica. Un mol de azúcar reacciona con un mol de ácido 3,5 dinitrosalicílico, dando lugar a una

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reacción estequiométrica que permite conocer la cantidad de azucares reductores presentes en la muestra. La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalicílico es de color amarillo, mientras que la aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a pardo oscuro, cuya intensidad será proporcional a la cantidad de azucares reductores. Invertasa; Las enzimas que catalizan la hidrolisis de sacarosa y glucósidos relacionados se denominan invertasas. La especificidad de la enzima por la sacarosa se debe a un residuo -D-fructofuranosil terminal insustituído de la sacarosa (alguna sustitución en este residuo evita la hidrolisis de este azúcar). La formación del complejo invertasa sacarasa es mediada por los hidroxilos del residuo fructofuranosil interactuando mediante puentes de hidrogeno con grupos hidrofílicos situados sobre la superficie activa de la enzima. La actividad de la invertasa, al igual que todas las enzimas, se puede afectar mediamente diversas condiciones del medio de trabajo y diversos compuestos, por ejemplo, el pH por debajo de 4 o por arriba de 5.6 ocasiona cambios en el punto isoeléctrico de la enzima e inhibe su actividad catalítica. Las temperaturas por debajo de los 25 grados inactivan a la enzima reversiblemente, pero arriba de los 55°C ocasionan la desnaturalización de la enzima y su inhibición se vuelve irreversible. En el pH está dentro de los límites, aunque se vio la máxima actividad enzimática a un pH de 5.5 y considerando los datos que a 5.6 ocurren cambio en el punto isoeléctrico. El efecto de la temperatura se comprobó, ya que se vio un crecimiento considerable a partir de los 26°C hasta llegar en el puto máximo de 45°. A 60° se vio una disminución considerable debido a que a esta temperatura la enzima se ve afectada.

Conclusión En esta práctica se siguió un procedimiento muy similar a la de actividad enzimática, pues en cuanto a los efectos de pH se pudo realizar el mismo proceso, únicamente cambiando los agregados por amortiguadores con distintos pH’s, así como invertasa y sacarosa, donde se pudo observar los cambios de coloración sin mayor problema una vez que los tubos fueron expuestos a ebullición y en donde también se llevó a realizar lectura en el espectrofotómetro. Para lo que fue sobre el efecto de la temperatura la incubación se realizó con distintas temperaturas para cada tubo, donde se hizo sin mayor problema y de igual manera fueron expuestos a ebullición donde se hizo el cambio de color sin mayor problema, estos tubos también fueron llevados a realizar lectura en el espectrofotómetro. Ambos procedimientos se realizar de forma exitosa y sin mayores dificultades, concluyendo entonces que de forma general se lograron los objetivos donde pudimos analizar dichos efectos que tenían

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estos factores sobre la actividad enzimática. Dichos factores podemos concluir que son dos de los más importantes, pues el pH siempre debe estar regulado para no alterar las funciones dentro del organismo, lo mismo que en el caso de la temperatura.

1.- La pepsina presenta su máxima actividad a un pH » 1. Mencione cuáles podrían ser los grupos funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminoácidos rompe los enlaces peptídicos. Hidroliza los enlaces peptídicos del grupo amino perteneciente a aminoácidos aromáticos, liberando fenilalanina, triptófano y tirosina. 2.- Si la concentración de sustrato en una reacción enzimática es igual a un 1/3 de Km. Cuál será la velocidad inicial de la reacción. 3.- De acuerdo a la clasificación de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la conversión de un azúcar de tipo aldosa a un azúcar de tipo cetosa: Es una óxido-reductasa, oxidando un grupo CHOH y reduciendo al mismo tiempo al C=O vecino. 4.- En esta práctica se ha observado cómo influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentración de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacárido y es un sustrato para esta enzima y se ha observado que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de concentración y pH. Cómo explicaría esta velocidad máxima tan baja en relación al pH de la reacción. ( a-Gal-a-Gal-a-Glu-ß-Fru ). 5.- Cuando las soluciones enzimáticas son calentadas, hay una pérdida progresiva de la actividad catalítica con el tiempo. Así, una solución de hexocinasa incubada a 45°C durante 12 minutos pierde el 50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45°C, en presencia de altas concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo, solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porqué de la variación desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia del sustrato. Porque el sustrato la mantiene activa, el efecto de la temperatura hace que la velocidad incremente, y como hay presencia de sustrato no se detiene hasta saturarse BIBLIOGRAFIAS:

Kennelly P, Rodwell V. Aminoácidos y péptidos. In: De león J, Romero G, editores. Harper: bioquímica ilustrada. 28 ed. Ciudad de México: Mc Graw Hill; 2010. p. 21-30. Debajyoti, D. (1980). Biochemistry. Academic Publishers: Washington. Chatterjea, M., Shinde, R. (2004). Textbook of Medical Biochemistry. London: Jaypee. Murray RK. Enzimas: mecanismo de acción. Harper bioquímica ilustrada. 29ed. Nueva York: McGraw-Hill; 2010. P. 51-61. McKee T, McKee JR. Enzimas. Bioquímica la base molecular de la vida. 5 ed. Nueva York: McGrawHill; 2014. p. 161-199....