Práctica 5 - ESTERILIZACIÓN Y SANITIZACIÓN PDF

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Práctica No. 5 ESTERILIZACIÓN Y SANITIZACIÓN Objetivo: Manejar el equipo de esterilización por calor húmedo, y el material microbiológico estéril y observar la diferencia entre esterilización y desinfección. Material: Horno de esterilización Autoclave Mechero Fisher Tubos de ensaye Matraz Erlenmeyer...

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Práctica No. 5 ESTERILIZACIÓN Y SANITIZACIÓN

Objetivo: Manejar el equipo de esterilización por calor húmedo, y el material microbiológico estéril y observar la diferencia entre esterilización y desinfección. Material:

Horno de esterilización Autoclave Mechero Fisher Tubos de ensaye Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Pipetas de 1.0 Y 5.0 ml. Tijeras  

Pinzas de disección de punta roma Algodón Papel estraza Hilasa Cajas Petri Hisopos estériles

Medios de cultivo: agar nutritivo, caldo y gelosa simple Cultivo microbiano: suspensión de E. coli

Análisis y discusión: Para llevar a cabo la esterilización con calor seco se hizo uso de ocho tubos de ensaye, los cuales fueron lavados perfectamente con agua y jabón, una vez secos se etiquetaron 2 tubos control, otros dos tubos a los 20 minutos, otros dos a 40 minutos y finalmente los últimos dos a 60 min. Se metieron al equipo para calor seco, a una temperatura de 180°C, esto con el fin de que el aire caliente esterilizara por completo los tubos, retirándolos a los tiempos en que estos fueron etiquetados. Estos se dejaron por una semana en el locker. Posterior a esto se preparó el caldo y el agar nutritivo, para la preparación del caldo nutritivo primeramente se leyó la etiqueta y de acuerdo a lo que esta indicaba se pesaron 0.8 g de caldo nutritivo, y se disolvió en 100 mL de agua. Se calentó ligeramente por 5 minutos y se dejó reposar. Mientras se dejó reposar se aprendió como hacer los tapones con ayuda de algodón y de gasa para tapar el matraz del caldo, con el fin de evitar que los matraces se contaminaran con agua o alguna otra partícula dentro de la autoclave. De igual manera se aprendió a hacer gorros de papel destraza para que en caso de que condensara algo de agua en la autoclave, esta no entrara al matraz y la contaminara. Una vez realizado esto se metió el matraz la autoclave para la esterilización por calor húmedo, para lo cual se comprobó que el nivel del agua de la autoclave fuera el adecuado, se cerró adecuadamente y se vigiló la salida de aire y de vapor por la válvula de escape. Mientras pasaba el tiempo en el autoclave, se aprendió como envolver el material de laboratorio que se iba a esterilizar, primeramente se envolvieron con papel destraza una caja micológica, una pipeta y unas pinzas aprendiendo así como deben de estar envueltos correctamente todos los materiales para evitar una posible contaminación. Se hizo uso de otro autoclave con el fin de esterilizarlos, sin embargo hubo una fuga en este equipo por lo cual no se esterilizaron correctamente los

instrumentos. Posteriormente una vez que los matraces que contenían el caldo y el agar nutritivo estéril se tomaron los ocho tubos de calor seco, y se vaciaron aproximadamente 5 mL del caldo nutritivo a cada uno de los tubos, esto se realizó cerca del mechero con el fin de que no existiera ninguna contaminación en estos, ya que el fuego hace que el aire se mueva lejos del mechero por lo que exista una zona de esterilización en un radio de 30 cm. Una vez que los ocho tubos contuvieran el caldo nutritivo se incubaron a 37°C por dos días. Sin embargo no se observó cambio alguno, ni crecimiento de microorganismos, sólo hubo un ligero cambio en el color de la solución en el tubo control y en el tubo de los 60 minutos se observó una ligera turbidez, que puede indicar la presencia de algún microorganismo, sin embargo algo a lo que se atribuye que no haya crecido ninguno es a que los tubos se lavaron perfectamente bien antes de esterilizarlos, sin embargo esto no es suficiente para explicar que tampoco en el tubo control que no se esterilizó no hayan crecido microorganismos. Posteriormente para la parte de desinfección se tomó una caja Petri y en la zona de esterilización se colocó cierta cantidad de agar en esta, y se esperó a que solidificara, posteriormente se dejó a incubar a 37°C por un día. Al día siguiente se hizo la prueba de desinfección en donde se tomó con ayuda de un hisopo estéril una muestra de una parte de la mesa de laboratorio, se hizo un frote en la caja Petri anterior, posteriormente se tomó otra muestra en de la mesa pero ya desinfectada con ayuda de toallitas desinfectantes Clorox y se realizó otro frote sobre otra caja Petrix. Se dejó incubar por un día a 37°C observando crecimiento en la primera caja, antes de la desinfección. Tal como se observa en la imagen anterior.

Lo cual indica que el agar nutritivo estaba ésteril, así como las toallitas desinfectantes de Clorox tienen un gran poder de desinfección. Campana de flujo laminar En los laboratorios de biología se emplean tres tipos de campanas, una es la campana de extracción de gases, la campana de flujo laminar y las campanas de seguridad biológica. Por un lado la campana de gases captura los humos y los vapores procedentes de la manipulación de los productos químicos en el laboratorio, sin embargo esta no ofrece alguna protección frente a riesgos biológicos. Las campanas de flujo laminar son recintos que emplean un

ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas campanas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un laboratorio de Microbiología clínica. Sin embargo, son un instrumento de trabajo imprescindible en las zonas limpias. Estas campanas están diseñadas para proporcionar un aire limpio y constante a una velocidad de paso de aire de 0.30 a 0.50 metros por segundo para así barrer la superficie de la zona de trabajo y evitar la suspensión de partículas así como una posible contaminación de las muestras. El aire es inyectado a la zona de trabajo a través de un filtro HEPA o ULPA e insuflado en forma de un flujo laminar o flujo unidireccional, muy suave, hacia el usuario. La superficie de trabajo de la cabina se construye generalmente de acero inoxidable grado 304 o superior para facilitar su limpieza y aumentar su durabilidad por el uso, con acabados sanitarios, sin espacios o juntas donde las esporas pueden llegar a acumularse. Las campanas de flujo laminar pueden tener una lámpara de rayos ultravioleta-C con acción germicida para esterilizar el recinto y su contenido, cuando no se utiliza. Es importante apagar la lámpara durante la utilización de la cabina, ya que rápidamente se producirían quemaduras de sol en la piel expuesta, y también puede causar cataratas oculares.

Conclusiones y sugerencias: Se alcanzó el objetivo de la práctica con éxito ya que se aprendió el manejo correcto del equipo de esterilización por calor húmedo así como del material microbiológico estéril y se aprendió y observó la diferencia entre esterilización y desinfección. De igual manera pudimos realizar la correcta esterilización de los medios de cultivo, que fue el caldo nutritivo y el agar nutritivo. Además de poder comprobar el poder desinfectante de productos que usamos para desinfectar las mesas de trabajo como lo son las toallitas Clorox.

La práctica me pareció muy interesante ya que pudimos aprender la manera correcta de esterilizar los instrumentos de laboratorio, así como aprender a manejar el equipo de esterilización. El tiempo fue el correcto para la culminación de la práctica.

Cuestionario: 1)

¿Cuál es la diferencia entre esterilización y desinfección. Principalmente lo que diferencia una de otra es que en la esterilización se asegura la muerte de todos los microorganismos, mientras que en la desinfección no es así, sólo se mueren los microorganismos patógenos. Hay que recordar que la esterilización garantiza la eliminación de cualquier agente patógeno y no patógeno en una superficie determinada. Es importante entender que no se puede determinar de una manera absoluta que la esterilización de algo sea completa, pero sí se puede reducir tanto la probabilidad de que algo este contaminado hasta el punto de decir que está “esterilizado”. Por otro lado la desinfección es un proceso que elimina la mayoría o todos los microorganismos sobre los objetos inanimados con la excepción de esporas

bacterianas. Se efectúa por medio de agentes químicos, clasificados en tres categorías: alta, intermedia y baja, según la intensidad de su acción. 2)

Describe el mecanismo de acción de dos agentes esterilizantes físicos y dos químicos. Agentes esterilizantes físicos:  Calor seco: El mecanismo de acción microbicida se basa en la acción oxidante del aire seco caliente que circula por convección forzada a través de los productos. La muerte microbiana se produce como consecuencia de mecanismos de transferencia de energía y oxidación. El agente esterilizante en el calor seco es el aire caliente. El calor desnaturaliza estructuras y macromoléculas (membranas, proteínas, etc.). Todos los microorganismos son susceptibles a la acción del calor. Su sensibilidad varía con la especie y con el estado en que se encuentren. En general las formas vegetativas bacterianas mueren por calentamiento a 50-70ºC. Las endosporas, (las formas de vida más termoresistentes), requieren mayores temperaturas y tiempo de exposición. Su acción letal se debe a la oxidación de componentes celulares. El aire es mal conductor del calor y el aire caliente entra más lentamente que el vapor en los materiales. Por ello se requiere más temperatura y tiempo de exposición que en la esterilización con calor húmedo. Puede utilizarse mediante flameado (incineración) o con hornos de aire caliente.  Radiaciones ionizantes: Este procedimiento es muy usado en el que el uso de las radiaciones gamma se logre la esterilización en frío (debido a que los otrso procedimientos señalados emplean temperauras altas) o radioesterilizacion. Tiene su indicación cuando se trata de material que puede estropearse por el calor, siendo el prototipo las jeringas de uso único, de plástico o de caucho desechables, o los catéteres para uso intravenoso, cada vez más utilizado por su bajo precio, por la comodidad de su uso, ya que las agujas que portan no sufren daño alguno a su filo y bisel (siendo prácticamente indoloras) y porque evitan toda posibilidad de infección hospitalaria y de hepatitis infecciosa. Se trata de instalaciones de gran rendimiento, a base de cobalto 60. Por su poder penetrante esterilizan todo el material envuelto en envases de plástico e introducido en cajones de cartón o madera. Agentes esterilizantes químicos:  Óxido de etileno: Se presenta en forma gaseosa, mezclado con freón o CO2. Tiene un tiempo de actuación de 3-8 horas y una presión de 1-2 atm. Mata los gérmenes por alquilación, o sea, sustituyendo un átomo de Hidrógeno por un radical hidroxil. El proceso de esterilización es automática y posee dispositivos de seguridad que no permiten abrir las puertas, mientras haya presión en el interior de la cámara. Las estufas, cámaras o autoclaves que emplean el óxido de etileno se usan cada vez más, por su utilidad específica de actuar a bajas temperaturas, lo que permite tener material estéril que puede quedar estropeado por temperaturas altas, con ciclos de esterilización relativamente cortos, permitiendo unas tres cargas al día. Las máscaras de anestesia, tubos de intubación endotraqueales, guantes, catéretes de goma o plástico, equipos de perfusión y transfusión, sondas uretrales, catéteres y goteros diversos, jeringas de plástico con sus agujas, pueden ser esterilizados muy eficazmente en estas cámaras. Como el material ha de conservarse estéril, debe estar incluido en una bolsa de material

plástico, de polietileno o polipropileno, que se cierra por un procedimiento termoeléctrico, permitiendo así su manejo y traslado hasta tanto que no se abra: es necesario que el material que se lleva a esterilizar esté totalmente limpio y seco, así como su aireación posterior antes de su empleo, pues su contacto con la piel, mucosas o heridas puede resultar irritante, por conservar restos de glicoles.  Formaldehído: Inactiva microorganismos a través de la alcalinización de las proteínas. Se presenta en concentraciones del 40%. La solución acuosa es bactericida, tuberculicida, fungicida, esporicida y virucida. Según su dilución actuará como esterilizante, luego de un tiempo prolongado o como desinfectante de alto nivel. Se lo utiliza para la inactivación de bacterias en los sistemas de distribución de agua tratada de los servicios de Hemodiálisis. Si se lo emplea en la reutilización de membranas su concentración será del 4%, con un tiempo de contacto de 24 Hs. como mínimo. Debe tenerse presente que los filtros deben ser enjuagados cuidadosamente antes de usarse. Resultan convenientes monitoreos periódicos de formaldehído residual. Las pastillas de formalina no deben utilizarse en cajas de instrumental, guantes, etc. Su acción germicida solo se produce en la vaporización por calor. Actualmente se desaconseja su uso en quirófanos o habitaciones de pacientes, por ser no solo un procedimiento riesgoso (efecto carcinogénico) sino también ineficaz. 3)

¿Por qué es importante cuidar la presión y la temperatura en el proceso de esterilización? Justifique su repuesta.

Una esterilización segura con calor húmedo requiere temperaturas mayores a las del punto de ebullición del agua. Estas temperaturas son comúnmente alcanzadas por el vapor bajo presiones elevadas en un autoclave. Cuando la presión de un gas aumenta, la temperatura del gas aumenta proporcionalmente. Como el vapor de agua es un gas, aumentar su presión en un sistema cerrado aumenta su temperatura. Como las moléculas de agua están más energizadas, su penetración aumenta sustancialmente. Ocupar el autoclave es el método preferido para la esterilización, a menos que el material que se necesite esterilizar pueda ser dañado por el calor o la humedad. Un ejemplo de esto son algunos plásticos que se pueden derretir o algunos objetos filosos los cuales pierden su filo. La temperatura alcanzada en el autoclave son 121.5 °C y una presión de 15 lb/inˆ2, por lo tanto el tiempo requerido para la destrucción de la mayoría de las bacterias resistentes es aproximadamente 15 minutos. Para objetos más densos, serán requeridos más de 30 minutos, sin olvidar que las condiciones deben de ser controladas cuidadosamente para asegurar la correcta esterilización. La mayor ventaja que posee este método de esterilización es que el tiempo de exposición de los materiales a esterilizar es más corto que el calor seco. Actividad de síntesis: Elaborar un cuadro diferenciando las propiedades de los agentes químicos como antisépticos y desinfectantes Agentes químicos antisépticos Los antisépticos se usan sobre la piel,

Agentes químicos desinfectantes Son productos ampliamente utilizados

con el fin de eliminar o disminuir la flora residente o transitoria de la misma Los agentes químicos antisépticos están hechos principalmente para que no resulten tóxicos al contacto con la piel Los antisépticos son de amplio espectro Estos son inocuos a tejidos vivos Son rápidos y eficaces en materia orgánica Producen la muerte o la inhibición celular, en las bacterias por oxidación, hidrólisis e inactivación de enzimas, con pérdida de constituyentes celulares Son más selectivos Son los únicos de uso en tejidos vivos



para la destrucción de los microorganismos que habitan sobre una superficie inanimada, con excepción de las esporas bacterianas. Algunos agentes químicos desinfectantes resultan tóxicos al contacto con la piel Los agentes desinfectantes tienen una gran rapidez de acción Estos no son inocuos a tejidos vivos No son tan rápidos ni eficaces en la materia orgánica Actúan como desnaturalizantes o precipitantes de proteínas, inhiben enzimas y causan muerte celular Son más potentes, más rápidos y termoestables que los antisépticos Algunos son más tóxicos

Describir el mecanismo de acción de los agentes químicos para eliminar a los microorganismos

El mecanismo de acción de los agentes químicos varía dependiendo del agente químico del que se trate, por ejemplo el mecanismo de acción de un alcohol es la desnaturalización de proteínas; principalmente a nivel de membrana celular y también a nivel citoplasmático. Por lo que puede hacer disrupción de la membrana celular o alteración de la función de la una proteína citoplasmática (es decir, una enzima); o bien un daño meramente estructural, que tienden a producir la muerte de estos microorganismos. Otro ejemplo es la clorohexidina, la cual se adsorbe en la superficie, causa fuga de moléculas pequeñas y la precipitación de proteínas citoplasmáticas. Tiende a producir muerte de los microorganismos, y son de muy baja toxicidad para las células hospederas (definición de un antiséptico). El mecanismo de acción de los aldehídos es como agentes alquilantes de proteínas y de ácidos nucleicos. De igual manera el de los compuestos de aminas cuaternarias lleva a cabo inactivación de enzimas, principalmente las implicadas con la producción energética celular. Referencias bibliográficas: 1. 2. 3. 4.

Prescott, L. M. (1999). Microbiología. 4ª ed. Editorial McGraw – Hill Interamericana. Págs. 137 – 151 Block, S. S. 1999. Disinfection, Sterilization and Preservation. 4 th. Ed. Philadelphia: Lea and Febiger Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston: Butterwortths Marsik, F. J. and Denys, G. A. 1995. Sterilizatión, decontamination and disinfection. Procedures for the Microbiology Laboratory. In Manual of Clinical Microbiology. 6 th. Ed. P. R. Murray Editors, Washington, D. C. American Society for Microbiologý. P. 86 – 90...