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Recuento de mohos y levaduras Objetivos:  

Conocer el número de mohos y levaduras que tiene una muestra de jugo. Determinar si el jugo es apto para el consumo humano según los resultados encontrados.

Marco teórico: El moho es un hongo que se encuentra tanto al aire libre como en interiores. El moho crece mejor en condiciones cálidas, mojadas y húmedas, y se propaga y reproduce mediante esporas. Las esporas del moho pueden sobrevivir en condiciones ambientales, como la resequedad, que no favorecen el crecimiento normal del moho. Los mohos se encuentran virtualmente en cada ambiente y pueden ser detectados, tanto en interiores como al aire libre, durante todo el año. Las condiciones húmedas y cálidas favorecen el crecimiento del moho. Al aire libre pueden encontrarse en áreas o lugares húmedos sombreados donde hay descomposición de hojas o de otro tipo de vegetación. En los interiores pueden encontrarse en lugares donde los niveles de humedad son altos como los sótanos o las duchas. [ CITATION CEN19 \l 12298 ] Las levaduras son hongos que forman sobre los medios de cultivo colonias pastosas, constituídas en su mayor parte por células aisladas que suelen ser esféricas, ovoideas, elipsoideas o alargadas. Unas pocas presentan hifas. En general, las células de las levaduras son conidios formados según diferentes tipos de conidiogénesis. Las levaduras pertenecen a dos clases de hongos: ascomicetos o basidiomicetos, aunque muchas de ellas se presentan comúnmente en la forma imperfecta. Las levaduras son organismos aerobios y aunque muchas especies son fermentadoras, otras no lo son, como los géneros Cryptococcus y Rhodotorula. [ CITATION Exp13 \l 12298 ] Para el conteo de colonias se debe diferenciar las colonias de mohos y levaduras tomando en cuenta las siguientes características morfológicas. Levaduras osmófilas y mohos xerófilos: hongos capaces de crecer a una actividad de agua menor o igual a 0.95 “Azul de lactofenol en solución para tinción de hongos” es utilizado para el diagnóstico celular en la medicina humana, se empleó en el examen bacteriológico de muestras de origen humano. Se trata de una solución de colorante lista para el uso que, junto con otros materiales de diagnóstico in vitro pertenecientes a nuestra cartera. [ CITATION Azu19 \l 12298 ]

Principio: Se siembra en la superficie de placas con medio de cultivo específico, un volumen de la muestra. Posteriormente las placas se incuban aeróbicamente a 25°C ± 1°C durante 5 a 7 días. Luego se cuentan las colonias de hongos desarrolladas. Si es necesario diferenciar levaduras de bacterias, se realiza un examen con una lupa binocular o un microscopio. El número de levaduras y mohos por gramo o por mililitro de muestra se calcula a partir del número de colonias obtenidas de las placas elegidas en los niveles de dilución que desarrollaron colonias contables. Los mohos y las levaduras se cuentan por separado, si es necesario. [ CITATION ana14 \l 12298 ]

Recursos utilizados: Materiales: Detalle Cantidad Cajas Petri con hongos en agar Saboraud con 2 Cloranfenicol Pinza metálica pequeña 1 Cajas de fósforos 1 Cinta scoch 1 Portaobjetos 2 Asa de siembra 2 Cubreobjetos 2 Muestra de jugo 250 ml Caldo agua peptona al 0.1%

Reactivos: Detalle Gotero con azul de lactofenol

Cantidad 1

Equipos: Detalle Microscopio

Cantidad 1

Muestreo: El ensayo debe realizarse a una muestra representativa que no debe haber sido dañada o cambiada durante el transporte al laboratorio o su almacenamiento. La muestra no debe congelarse. [ CITATION sec08 \l 12298 ]

Procedimiento: Se realiza una limpieza previa del área de trabajo para evitar contaminar la muestra. Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones. [ CITATION a14 \l 12298 ]

Suspensión inicial: El diluyente recomendado es el caldo agua peptona al 0.1% Se recomienda el uso de un diluyente con una cantidad suficiente de soluto para disminuir el shock osmótico de mohos xerófilos y levaduras osmófilas cuando se realizan las diluciones decimales antes de la siembra. En un frasco estéril o bolsa de plástico estéril pesar x g ± 5% ó x ml ± 5% de la muestra. Agregar una cantidad del diluyente igual a 9 x g ó 9 x ml (dilución 1/10) y homogenizar entre 1 a 3 min dependiendo del alimento. Para evitar daños de los microorganismos por cambios bruscos de temperatura la temperatura del diluyente debería ser aproximada a la temperatura ambiente. [ CITATION amn14 \l 12298 ]

Diluciones decimales: Transferir con una pipeta 1 ml ± 5% de la suspensión inicial en un tubo con 9 ml del diluyente estéril. Para una óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la suspensión inicial y evitar el contacto entre la pipeta conteniendo el inóculo y el diluyente estéril.

Mezclar preferentemente utilizando un agitador mecánico durante 5 s a 10 s para obtener la dilución 10 a la -2 . Si es necesario repetir esta operación utilizando la dilución 10 a la -2 y diluciones sucesivas, utilizando en cada operación una nueva pipeta estéril para obtener 10 a la -3 , 10 a la-4, etc. Diluciones, hasta que se obtenga un número apropiado de microorganismos para realizar el recuento. Agitar la suspensión inicial y diluciones con el fin de evitar la sedimentación de partículas que contienen microorganismos. Debido a la rápida sedimentación de las esporas en la pipeta, mantener la pipeta en una posición horizontal (no vertical), cuando se llena con el volumen apropiado de la suspensión inicial y diluciones. [ CITATION amn \l 12298 ]

Duración del procedimiento: El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el instante en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe superar los 45 minutos, mientras que el lapso de tiempo límite entre la preparación de la suspensión inicial y el comienzo de la preparación de las diluciones decimales sucesivas es de 30 minutos. [ CITATION amn14 \l 12298 ]

Inoculación e incubación: Transferir por medio de una pipeta estéril 0.1 ml de la muestra si el producto es líquido ó 0.1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) por duplicado en placas de agar dicloran glicerol 18% (DG18). Repetir el procedimiento para las diluciones decimales si es necesario. Para facilitar el recuento de bajas poblaciones de levaduras y mohos, se puede inocular un volumen de hasta 0.3 ml de una dilución 10-1; o directamente de la muestra si es líquida, en tres placas. Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie del agar con una espátula estéril, hasta que el líquido se absorba completamente en el medio. Incubar las placas aeróbicamente sin invertir (con la tapa superior hacia arriba), a 25°C ± 1°C durante 5 a 7 días. Si es necesario. Se recomienda incubar las placas en una bolsa de plástico abierta con el fin de no contaminar la estufa en caso de dispersión de los hongos. [ CITATION Jud14 \l 12298 ]

Recuento de colonias: Realizar el recuento entre el 2º y el 5º día de incubación.

Si se han desarrollado mohos de crecimiento rápido, contar el 2º día y luego el 5º y el 7º. Seleccionar las placas con menos de 150 (generalmente entre 10 y 150) Si la microflora está compuesta principalmente de mohos se seleccionan las placas dentro del intervalo de recuentos más bajos. Si la microflora está compuesta principalmente de levaduras se seleccionan las placas que contienen hasta el límite superior de recuento. Puede llevarse a cabo un examen con una lupa binocular o con un microscopio con el fin de distinguir entre levaduras o mohos y colonias bacterianas. Contar las colonias de levaduras y las colonias / propágulos de mohos por separado, si es necesario. Si la identidad de las colonias es dudosa, se examinan preparaciones húmedas o teñidas de células procedentes de un mínimo de 5 colonias por muestra para confirmar que no hay bacterias presentes. [CITATION Sus11 \l 12298 ]

Expresión de los resultados: Se informa recuento de mohos y levaduras en la porción de muestra analizada (por mililitros para muestras líquidas, o por gramo para el resto de los productos). Si las dos placas correspondientes a la muestra sembrada (productos líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) no contienen colonias de mohos y/o levaduras, informar el resultado como sigue. < 10 UFC/ ml (productos líquidos) < 102 UFC/g (otros productos) Volumen sembrado = 0.1 ml. Para placas con un mínimo de 10 colonias y un máximo de 150 colonias el número de microorganismos N presentes en la muestra de análisis se calcula como, la media corregida de dos diluciones consecutivas según la siguiente ecuación. N ¿

∑c vx1. vx 1

∑C: Suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones consecutivas, de las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias. V : Volumen del inóculo utilizado en cada placa en mililitros. d : Es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Si la tercera cifra es inferior a 5, no

se modifica la cifra anterior. Si es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad. [ CITATION Sus11 \l 12298 ]

Interpretación de resultados: Se informa Recuento de Mohos por gramo o mL de muestra y recuento de Levaduras por gramo o mL de muestra. Aproximar el resultado a dos cifras significativas. El ensayo indica la norma de referencia, la temperatura de incubación, los resultados obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en esta norma o aquellas consideradas como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el resultado. Además, se debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra. [CITATION INE \l 12298 ]

Anexos: Pregunta: Qué condiciones requiere el crecimiento de los Hongos: Humedad y Agua disponible Humedad relativa de equilibrio (HRE) Temperatura pH. Composición del sustrato. Nutrientes minerales. Potencial de oxi-reducción. [ CITATION alb02 \l 12298 ]

Bibliografía: Recuperado de:

www.normalizacion.gob.ec/buzon/normas/nte_inen_1529-10-1.pdf www.engormix.com/micotoxinas/articulos/principales-factores-condicionantesdesarrollo-t26065.htm www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_Vol_III.p df issuu.com/holmaneduardo/docs/informe_microbiologia_practica_de_m PROCEDIMIENTO_RECUENTO_MOHOS_Y_LEVADURAS.pdf...