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CRECIMIENTO MICROBIANO

Tema 11

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OBJETIVO

Tema 11

Estudiar la división celular en bacterias y arqueas Crecimiento de microorganismos y parámetros que lo definen Fases de una curva de crecimiento característica Tipos de crecimiento Métodos de medida del crecimiento microbiano

BIBLIOGRAFÍA

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- MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., BENDER, K.S., BUCKLEY, D. H. & STAHL, D.A. 2015. “Brock. Biología de los microorganismos”. 14ª ed. Ed. Pearson Capítulo 5 - MARTÍN, A., BÉJAR, V., GUTIÉRREZ, J.C., LLAGOSTERA, M. y QUESADA, E. 2019. “Microbiología Esencial”. Ed. Panamericana Capítulos 11 y 12 - TORTORA, G.J., FUNKE, B.R. & CASE, C.L. 2017. “Introducción a la Microbiología”. 12ª ed. Ed. Médica Panamericana Capítulo 6 - WILLEY, J.M., SHERWOOD, L.M. & WOOLVERTON, C.J. 2014. “Prescott`s Microbiology”. 14th ed. Ed. McGrawHill Capítulo 7

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Crecimiento microbiano y división celular Crecimiento microbiano: incremento del número de células  reproducción • Reproducción en bacterias y arqueas: siempre asexual • Reproducción en eucariotas: asexual y/o sexual

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Reproducción 1. Replicación del DNA y segregación de los cromosomas - Bacterias y arqueas: no mitosis ni meiosis - Eucariotas: mitosis y/o meiosis 2. Citocinesis: formación del tabique o septo (septación)

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División celular en bacterias y arqueas: • Fisión binaria (más frecuente) • Otros mecanismos de división en bacterias: - división múltiple (Nocardia, Bdellovibrio) - gemación (Hyphomicrobium) - esporas (Streptomyces)

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División celular en diferentes bacterias

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4. Esporas reproductoras: Streptomyces

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Ciclo celular en bacterias y arqueas • El ciclo celular se define como la secuencia completa de acontecimientos que se suceden desde la formación de una nueva célula hasta la siguiente división celular • Se divide en tres etapas: 1. Crecimiento: desde el “nacimiento” de la célula hasta el inicio de la replicación del cromosoma (período B) 2. Replicación del cromosoma (período C) (véase Tema 4) 3. División celular: desde el final de la replicación hasta la división celular (período D) • La duración del ciclo celular se considera el tiempo de generación (g) ©Microbiología.Fac.Ciencias

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Cuando las bacterias se están dividiendo activamente pueden iniciarse nuevas fases de replicación antes de que la primera fase de replicación y citocinesis finalice

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Fisión binaria: ciclo celular en E. coli (I) Elongación de la célula, replicación del cromosoma y segregación de los nuevos cromosomas a polos opuestos de la célula hasta que se forma un tabique o septo que la divide en dos células hijas cada una de las cuales recibe un cromosoma y todos los constituyentes celulares para existir de forma independiente

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División celular: comprende la segregación cromosómica y la citocinesis (septación) que dará lugar a la formación de dos nuevas células. Ambos procesos pueden estar parcialmente solapados en el tiempo ⁃ Segregación: Mecanismo aún no dilucidado. Existen varios modelos en diferentes especies bacterianas

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Fisión binaria: ciclo celular en E. coli (II): citocinesis • • •

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La replicación cromosómica y la citocinesis están reguladas de manera coordinada y la septación no se produce hasta que la replicación se ha completado La citocinesis se inicia antes de que la segregación del cromosoma se complete La septación se divide en varias etapas: 1. Selección del sitio donde se formará el septo (posicionamiento del anillo Z) 2. Ensamblaje del anillo Z, formado por las proteínas del citoesqueleto FtsZ 3. Ensamblaje del anillo Z a la membrana plasmática 4. Ensamblaje de la maquinaria de síntesis de pared celular 5. Constricción de la célula y formación del septo ©Microbiología.Fac.Ciencias

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Citocinesis • •

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La proteína FtsZ (análoga a la tubulina) polimeriza para formar para formar el anillo Z El anillo Z debe formarse en el lugar y momento apropiado, ya que será el plano de división de la célula y debe asegurar la segregación de los dos cromosomas intactos La localización del punto donde se formará el anillo FtsZ y el momento en que tendrá lugar se realiza por dos mecanismos: ⁃

⁃

Proteínas Min (CDE) (exclusivas del citoesqueleto de bacterias), que limitan la formación del anillo FtsZ al centro de la célula, entre los dos cromosomas, bloqueando las divisiones cerca de los polos celulares. Oclusión por el nucleoide: mecanismo que asegura que el anillo Z solo se forma después que los cromosomas hijos se han segregado. Está mediado por una proteína que se une en un punto próximo al origen de replicación; esta proteína impide la polimerización de FtsZ. Esta proteína se mueve hacia los polos con los cromosomas hijos, permitiendo que se forme el anillo Z en el centro

Localización de la formación del anillo Z y el divisoma por las proteínas Min

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Citocinesis (cont.) Una vez formado el anillo Z, interacciona con otras proteínas (más de 20) implicadas en el proceso de division para formar el divisoma • En primer lugar, una o más proteínas unen el anillo Z a la membrana plasmática (Zip A, FtsA) • Otras proteínas están implicadas en síntesis del peptidoglicano, separación de los cromosomas, etc

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El divisoma dirige la síntesis del nuevo material de membrana y de pared celular para ir formando un septo de división en el centro de la célula Los pasos finales de la división implican la constricción del anillo Z, invaginación de la membrana citoplasmática y síntesis de la pared del septo Finalmente, la célula elongada se divide dando dos células hijas

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Crecimiento celular y determinación de la forma celular en bacterias

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Bacilos • La forma depende de dos procesos: – elongación de la célula, mediada por MreB – la división en el plano central mediada por FtsZ • La proteína MreB (análoga de la actina) es el principal factor determinante de la forma bacilar de las bacterias – Forma un citoesqueleto simple con filamentos alrededor del interior de la célula, justo debajo de la membrana citoplasmática – Los filamentos de MreB se mueven de un lado a otro del cilindro bacilar perpendicularmente al eje mayor, iniciando la síntesis de pared en los puntos en que entra en contacto con la membrana, de manera que la elongación de un bacilo se produce únicamente a lo largo de su eje mayor – La inactivación de gen que codifica MreB en los bacilos hace que estos tengan forma de coco (esférica)

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MreB como determinante de la morfología celular

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Determinación de la forma celular en bacterias •

Cocos – Las bacterias en forma de coco carecen del gen para MreB – Localización adecuada del septo durante la división celular, dependiente de FtsZ – Crecimiento del nuevo material de pared desde el anillo FtsZ ©Microbiología.Fac.Ciencias

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Determinación de la forma celular en bacterias Vibrios • La bacteria Caulobacter crescentus posee, además de MreB y FtsZ, una proteína denominada crescentina determinante de su forma curvada. Se han encontrado proteínas similares a la crescentina en otras bacterias curvadas • La crescencita se localiza en un lado de la célula, donde disminuye la inserción de nuevas subunidades de peptidoglicano en la red de peptidoglicano. Como resultado se produce un crecimiento asimétrico de la pared celular que conduce a la curvatura característia de esta forma celular

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Concepto de crecimiento exponencial • Crecimiento exponencial: crecimiento de una población microbiana en el que en cada intervalo fijo de tiempo se duplica el número de células • Durante el crecimiento exponencial el incremento en el número de células es inicialmente lento pero aumenta cada vez más con el tiempo • •

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Generación: cada vez que una población se duplica Tiempo de generación (g): tiempo transcurrido en el proceso en que una población se duplica Número de generaciones (n): n = t/g

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Velocidad de crecimiento de un cultivo microbiano

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• La mayoría de los procariotas tienen tiempos de generación (g) más cortos que los microorganismos eucariotas • Para un microorganismo determinado, el tiempo de generación en cultivo depende del medio de crecimiento y de las condiciones de cultivo

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Expresión matemática del crecimiento microbiano Parámetros del crecimiento: Tiempo de generación o de duplicación : g = t/n Número de generaciones: n = t/ g Constante de la velocidad de crecimiento (k) = número de generaciones microbianas por unidad de tiempo: k = n/t  k = 1/ g 1 2 4 8 16 …  20 21 22 23 …2n N = N 0 2n

k= n/t

n = log N – log N0 log 2

k = log N – log N0 log 2 . (t-t0)

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log N = log No + n log 2

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Expresión matemática del crecimiento microbiano

• Si hacemos una representación del logaritmo del nº de células (N) frente al tiempo obtenemos una recta; la pendiente de esa recta es la tasa de crecimiento específico 

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 = logNt – logNo t – to

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Relaciones entre los distintos parámetros k = log N – log N0 log 2 . (t-t0)

 = logNt – logNo t – to

k=  / log 2 = k / log 2 Como k = 1/g; g = 1/k ©Microbiología.Fac.Ciencias

g = log 2 /   = log 2 / g

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Curva de crecimiento en ambientes cerrados (batch)

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Crecimiento diáuxico

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Cultivo continuo: quimiostato • Cultivos continuos: son sistemas abiertos con una entrada continua de medio fresco y una retirada continua de productos de desecho, células y nutrientes no utilizados. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento se prolonga indefinidamente cuando se establecen las condiciones de equilibrio (stady-state) en las que el volumen de cultivo y el número de células permanecen constantes

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• Quimiostato: es el aparato más utilizado para cultivo continuo. El volumen de cultivo se mantiene constante, añadiendo continuamente medio fresco a una velocidad constante y retirando continuamente medio usado a la misma velocidad – La tasa de crecimiento y la densidad de población pueden controlarse de modo independiente y simultáneo en función de dos factores: • Tasa de dilución (D): velocidad con que se bombea el medio fresco y se retira medio gastado; D= F/V (F= tasa de flujo; V= volumen) • Concentración de un nutriente limitante

Cultivo continuo: quimiostato

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Tasa de dilución y concentración de biomasa en un quimiostato D= F/V (D= tasa de dilución; F= tasa de flujo; V= volumen) dN/dt = N – DN dN/dt = (-D) N

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 < D  > D  = D

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Métodos de medida del crecimiento microbiano Recuento del número total de células ˗ Recuento directo al microscopio óptico o de contraste de fases ˗ Recuento en un microscopio de fluorescencia ˗ Recuento en un contador electrónico de partículas o en un citómetro de flujo

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Recuento de células viables ˗ Recuento en placa o recuento de colonias ˗ Recuento en filtros de membrana

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Medida de la masa celular − Métodos directos: peso seco − Métodos indirectos: turbidimetría

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Recuento microscópico directo - Recuento en cámara

To calculate number per milliliter of sample: 12 cells  25 large squares  50  103

Ridges that support coverslip Coverslip

Number /mm2 (3  102) Sample added here; care must be taken not to allow overflow; space between coverslip and slide is 0.1 mm

Cámara de recuento de Petroff-Hausser

Number /mm3 (1.5  104) Number /cm3 (ml) (1.5  107)

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Microscopic observation; all cells are counted in large square (16 small squares): 12 cells (in practice, several large squares are counted and the numbers averaged.)

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Limitaciones del recuento microscópico

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• No distingue entre células vivas y células muertas sin tinciones específicas • Pueden pasarse por alto las células pequeñas • Es difícil conseguir precisión • Si no se usan tinciones se requiere un microscopio de contraste de fases • Las suspensiones celulares de baja densidad son difíciles de contar • Las células móviles deben ser inmovilizadas • Los restos presentes en la muestra pueden ser confundidos con células

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Recuento en microscopio de fluorescencia •

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Fluorescencia: propiedad que tienen ciertos compuestos químicos de absorber luz a una longitud de onda y emitirla a una mayor longitud de onda; por ejemplo, absorben luz UV (de longitud de onda corta, invisible al ojo humano) y emiten luz visible de mayor longitud de onda Un objeto fluorescente al recibir luz aparece como un cuerpo brillantemente coloreado Hay fluorescencia natural o autofluorescencia (sustancias halladas en las células, como las clorofilas) o secundaria por tinción con colorantes fluorescentes o fluorocromos Utilizando fluorocromos adecuados pueden diferenciarse las células vivas de las muertas y también tipos diferentes de microorganismos en la misma muestra Muy utilizado en diagnóstico clínico y en ecología microbiana

Microscopía de fluorescencia

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Cianobacterias observadas por un microscopio de campo claro (a) y por un microscopio de fluorescencia (546 nm) (b) Células de E. coli teñidas con el colorante fluorescente DAPI (c)

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Células vivas (verdes) y muertas (rojas) de Micrococcus luteus (coco) y Bacillus cereus (bacilos)

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Recuento de células totales •

Utilización de un contador electrónico de partículas

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Utilización de un citómetro de flujo – Usa un rayo láser, colorantes fluorescentes y un sistema electrónico para contar células individuales – Analiza miles de células por segundo – Examina parámetros celulares específicos como tamaño, forma o propiedades fluorescentes de las células (fluorescencia intrínseca o por tinciones fluorescentes) – Pueden diferenciarse células viables de no viables – Puede realizar análisis multiparamétricos

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Recuento de células viables • •

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Una célula viable es la que es capaz de reproducirse y originar descendencia Recuento en placa o recuento de colonias: cada célula viable dará origen a una colonia al sembrar en placa en el medio adecuado. Por tanto, el número de células y el número de colonias son proporcionales – Los resultados se dan en UFC (unidades formadoras de colonias) – Hay al menos dos maneras de realizar un recuento en placa para viables: • Método de extensión en placa (o siembra en superficie) • Método de vertido (o siembra por inclusión) – Para obtener un número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra – Anomalía del recuento en placa: en muestras naturales el recuento en placa es generalmente muy inferior al recuento microscópico directo

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Recuento en placa o recuento de colonias Spread-plate method (Extensión)

Surface colonies

Incubation

Sample is pipetted onto surface of agar plate (0.1 ml or less)

Sample is spread evenly over surface of agar using sterile glass spreader

Pour-plate method

Typical spread-plate results

(Vertido) Surface colonies

Sample is pipetted into sterile plate

Sterile medium is added and mixed well with inoculum

Subsurface colonies Typical pour-plate results

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Solidification and incubation

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Uso de diluciones seriadas para la determinación de viables

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Recuento en filtros de membrana

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Turbidimetría • • •

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Un método indirecto, rápido y practico de medir el crecimiento microbiano es la medida de la turbidez Las células, como cualquier partícula, dispersan la luz. Cuantas más células hay más se dispersa la luz y más turbia es una suspensión La turbidez se mide con un espectrofotómetro, haciendo pasar la luz a través de la suspensión celular y midiendo la luz no dispersada en unidades de Densidad Óptica [D.O. = log (Io/I)] Es una estimación indirecta de la masa celular, no un recuento

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Bajo ciertas condiciones, se puede relacionar la densidad óptica con el número de células, para lo cual hay que preparar una curva de calibración

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– No distingue células vivas de células muertas o de partículas en suspensión

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