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Resumen de la bolilla de Esterilizacion, Desinfeccion, Bioseguridad para examen final...

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Unidad 3 - Esterilización y desinfección. Bioseguridad. Esterilización: es un proceso por el que se eliminan todas las formas de vida microbiana, incluso las esporas bacterianas, produciendo una condición de esterilidad. Se logra por métodos físicos y químicos. Estéril: es la ausencia absoluta de toda forma viable de vida. Desinfección: uso de agentes químicos para eliminar la infectividad potencial de un material (no implica la eliminación de todas las formas microbianas). Destrucción de las formas vegetativas de los patógenos. Asepsia: conjunto de medidas destinadas a impedir toda contaminación microbiana. Germicida (o biocida): sustancia capaz de matar las formas vegetativas de los gérmenes. Bactericida: tiene igual significación, pero referido específicamente a las bacterias. Bacteriostático: sustancia que inhibe el crecimiento bacteriano. Fungicida: sustancia que mata los hongos. Fungistático: sustancia que inhibe el crecimiento fúngico. Virucida: sustancia que detiene la replicación y la actividad vírica. Virustático: sustancia que inhibe la replicación vírica. Los términos esterilización y estéril no son factibles de demostrar prácticamente, es decir, la muerte o remoción de las bacterias sigue una función de probabilidad, y siempre hay una posibilidad finita de que queden algunos microorganismos vivos intactos en el sistema. En la práctica, el concepto esterilización significa el proceso de alcanzar un estado con el mínimo riesgo calculado de sobrevivientes, mientras que por estéril se entiende la ausencia de formas de vida demostrables. SAL (sterility assurance level) = 10-6 (probabilidad de sobrevida): la probabilidad de una unidad no estéril es igual a 1 en una población de 106 microorganismos. La esterilidad de un material, dependerá de No (número inicial de microorganismos viables contaminantes) y de la velocidad de muerte de dichos microorganismos para ese proceso de esterilización. La tasa de muerte microbiana es por los general constante en los procesos de esterilización. Cinética de muerte de los microorganismos. Cuando una población de mo es sometida a un proceso de esterilización (calor, radiación, compuestos químicos), no todas las células mueren al mismo tiempo. El Nº de sobrevivientes disminuye exponencialmente con el tiempo de exposición hasta que no pueden detectarse más microorganismos viables. Mientras esto se mantiene la curva de sobrevivencia, es decir, el gráfico de logaritmo del número de sobrevivientes (N/No) en función del tiempo (t) independiente del número inicial de microorganismos, es lineal. La muerte de los microorganismos es una función exponencial (de primer orden) y ocurre más rápidamente cuanto mayor es la temperatura. Nt = No e-Kt N/No = e-K.t ln N/No = - K.t N/No es la fracción de mo viables que sobreviven el tratamiento de esterilización durante el tiempo t. K es la constante de inactivación o de velocidad de muerte No es el número de microorganismos viables presentes inicialmente N es el número de microorganismos al final del proceso.

A: Curva normal B: Esporas altamente resistentes, puede haber una fase inicial logarítmica en la muerte en función del tiempo antes que la curva de sobrevivientes comience a decrecer exponencialmente. Esto produce un “hombro o plateau” en la curva que luego puede ser lineal. C: Microorganismos altamente sensibles, la porción inicial de la curva puede ser muy aguda y no exponencial antes de convertirse en lineal, dando lugar a una curva bifásica. Estos casos son típicamente demostrados con procesos de esterilización por calor y radiación. D: En tratamientos químicos, la curva de supervivientes puede iniciarse con características de linealidad, pero luego de un tiempo muestra un retardo en la velocidad de muerte dando lugar a una “cola”. A veces toda la curva es sigmoidea, esto indica la presencia de sobrevivientes resistentes en la suspensión original, aún cuando se trate de bacterias del mismo tipo. En todos los casos la pendiente de la curva en la porción lineal varía con muchos factores, como la severidad del tratamiento y la presencia de agentes protectivos. El valor D o tiempo de reducción decimal: Tiempo requerido para reducir en un 90% el número de microorganismos viables, lo cual corresponde a una disminución de un ciclo logarítmico en la curva de sobrevivencia a una temperatura determinada. Si todos los factores (temperatura, dosis de radiación, composición, pH del medio) son bien conocidos, el valor D puede ser determinado con bastante precisión. 

𝐷 = 

Factores que afectan la eficiencia de los procesos de esterilización La presencia de humedad y oxígeno. El calor húmedo requiere temperaturas y tiempos de exposición bastantes menores para esterilizar, que el calor seco. La presencia de sustancias químicas bactericidas aumenta el efecto del calor y permite el uso de temperaturas más bajas para producir el mismo efecto.

Presencia de microorganismos esporulados, generalmente mas resistentes si provienen de un medio natural. Los aceites, ácidos grasos y las proteínas tienen un efecto protector sobre las bacterias, particularmente contra la acción del calor. Las soluciones azucaradas con glucosa en alta concentración protegen por reducción de la actividad acuosa (aw) dentro del sistema y aumentan la resistencia de los microorganismos al calor.

Condiciones previas que debe cumplir el material para una eficaz esterilización 1. Lavado: Se realiza con agua y detergentes. Su finalidad es remover toda materia organica extraña en la superficie de los materiales que pueda interferir en los métodos de esterilización. - Reduce la tensión superficial del agua, colaborando en la solubilización de albúmina, emulsión de grasas y suspensión de partículas. - El empleo de detergentes enzimáticos es de mayor eficiencia. 2. Secado: Es importante para evitar la re contaminación y deterioro del material. 3. Envoltura: Se realiza para evitar la re contaminación microbiana en al momento de la salida de la cámara de esterilización, transporte y almacenamiento hasta su utilización. La naturaleza del material de envoltura dependerá del procedimiento de esterilización empleado y del material a esterilizar

-Permeable al agente esterilizante -Resistente a la penetración de microorganismos -Resistente a roturas y humedad -No debe ser tóxico. -Libre de pérdida de fibras u otro tipo de sustancias. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Se pueden clasificar en MÉTODOS FÍSICOS  Calor seco: llama directa, incineración, aire caliente (estufa)  Calor húmedo: a presión (autoclave), a vapor fluente (tyndalización)  Filtración: filtros de profundidad, filtros de membrana, filtros de nucleación  Radiaciones: ionizantes, ultravioletas MÉTODOS QUÍMICOS - Óxido de etileno - Formaldehído - Glutaraldehído - Gas plasma. Calor: Es el método preferido para esterilizar todos los materiales, excepto aquellos que sufren daño por su termosensibilidad. Es rápido, todos los mo son sensibles, y el calor llega a lugares que podrían estar protegidos para los agentes químicos. Los mecanismos de esterilización por calor húmedo se basan en la desnaturalización de proteínas, la fusión de los lípidos de la membrana y el daño de los ácidos nucleicos. La temperatura corresponde a la que se desnaturalizan la mayoría de las proteínas. Estos procesos requieren una temperatura más alta cuando el material está totalmente desecado o la actividad del agua del medio se reduce por una alta concentración de una sustancia neutra como por ej. glicerol o glucosa. 70°C : hongos, virus y cel vegetativas de las bacterias 121°C: endosporas bacterianas Calor seco: Es de aplicación limitada, porque se requieren temperaturas elevadas y pocos materiales resisten la acción oxidante del calor a esa temperatura en presencia de aire. Se puede llevar a cabo mediante acción directa a la llama: el material se lleva al rojo durante 5-10s (ansas), o pasando el material por la llama repetidas veces 2 ó 3 minutos; o bien colocando el material en un recipiente adecuado cubriéndolo de alcohol y encendiéndolo, de modo que la llama pase por todo el material durante 2 ó 3 minutos. Así se pueden esterilizar tijeras, agujas, portaobjetos. La incineración es el método más común de tratamiento de los desechos infecciosos, a Tº de 870 - 980º C. Frecuentemente se calienta el aire en el interior de una estufa diseñada especialmente para que asegure una distribución homogénea de la Tº. Se debe aprovechar la transmisión del calor por convención natural y en equipos de mayor magnitud se debe instalar una convención forzada para la circulación del aire; para lograr una temperatura uniforme en todos los puntos y acortar el tiempo correspondiente de esterilización. El calor seco requiere un período de exposición de una hora y media a 160º C o una hora a 180º C. Es importante tomar el tiempo desde que la estufa y el material alcanzan la temperatura deseada y cargar la estufa cuando está a Tº amb, porque la naturaleza del material a esterilizar, cantidad y tamaño influyen sobre el período de calentamiento. Aplicaciones. Para esterilizar material de vidrio, de metal, aceites, vaselina, soluciones oleosas (envasadas en recipientes herméticos), polvos cuya mala conductividad hace muy prolongado el tiempo de calentamiento si se los distribuye en recipientes de poca profundidad. Para que un material se pueda esterilizar por calor seco, debe tolerar temperaturas de 160 – 180º C sin sufrir alteraciones, y si se trata de un líquido, debe tener punto de ebullición por encima de esa temperatura. No toleran estas temperaturas los guantes, sondas, textiles, etc. No se pueden esterilizar medios de cultivo porque se deshidratarían. Las estufas (u hornos) de esterilización constan de una caja metálica con una puerta frontal y estanterías regulables, con ingreso de aire caliente, y con una salida regulable de aire en la parte superior, la fuente de calor es por calefactores eléctricos, y es regulable la temperatura por un termostato. La pared metálica puede ser doble con una cámara de aire entre ellas. La pared externa puede estar recubierta con un material aislante. Pueden estar provistas de un circulador de aire que oriente la convención forzada, de esta manera aumenta la homogeneidad y la velocidad de calentamiento. Se han establecido otros métodos de calor seco para aumentar la eficiencia, como la estufa de calentamiento de infrarrojo de gran velocidad que opera con vacío, diseñada para esterilización de instrumental quirúrgico. La misma funciona a 280º C en alto vacío, y el corte del vacío se realiza con nitrógeno estéril para evitar la oxidación de los bordes. El tiempo del ciclo total dura aproximadamente 15 minutos.

Calor húmedo: El método estándar es por autoclave a 121ºC, 15-20 min. Esa Tº de 121º C se logra con vapor de agua a 1 atm de presión sobre la Patm. Los objetos fríos son rápidamente calentados por la condensación sobre su superficie matando los mo por desnaturalización de las proteínas y disolución de los lípidos de las estructuras esenciales de los mismos. Existen distintos tipos de autoclaves: a vapor, con control digital, eléctricas, manuales y automáticos, de una o dos cámaras, verticales u horizontales, pero todos se fundamentan en el mismo principio: al aumentar la P interna del autoclave aumenta el Pebullicion del agua. Fundamentalmente hay 3 tipos de autoclave de uso común: a) Autoclave de laboratorio (Chamberland): consiste en una cámara de esterilización que genera su propio vapor a partir de agua contenida en el fondo de la cámara, por medio de calentamiento interno (eléctrico) o externo (gas). Posee un manómetro que registra la P interna, una válvula de seguridad y puede contener un termómetro. El aire es retirado desde la cámara a través de la espita durante el período de calentamiento y ebullición inicial. Debido a la eyección de gotas de agua desde la superficie del agua hirviendo, éste autoclave es adecuado para recipientes con líquido. Otros artículos, como, ropa o aparatos, incluyendo sus envolturas, se humedecerán con agua durante la esterilización, pudiendo producir su recontaminación al ser introducidos en una atmósfera no estéril. b) Autoclave de alto vacío: está diseñada para la esterilización rápida de artículos secos como ropa, artículos de goma, etc. Consiste en una cámara revestida que puede ser evacuada a baja presión. El ciclo total puede demorar solamente 25 a 30 minutos. c) Autoclave de desplazamiento inferior de vapor: es una cámara alimentada con una fuente externa de vapor. Como el vapor que penetra es menos denso que el aire a la misma Tº, este último es desplazado y ventilado a través de una apertura en el punto más bajo de la cámara. Completado el ciclo este tipo de autoclave permite un secado final de la carga por pasaje de aire caliente esterilizado por filtración. Hay diversos ciclos de temperatura/tiempo recomendados para la esterilización por autoclave, pero se recomienda el calentamiento a 121º C por 15 minutos como mínimo. Autoclave tipo Chamberland, instrucciones en el manejo y precauciones con respecto al material a esterilizar: - Controlar que el fondo del autoclave tenga agua suficiente para todo el proceso (debe llegar hasta la rejilla). - Colocar el material que no debe estar herméticamente cerrado. - El material debe estar envuelto en papel poroso para preservar su posterior esterilidad. - El volumen de los recipientes no debe ser más de la mitad o de las 2/3 partes del volumen del recipiente para evitar proyecciones y permitir que el líquido entre en ebullición libremente sin mojar los tapones. - Se cierra la tapa ajustando las charnelas o mariposas en forma enfrentada para asegurar el cierre hermético. - Encendidos los mecheros se abre la espita hasta que salga todo el aire contenido en el interior del autoclave, lo que se determina cuando sale flujo continuo de vapor de agua por la espita. Si queda una mezcla de aire y vapor en el interior, por ser el aire menor conductor del calor se logran Tº insuficientes para la correcta esterilización (la P resultante será menor cuando mayor sea la cantidad de aire que contenga el autoclave). - Se cierra la espita, el manómetro marca el aumento de P hasta una atm correspondiente a 121ºC. La P absoluta en el interior es de 2 atm considerando que la presión atmosférica es de 1 atm, se deja 15-20min. - Si el objeto a esterilizar es muy voluminoso, la transferencia de calor a su interior tarda más tiempo, y se debe aumentar el tiempo total de calentamiento. También se requieren mayores tiempos con grandes volúmenes de líquidos, dado que los estos tardan más tiempo en alcanzar la temperatura de esterilización. - Transcurrido el tiempo necesario se apagan los mecheros. - Se abre la espita lentamente para evitar que por diferencia de presión salten los tapones. - Abrir el autoclave. - Si el material es de vidrio o metal se lleva a estufa para el secado total. Si son medios de cultivo se realiza el control de esterilidad y se guardan en heladera. Ciclo típico de un autoclave.

Tyndalización Se puede realizar: • A vapor fluente (olla presión o autoclave con espita abierta) • Baño María a ebullición Es un método de esterilización por calor húmedo en más de un proceso. Consiste en calentar a 100º C por 20 min 3 veces a intervalos de 24 horas: el primer calentamiento destruye todas las formas vegetativas de los gérmenes que pudieran estar presentes, luego se incuba 24 h a 37º C o a Tºamb y si el medio es adecuado (suficientemente rico para permitir la germinación de las esporas) las esporas que pudieran estar presentes germinarán (shock térmico) y pasarán a la forma vegetativa, al aplicar el segundo calentamiento serán muertas estas formas vegetativas provenientes de las esporas, se vuelve a incubar 24 h en las mismas condiciones anteriores, si alguna espora no germinó durante la primera incubación lo hace ahora y al calentar por tercera vez se destruirán. Este proceso en la industria suele repetirse 5 veces o más. Se pueden tyndalizar: leche, gelatina, hidratos de carbono, es decir sustancias que no resisten altas temperaturas y a su vez tienen una composición química tal que permiten la germinación de las esporas. No se pueden tyndalizar: solución de electrolitos, agua destilada, sn fisiológica, buffers, sn de bicarbonato. Ventajas del calor húmedo con respecto al calor seco • Menor tiempo de esterilización • Menor Tº • El calor húmedo es más penetrante que el calor seco • Se pueden esterilizar medios de cultivo y otros líquidos como solución fisiológica (SF), agua destilada (AD). Pasteurización: Es un proceso que reduce la población microbiana en leche y otros alimentos sensibles al calor. Pasteurización no es sinónimo de esterilización porque en ella no se destruyen todos los microorganismos. Inicialmente se utilizó la pasteurización para destruir bacterias patógenas como organismos causantes de tuberculosis, brucelosis y fiebre tifoidea. Impide la transmisión de patógenos que actualmente sí son habituales como Listeria monocytogenes, y algunas especies de Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli O157:H7. También retrasa el crecimiento de organismos alterantes e incrementa la vida útil de los líquidos perecederos. Muchas bacterias relativamente resistentes al calor (termodúricas) sobreviven a la pasteurización pero es poco probable que causen enfermedad o el deterioro de la leche refrigerada. Procesos de pasteurización: • Pasteurización alta (Denominada de corta duración a alta temperatura: high-temperature short-time; HTST): la leche se bombea a través de un tubo que está en contacto con una fuente de calor. Este procedimiento emplea temperaturas de 71-72º C por 15s. Luego la leche se enfría rápidamente. • Pasteurización baja: la leche se calienta en grandes depósitos a 63-66º C durante 30 min. Este procedimiento es menos satisfactorio porque la leche se calienta y se enfría lentamente y debe mantenerse a Tº altas por períodos de tiempo más largos. • Temperaturas ultra elevadas (ultra-high-temperature, UHT): Tº alcanzadas 140-150º C por escasos segundos (menos de 3s), es un proceso continuo, se requiere envasado aséptico y se logra esterilidad comercial. Filtración: Es aplicable a la esterilización de líquidos y gases y los mo son removidos y no destruidos. El método es rápido y puede llevarse a cabo a cualquier Tº. Se aplica cuando el líquido es termosensible. El filtro es un dispositivo con poros demasiados pequeños para que pasen los mo pero lo suficientemente grandes para permitir el paso de un líquido o un gas. El tipo de filtro de esterilización seleccionado dependerá del tamaño de las sustancias contaminantes que se quieran excluir. Algunas células microbianas pueden medir más de 10 µm de diámetro, mientras que las bacterias más pequeñas tienen un diámetro inferior a 0,3 µm. Se usa para esterilizar aceites, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, radioisótopos, vacunas, hidratos de carbono, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas. Existen tres tipos de filtros: a) Filtros de profundidad: Constan de una lámina fibrosa compuesto de matrices dispuestas al azar de fibras de papel, asbesto o vidrio que se solapan. En este tipo de filtros las partículas quedan atrapadas en las tortuosas vías creadas a través de la profundidad de la estructura. Dado que el material de filtración está dispuesto al azar en una lámina gruesa, los filtros de profundidad se emplean a menudo como prefiltros para eliminar las partículas más grandes de las suspensiones líquidas y evitar la obstrucción del filtro final del proceso de esterilización. Los filtros de profundidad también se utilizan para esterilizar por filtración el aire en los procesos industriales. En el ámbito doméstico, el filtro que se utiliza en los sistemas de aire acondicionado es para atrapar partículas de polvo, esporas y alérgenos. Los filtros de profundidad son importantes para las aplicaciones de bioseguridad. Por ej. En las manipulaciones de cultivos celulares, cultivos microbianos, etc. Estas operaciones se pueden realizar en una

cabina de seguridad biológica con flujo de aire, dirigido a través de un filtro de profundidad llamado filtro de aire particulado de alta eficacia (HEPA). Un filtro HEPA típico consiste en una lámina de fibras de vidrio de borosilicato que se ha tratado con un aglutinante y se ha plega...