Quaderno di laboratorio PDF

Preview

Summary

Download Quaderno di laboratorio PDF

Description

QUADERNO DI LABORATORIO GIORNO 1 PARTE 1: misurare piccoli volumi utilizzando pipette Gilson Trasferire da un becher ad una navicella da bilancia 500 μl, 150 μl e 10 μl di acqua e pesarli. Nel frattempo, calcolare il peso atteso tramite l’utilizzo del valore di densit à dell’acqua (1 g/ml). Una volta determinato il peso atteso, e verificato il peso materiale, calcolare la deviazione standard. Realizzare una tabella contenente i risultati:

Volume (μl)

Peso (g)

Peso atteso (g)

Deviazione standard (%)

500

0,5005

0,5000

+0,1

150

0,1490

0,1500

-0,66

10

0,0060

0,0100

-40

Calcolo del peso atteso: 1. Peso atteso= densità x peso = 1,0 g/ml x 0,500 ml = 0,5000 g 2. Peso atteso= 1,0 g/ml x 0,150 ml = 0,1500 g 3. Peso atteso= 1,0 g/ml x 0,010 ml = 0,0100 g Calcolo della deviazione standard: 1. Dev. St. = (peso – peso atteso) x 100= (0,5005g – 0,5000g) x 100= 0,1% 2. Dev. St. = (0,1490g – 0,1500g) x 100= -0,66% 3. Dev. St. = (0,0060g – 0,0100g) x100= -40%

PARTE 2: cromatografia con il blu di destrano Il destrano è un polimero vegetale che una volta associato ad un colorante blu viene definito blu di destrano. Per effettuare l’esperimento viene utilizzata una colonna contenente la matrice. Viene utilizzata inoltre una soluzione salina acquosa: Buffer. 

Aggiungere lentamente 750 μl di blu di destrano alla colonna. Si può notare che in maniera molto rapida il blu di destrano defluirà attraverso la matrice.



Aggiungere lentamente alla matrice anche 750 μl di buffer.



Rimuovere il tappino inferiore della colonna e riempire 1,5 ml di provetta Eppendorf. In seguito, riempire una seconda provetta Eppendorf finché il menisco della soluzione contenuta nella colonna non giunge al livello della matrice (questa seconda Eppendorf verrà riempita circa a metà). Chiudere nuovamente la colonna con l’apposito tappino.

QUADERNO DI LABORATORIO 

A questo punto aggiungere lentamente alla colonna 15 ml di Buffer.



Rimuovere nuovamente il tappino inferiore della colonna e, facendo sgocciolare, riempire 12 Eppendorf numerandole. Preparare inoltre una provetta Eppendorf contenente solo Buffer e contrassegnarla con la lettera B.



Aggiungere 10 ml di buffer alla colonna per evitare che la matrice si secchi.



Trasferire 1 ml di ciascuna frazione presente nelle Eppendorf nella cuvetta analogamente contrassegnata.



Misurare l’assorbanza A di ogni cuvetta tramite l’utilizzo di uno spettrofotometro. Precedentemente calibrare lo spettrofotometro utilizzando la cuvetta contenente solo Buffer.

Lo scopo dell’esperienza è calcolare la concentrazione di blu destrano presente in ogni cuvetta, per fare ciò occorre tenere presente la formula che descrive il legame tra assorbanza e concentrazione: A=l c ; dove = 0,823 g/dm3 , l è il cammino ottico e c è la concentrazione. Realizzare una tabella che riassuma il procedimento per arrivare a determinare il valore di concentrazione di ogni cuvetta.

Assorbanza misurata

A. buffer – A. cuvetta n

Concentrazione blu destrano

Cuvetta B

-0,0050

/

/

Cuvetta 1

-0,0026

-0,0026 – 0,0050 = -0,0076

-0,9235

Cuvetta 2

0,0500

0,0500 – 0,0050 = 0,0450

5,468

Cuvetta 3

0,2456

0,2456 – 0,0050 = 0,2406

29,23

Cuvetta 4

0,3655

0,3655 – 0,0050 = 0,3605

43,80

Cuvetta 5

0,0247

0,0247 – 0,0050 = 0,0197

2,394

Cuvetta 6

-0,0084

-0,0084 – 0,0050 = -0,0134

-1,628

QUADERNO DI LABORATORIO

Cuvetta 7

-0,0142

-0,0142 – 0,0050 = -0,0192

-1,118

Cuvetta 8

-0,0215

-0,0215 – 0,0050 = -0,0265

-2,333

Cuvetta 9

-0,0235

-0,0235 – 0,0050 = -0,0285

-3,220

Cuvetta 10

-0,0246

-0,0246 – 0,0050 = -0,0296

-3,463

Cuvetta 11

-0,0259

-0,0259 – 0,0050 = -0,0309

-3,755

Cuvetta 12

-0,0271

-0,0271 – 0,0050 = -0,0321

-3,900

curva del blu di destrano

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 12 -0.05 -0.1

I valori negativi di A ottenuti indicano che la frazione di campione che ha assorbito meno del bianco. Se consideriamo le imprecisioni causate dagli spettrofotometri, i valori poco negativi sono dovuti alle fluttuazioni.

PARTE 3: TLC per la separazione ed identificazione dei lipidi Estrazione dei lipidi:    

Sotto cappa per ogni 200 µl di campione aggiungere 750 µl di soluzione diluita 1:2 di CHCl3 : CH3OH e vortexare energicamente Aggiungere 250 µl di CHCl3 e invertire la provetta Aggiungere 250 µl di H20 e invertire bene e a lungo Centrifugare a 13000 rpm per 5 minuti ottenendo in questo modo due fasi (parte acquosa e parte organica)

QUADERNO DI LABORATORIO 

Prelevare con P1000 la fase di fondo. Per semplificare l’operazione si imposta la P1000 a 250 µl e si preleva la fase superiore per poi buttarla. In seguito, si prelevano 250 µl della fase inferiore. Essa viene riposta in una provetta Eppendorf.

Preparazione lastra per TLC: Sulla linea di origine vengono disegnati i punti di semina: uno per ogni gruppo, con l’aggiunta di un altro dove è stato seminato un campione di H2O diluito secondo lo stesso protocollo. Quest’ultimo campione vale da controllo negativo, in quanto nell’acqua non deve essere registrata nessuna presenza di lipidi. Solventi utilizzati: Solvente 1: miscela di cloroformio, etanolo, acido acetico, H20 Solvente 2: miscela di eptano, acido acetico, dietilene. Esso è più idrofobico del primo. Cromatografia TLC: 

  

Semina: con P20 prelevare 30 µl di campione e per 6 volte, toccando col puntale la lastra, rilasciare sullo stesso punto di semina 5 µl del campione. Tra una volta e l’altra è necessario aspettare che il campione si secchi, per permettere allo strato sottile di silice di assorbirlo poco per volta. Se si rilasciasse tutto il contenuto del campione in una sola volta si creerebbe una macchia troppo estesa e poco concentrata I lipidi correranno con diverse velocità in base alla loro diversa affinità con la fase mobile e la fase stazionaria. Si utilizza come fase mobile prima il solvente 1, successivamente il solvente 2. Siccome i lipidi non sono visibili ad occhio nudo, la lastra viene immersa in una prima vasca con colorante blu e si agita per 10 minuti. Successivamente si immerge la lastra in una seconda vasca con il decolorante e si agita per qualche minuto. Si lascia asciugare la lastra

Conclusioni: Tale esperimento è stato condotto dal professore. Al termine abbiamo dunque potuto osservare il risultato sperimentale riportato nell’immagine seguente. Le sostanze hanno effettuato la propria corsa in maniera corretta.

QUADERNO DI LABORATORIO

GIORNO 2 PARTE 1: omogeneizzazione / chiarificazione / filtrazione del lisozima d’uovo Rompere l’uovo dividendo il tuorlo dall’albume. Trasferire l’albume in un cilindro per poterne misurare il volume, diluirlo poi 1:5 con Buffer (nel nostro caso vengono utilizzati 92 ml di Buffer). Trasferire il tutto in un omogeneizzatore per rendere la soluzione più omogenea tramite la rottura dei legami. Raccoglierle il tuorlo d’uovo in un becher e diluirlo con acqua. Dopo averlo diluito dividerlo in Eppendorf.

Successivamente verificare colonna e volume vuoto:



aprire la colonna e lasciar uscire buffer fino ad arrivare al livello della matrice



aggiungere al top lentamente con una pipetta 1 ml destrano solfato



aprire il rubinetto e far entrare in colonna raccogliendo le frazioni



chiudere e stratificare lentamente senza mescolare 15 ml di column buffer



aprire e raccogliendo il liquido in uscita in frazioni da 1,5 ml e segnare quando esce il colorante blu, verificando che il destrano o corra come una banda, se la corsa è irregolare la colonna è caricata male



lavare la colonna aggiungendo delicatamente 20 ml di tampone



chiudere la colonna lasciando 0,1 cm di liquido

A questo punto raccogliere in una provetta 3 ml di albume bufferato e unirli a 3 ml di Buffer, mescolare e trasferire 4 ml della soluzione appena creata in colonna (controllando che la colonna sia chiusa) e conservare i 2 ml restanti. Aggiungere inoltre in colonna, in maniera molto lenta e cauta, 25 ml di buffer. A questo punto aprire la colonna e riempire 15 eppendorf numerate da 1ml. Conservare il tutto a 4°C.

QUADERNO DI LABORATORIO (Questa prima parte è stata in realtà svolta durante il primo giorno di lezione in laboratorio, dunque tutte le eppendorf preparate vengono conservate durante la notte a 4°C.) In seguito, occorre determinare l’attività enzimatica e la concentrazione proteica sul campione di partenza e su tutte le frazioni in uscita dalla colonna. A questo scopo: 

Preparare una cuvetta denominata INPUT contenente 20 μl di albume + 600 μl di Bradford.



Preparare la cuvetta 0 contenente 20 μl di Buffer (non da colonna) + 600 μl di Bradford.



Trasferire 20 μl del contenuto delle 15 provette in un numero uguale di cuvette e aggiungere ad ognuna 600 μl di Bradford.

Una volta eseguito tale procedimento spipettare tutte le cuvette e procedere con la misurazione dell’assorbanza tramite l’utilizzo dello spettrofotometro. Realizzare una tabella che riporti ogni valore di assorbanza misurato e realizzare un grafico.

CUVETTE

ASSORBANZA

CUVETTE

ASSORBANZA

INPUT

1,408

Cuvetta 8

0,651

Cuvetta 1

0,068

Cuvetta 9

0,467

Cuvetta 2

0,659

Cuvetta 10

0,366

Cuvetta 3

0,580

Cuvetta 11

0,269

Cuvetta 4

0,790

Cuvetta 12

0,346

Cuvetta 5

0,965

Cuvetta 13

0,492

Cuvetta 6

0,111

Cuvetta 14

0,208

Cuvetta 7

0,890

Cuvetta 15

0,150

La cuvetta 0, se è stata preparata correttamente, presenta un valore di assorbanza pari a 0,000. Viene utilizzata una curva standard di albumina per determinare la concentrazione di ogni frazione. Qualsiasi misurazione esca dal range presentato dalla curva standard deve essere eliminata, nel caso in cui anche l’input esca da tale range occorre diluirlo. Nel nostro caso occorre procedere con l’eliminazione delle cuvette 1 e 6 e con la diluizione di INPUT. Per diluire INPUT prelevare da esso 50 μl di campione ed unirli a 50 μl di acqua, mescolare bene e prelevare 20 μl della soluzione appena creata. Trasferire questi 20 μl in una cuvetta e

QUADERNO DI LABORATORIO miscelarli con 600 μl di Bradford. Misurare nuovamente l’assorbanza di INPUT tramite lo spettrofotometro, nel caso in cui questa volta il valore cada dentro al range è possibile procedere con l’esperimento, altrimenti occorre effettuare un’altra diluizione. Nel nostro caso il valore corrisponde a 0,365 e può essere dunque accettato.

Curva andamento assorbanza 1.2

assorbanza

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 INPUT C2

C3

C4

C5

C7

C8

C9

C10

C11

C12

C13

C14

C15

campioni

GIORNO 3 Valutazione attività enzimatica L’attività enzimatica viene solitamente calcolata come un  ovvero la differenza tra un valore iniziale e un valore finale. In questo caso particolare l’attività enzimatica è espressa come la differenza tra il valore di assorbanza finale di ogni cuvetta e quello iniziale ( = Af-Ai). Per questa parte di esperimento viene utilizzato parte del contenuto delle cuvette del giorno precedente, tenendo presente che sono state eliminate le cuvette numero 1 e numero 6. Preparare dunque un analogo numero di cuvette rispetto al giorno precedente contenenti: 

50 μl di soluzione enzimatica (presa dalla cuvetta con il corrispondente numero)



1 ml di soluzione batterica, la quale rappresenta il substrato sul quale andrà ad agire l’enzima

Preparare una tabella che riporti il valore di assorbanza iniziale misurato, quello finale ed il  calcolato. La cuvetta INPUT, se è stata preparata correttamente, dovrebbe presentare un valore  di assorbanza pari a 0.

QUADERNO DI LABORATORIO

Cuvette

Assorbanza iniziale

Assorbanza finale



2

-0,0230

-0,0306

-0,0076

3

-0,0236

-0,0534

-0,0298

4

-0,0413

-0,1103

-0,069

5

-0,0438

-0,1448

-0,106

7

-0,0401

-0,1598

-0,1197

8

-0,0374

0,1396

-0,1022

9

-0,0401

-0,1200

-0,0799

10

-0,0771

-0,1936

-0,1165

11

-0,0695

-0,1619

-0,0924

12

-0,0737

-0,1489

-0,0752

13

-0,0457

-0,1153

-0,0696

14

-0,0381

-0,1004

-0,0623

15

-0,0411

-0,0926

-0,0515

INPUT

-0,0300

-0,0300

0

QUADERNO DI LABORATORIO

Curva andamento  assorbanza 0

2

3

4

5

7

8

9

10 11 12 13 14 15 INPUT

 assorbanza

-0.02 -0.04 -0.06 -0.08 -0.1 -0.12 -0.14

campioni

Come precedentemente affermato, la curva indica l’andamento del  dell’assorbanza ovvero dell’attività enzimatica di ogni campione.

Determinare la concentrazione ematica di glucosio Per effettuare questa esperienza di laboratorio viene utilizzato siero a concentrazione ignota. Si è però a conoscenza del fatto che una soluzione di glucosio standard presenta tali valori di concentrazione: 100 mg/dl, 5,5 mM. Preparazione delle cuvette: 1. Realizzare una diluzione 1:2 del siero in una provetta marcata con la lettera A. Nel nostro caso vengono utilizzati 20 μl di siero e 40 μl di acqua 2. Preparare le seguenti reazioni in cuvetta agitando bene e marcando ogni cuvetta sul lato opaco nel seguente modo: 

BIANCO: 10 μl di acqua + 1000 μl di reagente



SIERO: 10 μl di siero + 1000 μl di reagente



SIERO DILUITO: 10 μl di siero prelevato dalla provetta A + 1000 μl di reagente



STANDARD: 10 μl di standard + 1000 μl di reagente

3. Incubare a 37°C per 15 minuti 4. Lettura del valore di assorbanza tramite l’uso di uno spettrofotometro, la cuvetta BIANCO viene utilizzata per settare lo spettrofotometro, infatti li valore di assorbanza letto da tale provetta deve corrispondere a 0

QUADERNO DI LABORATORIO 5. Realizzare una tabella che riassuma le misurazioni effettuate.

Intervalli di riferimento:   

Normale  270 mg/L (6,97 mmol/L)

Risultati:

CUVETTE

ASSORBANZA

Bianco

0

Siero

0,016

Siero diluito

0,007

Standard

0,262

Esprimendo la concentrazione sia in mg/dl che in mM calcolare: 

La concentrazione di colesterolo nel siero, utilizzando la misura su siero non diluito se affidabile:

ASiero * 200 = AStandard ASiero * 5,16 = AStandard



0,016 0,262 0,016 0,262

* 200 = 12,21 mg/dL

* 5,16 = 0, 315 mmol/L

La concentrazione di colesterolo nel siero, utilizzando la misura sul siero diluito 1:2 se affidabile:

ASieroDiluito 0,007 * 200 = AStandard 0,262 ASieroDiluito * 5,16 = AStandard

0,007 0,262

* 200 = 5,34 mg/dL

* 5,16 = 0,138 mmol/L

QUADERNO DI LABORATORIO 

Le due misure sono entrambe nell’ambito di linearità? Se non sono affidabili perché? Le misure sul campione non diluito rientrano nell’ambito di linearit à. Per quanto riguarda invece il campione diluito non può essere effettuata una misurazione in quanto non si hanno intervalli di riferimento.



Il valore misurato è normale o patologico? Normale per entrambi i campioni.

Determinare se la concentrazione ematica di ALP è patologica La fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima ampiamente distribuito in tutti i tessuti del corpo umano, in particolare nelle ossa e nel fegato. La sua concentrazione è alta nei bambini e nelle donne durante il terzo semestre della gravidanza. Bassi valori di ALP sono invece rilevanti in soggetti affetti da ipotiroidismo, malnutrizione, nefrite cronica e celiachia. Inoltre, valutare il valore della concentrazione ematica di fosfatasi alcalina può essere utile nel diagnosticare patologie epato-biliari o un’attività osteoblastica in netto aumento. La fosfatasi alcalina segue le vie biliari e si affianca dunque al colesterolo in tutto il suo percorso all’interno del corpo umano. Per questo motivo spesso alti valori di concentrazione di colesterolo corrispondono ad alti valori di concentrazione di ALP. La fosfatasi alcalina catalizza la seguente reazione: p-nitrofenil fosfato + H2O  p-nitrofenolo + fosfato L’ALP idrolizza il p-nitrofenil fosfato a p-nitrofenolo e fosfato inorganico. L’idrolisi avviene a pH alcalino e il p-nitrofenolo formato mostra la sua assorbanza massima alla lunghezza d’onda di 405 nm. La velocità di aumento dell’assorbanza a 450 nm è direttamente proporzionale all’attività della fosfatasi alcalina. Procedimento: La temperatura della reazione dovrebbe essere mantenuta ad una temperatura costante che può essere 25°C, 30°C o 37°C.      

Porre in una provetta 1 ml di reagente per la fosfatasi alcalina (preparato in precedenza dal professore) Aggiungere 20 μl di siero Mescolare bene la soluzione appena creata e trasferire il tutto in una cuvetta Tramite l’utilizzo di uno spettrofotometro procedere con la misurazione del valore di assorbanza ogni 30 secondi e raccoglierli in una tabella Calcolare il  per minuto sottraendo l’assorbanza iniziale misurate a quella finale Calcolare se la concentrazione ematica di ALP sia patologica o meno

Raccolta dati: SECONDI 0 30 60 90 120

Calcoli:

ASSORBANZA 1,923 2,027 2,039 2,063 2,090

QUADERNO DI LABORATORIO

2min= 2,090 – 1,923 = 0,167  /2 = 0,167 / 2 = 0,0835 D...