Reporte práctica 2 - ““Preparación y esterilización de material y medios de cultivo”. PDF

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““Preparación y esterilización de material y medios de cultivo”....

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

REPORTE DE LABORATORIO No. 2 ““Preparación y esterilización de material y medios de cultivo”.

Horario de la Práctica: Lunes y miércoles 9:00 am-12:30 pm

Tlaquepaque, Jalisco; 14 de junio del 2019

RESUMEN (ABSTRACT)

Ignaz Semmelweis, considerado el salvador de las madres, propuso el uso de una solución de cloruro la cual fue empleada para esterilizar. La esterilización es cualquier proceso que elimina, remueve o mata microorganismos, ya sea de algún material o zona a esterilizar. Se realizó la esterilización de las pipetas, el matraz Erlenmeyer y las pinzas con algodón y papel kraft. Se rellenan las botellas para medios de cultivo con nuestros diferentes tipos de agar. Se agregan la solución salina y el caldo nutritivo a tubos de ensayo. Ingresar los materiales junto con los medios de cultivo previamente elaborados a la autoclave ya calentado y con los niveles de agua revisados, checar que se encuentre a 121°C y dejar por 15 minutos. Se pudo ejecutar la práctica sin problema al observar que los medios de cultivo estaban solidificados al retirar del refrigerador y los materiales esterilizados al salir de la autoclave.

INTRODUCCIÓN La esterilización es el proceso en el que se eliminan, a partir de la muerte, todas las formas de vida microbianas. “Eliminación de microorganismos mediante calor, radiación, filtración o mediante el uso de compuestos químicos.” (FAO, 2004) El proceso de esterilización se lleva a cabo en los procedimientos quirúrgicos y en los laboratorios de microbiología. En este último, esterilizar es de vital importancia para poder analizar, estudiar y observar gérmenes puros, eliminando cualquier tipo de vida microbiana que no se quiera observar. Existen diversos métodos de esterilización, se dividen en dos tipos: físico y químico.

MÉTODOS FÍSICOS 1. Calor seco: para esterilizar se necesitan altas temperaturas de aire, tiene mayor penetración y requiere de menos tiempo. 2. Calor Húmedo: se logra por el vapor de agua sobrecalentado y a presión. 3. Radiaciones ionizantes (gamma, beta y ultravioleta): son costosos, tienen alta penetración. 4. Ondas supersónicas (microondas odontológico): toma tiempo de 90 segundos 5. Filtración: impide el paso de microorganismos de un ambiente a otro. 6. Ebullición: con dos líquidos, agua y aceite.

7. Flameo: una llama producida por alcohol o gas, es un procedimiento de emergencia. 8. Microesferas de Vidrio: se usa para esterilizar material pequeño.

AGENTES QUÍMICOS 1. Óxido de etileno: es gaseoso de acción lenta, alta penetración, largo tiempo de validez de esterilización. 2. Plasma de peróxido de hidrógeno: método de esterilización rápida, a baja temperatura, baja humedad y sin residuos tóxicos. Un medio de cultivo es un gel, que consta con el ambiente favorable (temperatura,ph, y medio) para que la bacteria, virus o microorganismo incluyendo a las plantas pueda desarrollarse, antes de prepararse vienen en estado sólido y al prepararse pueden estar en estado sólido, semisólido y líquido. Existen medios de cultivo naturales (preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal), semisintéticos (adición de complejo bajo) y sintéticos (medios con composición química definida). El objetivo de la práctica a realizar es preparar medios de cultivo y materiales para esterilizar.

MATERIALES En esta práctica se usará cinco charolas de pesado, un matraz Erlenmeyer de 125 ml, un vaso de precipitados de 100 ml, dos vasos de precipitados de 250 ml y también se hará uso de dos vasos de precipitados de 500 ml, junto con cinco botellas de medios de cultivo de 250 ml. Se necesitará una pipeta de 1 ml, dos pipetas de 5 ml y otras dos de 10 ml. Las probetas serán necesarias de medidas diferentes, una de 100 ml, otra de 250 ml y una de 500 ml. Se tomarán materiales como pinzas de disección, unas tijeras, un agitador magnético, una gradilla con capacidad de 40 tubos y un mechero Fisher. Será necesario, una piseta con alcohol al 70% v/v, 17 tubos roscados de 13x100 mm y 10 tubos roscados de 17x100 mm, una varilla en forma de L o una simple y una lima triangular. Se usará agua destilada, además una propipeta.

El equipo a emplear será: autoclave, incubadora a 30° C, refrigerador, balanza y una placa caliente con agitación magnética. El profesor suministrará cierto material: algodón, papel aluminio, papel kraft, ligas, clips, cable nutritivo, cinco espátulas, dos tipos de Agar: BHI, estándar y McConkey; PDA, cloruro de sodio y cinta testigo de autoclave.

MÉTODOS Diagrama 1:

Diagrama 2:

Diagrama 3:

Diagrama 4:

Diagrama 5:

Diagrama 6:

Diagrama 7:

Diagrama 8:

Diagrama 9:

Diagrama 10:

Diagrama 11:

Diagrama 12:

Diagrama 13:

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La preparación del material de vidrio para la esterilización, siendo este un matraz Erlenmeyer de 250 ml, unas pinzas, 2 pipetas de 10 ml, 2 pipetas de 5ml y una pipeta de 1 ml fue acorde con la explicación de los videos mostrados y de los métodos de la práctica, utilizando papel kraft, cinta adhesiva y cinta testigo. Posteriormente se prepararon las distintas soluciones a preparar, presentadas en la siguiente tabla, donde se incluye la cantidad final de sustancia utilizada y el volumen al que fueron aforados para preparar las disoluciones. Tabla 1. Cantidades finales de soluto con volumen de disolución preparados durante la práctica, color y observaciones. Sustancia

Cantidad

Volumen aforo

Agar BHI

3.7 gr BHI + 1.5 100 ml gr Agar

Color

Observaciones

Ligeramente café translúcido

Se guardó la solución completa en un frasco con tapa

Agar MRS

21 gr MRS

300 ml

Café translúcido

Se guardó la solución en 2 frascos distintos, donde en uno se colocaron 100 ml mientras que en el otro 200 ml.

Agar PDA

11.7 gr PDA

300 ml

Blanco y turbio

Se guardó la solución completa en un frasco con tapa

McConkey

5 gr McConkey

100 ml

Rojo oscuro

Se guardó la solución completa en un frasco con tapa

Solución Salina

0.85 gr NaCl

100 ml

Translúcido

Se virtieron 9 ml en cada uno de los 10 tubos roscados de 17x100 mm

Caldo Nutritivo

0.44 gr CN

55 ml

Ligeramente verde,

Se virtieron 3 ml en cada uno de

translúcido

los 17 tubos roscados de 13x100 mm

La preparación de la solución salina y del caldo nutritivo no requirió atención especializada debido a que el soluto se diluyó perfectamente en el agua. En el caso de los medios de cultivo, se requirió de un agitador magnético y de una placa de agitación para poder mezclar el agar en el agua, aunque el fin de esta agitación no era la incorporación total del soluto en el agua, sino simplemente mantener la suspensión y dispersión uniforme del soluto en esta, debido a que a temperatura ambiente resulta imposible este procedimiento, por lo que, cuando se obtuvo la suspensión uniforme, se vertieron las disoluciones inmediatamente en frascos de vidrio con tapa. Después de un rato, el agar se comenzó a precipitar al fondo de los frascos, pero esto no resultó en inconveniente alguno. Finalmente, los frascos con todas las disoluciones, tanto de medio de cultivo como de caldo nutritivo (dejando los frascos tapados pero ligeramente abiertos), y el material de laboratorio previamente empaquetado, fueron introducidos al autoclave, donde el proceso base para la esterilización duró 15 minutos. Una vez terminado el proceso y enfriado el sistema, se retiraron del autoclave. El papel kraft con el que se envolvió el material de vidrio se encontró mojado, pero no disuelto gracias a las propiedades de este papel, debido a que algún otro se hubiera desecho durante el proceso. Gracias a la cinta testigo, colocada en cada material de laboratorio, se pudo comprobar la eficacia de la esterilización debido a que esta cinta, en las rayas previamente fabricadas dentro de esta, se tiñen de un color oscuro, dándonos la certeza de que estos están perfectamente esterilizados. En el caso de los medios de cultivo, estos ya no presentaron precipitación de agar debido a que la temperatura con la que fueron esterilizados fue de ayuda para lograr que aumentase el coeficiente de solubilidad del agua y que el agar se incorporarse completamente, logrando una mezcla homogénea. Al parecer no hubo pérdida de volumen dentro del frasco debido a que, por la naturaleza del método, al estar el aire saturado de vapor de agua y en un sistema cerrado, el agua dentro del frasco no se evaporó, simplemente aumentó su temperatura.

No hubo necesidad de fabricar un asa de vidrio en forma de L debido a que, en el material proporcionado, ya venía incluída con la forma, por lo que no fue necesario el doblamiento de varilla de vidrio. Finalmente, todo el material de soluciones fue cerrado correctamente y guardado en el refrigerador correspondiente al laboratorio de microbiología. A diferencia del texto Métodos de esterilización material de apoyo a la docencia asignatura esterilización y bioseguridad primer año (López, Z. Dra., & García, M. Dr., 2014) el autoclave utilizado para esta práctica no presentaba el cilindro de cobre interno ni relojes que midieran presión y tiempo, simplemente unas luces led que indican la fase del proceso en la que se encontraba el autoclave y una pantalla digital que mostraba la temperatura, además que menciona que solamente se coloca una cinta testigo dentro del cilindro, mientras que nosotros colocamos cinta testigo a cada uno de los materiales, siendo un posible punto a mejorar debido a que evitamos el gasto innecesario de materia, además que este no presentaba válvula de escape de gas y que solo tenía dos modos programados previamente, normal y rápida, por lo que no había opción a cambiar temperatura o presión.

CUESTIONARIO Ejemplo de material que

Método F í s i c o s

Cal or hú me do

Mecanism o de acción se coagula la proteína celular (autoclave )

Condici ones 121 °C 15 psi 15 min

Ventajas

Desventajas

ciclo corto buena penetraci ón, económi co, no deja residuos tóxicos

Produce corrosión del instrumental, no esteriliza plásticos, ni sustancias pulverulenta s ni grasas

puede esteriliz arse por este método textil vidrios acero inoxida ble

no puede esteriliza rse por este método solucion es oleosas, plásticos o gomas sensibles , instrume ntal cromado o niquelad

o Cal or sec o

Oxidación de compuest os orgánicos (Pupinel)

121° C-180°

Menor costo que el autoclav e Facilidad de operació n

Daño al material por exposición a temperatura s elevadas, deteriora filos cortantes

Inci ner aci ón

incinerar en hornos crematori os

120° C 360 minuto s 180°C 30 minuto s

Rapidez

largo tiempo de exposición, la posibilidad de dañar algunas aleaciones metálicas

Filtr aci ón

Los microorga nismos son retenidos por el material microporo so

No requiere instalaci ones o material complejo , no es costoso

Los microorganis mos solamente son retenidos por el material, virus, micoplasma sy pleomórficos no son retenidos

se realiza a temperat ura ambiente , no deja residuos, es fácil de controlar, gran penetraci ón

Alto costo y requiere instalacione s complejas

Superfi cies, instrum entació n termolá bil

Material no industrial

Alta

Largo ciclo

product

Medios

Irra dia ció n

Q

Óxi

Radiación por Cobalto 60

materia l con poro (0.22 µm 0.45 µm), un mecani smo de presión y debe ser inerte

exposic ión, radiaci ón y dosis

37°C-

aceites, vaselin a, petróle os y polvos.

materiale s líquidos, gomas

asas, hilos, pinzas, tubos, matrac es

material termosen sible

solucio nes termos ensible s, acetato de celulos a

material de vidrio o metal, material que no esté en disolució n

u í m i c o s

do de etil eno

alquilació n de la pared celular del microorga nismo

55°C

capacida d de penetraci ón. * No daña materiale s sensible s al calor.

costoso, altamente tóxico, inflamable, cancerígeno

Alc oho l

Actúa desnatural izando proteínas e inhibiendo enzimas

25ºc o menor

eficaz contra bacterias Gram + y -

volátil Necrosa Despide mal olor Irritante Inflamable

os medico sy odontol ogicos

de cultivo

Oral incubad oras Piel Instrum entos Qx

CONCLUSIONES Se elaboraron los medios de cultivo con agua destilada y agar y se colocaron en botellas especiales; se preparó un caldo nutritivo y una solución salina que se depositaron con ayuda de una pipeta de 5ml y una de 10 ml respectivamente en tubos de ensayo; se adecuaron los materiales a esterilizar: pipetas, matraz Erlenmeyer y las pinzas con algodón y papel kraft; todo lo que se realizó se llevó al autoclave para esterilizar durante 15 minutos a 121°C y para finalizar se refrigeraron.

RECOMENDACIONES ● Leer y analizar cuidadosamente las indicaciones de cada uno de los botes (BHI, MRS, Caldo nutritivo, Solución salina, Agar McConkey), ya que estas contienen la cantidad de gramos posibles para cierta cantidad de líquido. ● Agar McConkey fue utilizado aparte de lo solicitado en la práctica. ● Todas las mezclas sin ninguna excepción fueron correctamente mezcladas con la placa agitadora, debido a que si no se hacía esto, quedaba no disuelta.. ● Después de mezclarlo con la agitadora se tiene que poner rápidamente en el vaso de cultivo porque se vuelve a separar la mezcla..

● La pipeta que se utilizó es más precisa. ● Se tuvo que esterilizar en un calor húmedo a 121°C. ● Estar consciente de que una vez que la esterilización empiece, se debe de tener en cuenta que dura alrededor de casi 40 minutos en estar lista.

REFERENCIAS CONSULTADAS Fraga, M., Rodríguez, P., & Cabrera, E..et all (2004). Glosario de biotecnología para la agricultura y la alimentación. Recuperado 5 junio, 2019, de http://www.fao.org/3/y2775s/y2775s00.htm#Contents López, Z. Dra., & García, M. Dr.. (2014). Métodos de esterilización material de apoyo a la docencia asignatura esterilización y bioseguridad primer año. Recuperado 5 junio, 2019, de http://uvsfajardo.sld.cu/tema-7-metodos-de-esterilizacion Omar, O. (2014). Preparación de medios de cultivo y su esterilización-. Recuperado 5 junio, 2019, de https://es.slideshare.net/oscaroma12/preparacin-de-medios-decultivo-y-su-esterilizacion Pucci, O. Dr.. (2017). Control de microorganismos: esterilización.Recuperado 5 junio, 2019, de http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wpcontent/uploads/2017/02/03-b-ESTERILIZACI%C3%93N-2017.pdf Vignoli, R. (2002). Esterilización y desinfección. Recuperado 5 junio, 2019, de http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2027.pdf...