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Seminare zu den Vorlesungen 1928 Benjamin Griffith Experiment: Entdeckung der gen. Transformation - Streptococcus pneumoniae des S-Stammes töten Mäuse - Streptococcus pneumoniae des R-Stammes töten keine Mäuse - hitzeinaktivierte „S“-Bakterien sind nicht pathogen - hitzeinaktivierte „S“-Bakterien und nicht-pathogene „R“-Bakterien sind zusammen tödlich

=> Eine chem. Komponentde der toten „S“-Zellen kann „R“-Zellen durch Transformation Pathogen machen (transformierendes Agens bleibt unbekannt) 1944 Avery, McLeod, McCarty: Identifikation der DNA als transformierendes Agens Entfernung unterschiedliche Bestandteile des inaktivierten „S“-Bakterien-Extrakts und Injektion des veränderten Extrakts + „R“-Bakterien in Maus -> Bei Entfernung aller Bestandteile (Polysaccharide, Proteine, RNA, Lipide) entstehen lebende „S“-Bakterien mit pathogenem Charakter, die Maus töten AUßER: bei Zerstörung von DNA => DNA muss transformierendes Agens sein, Beweis, dass Erbinformation aus DNA besteht 1952 Hershey und Chase: biochemischer Beweis, dass Gene aus DNA bestehen Ausgangslage: Bakteriophagen injizieren bei der Infektion ihre Erbanlage ins Bakterium Vorgehen: Markierung zweier Phagenpräparate: 1. Proteine mit radioaktivem 35S 2. DNA mit radioaktivem 32P Ablösen der Phagen von Bakterienoberfläche, Zentrifugation Beim 2. Präparat entstehen wieder radioaktive Phagen -> Erbmaterial der Phagen besteht aus DNA und nicht Proteinen Seminar 4 Identifikation von Genanzahl im Genom - bei kleinen Genomen: Sequenzierung - bei großen Genomen: Problematischer, da nur ein Teil des Genoms protein-codierend ist - Genomgröße des Menschen: 3,1 x 106 (ca. 22.000 Gene) Arabidopsis Thaliana 125 x 106 (ca. 26.000 Gene) Experiment zur Identifikation des Replikationsmechanismus: Meselson-Stahl-Experiment 3 Möglichkeiten: + konservativ + dispersiv + semikonservativ Vorgehen: 1. E. coli in Nährmedium mit schweren Stickstoff-Isotop 15N 2. Überführung in Nährmedium mit leichtem Stickstoff-Isotop 14N 3. Isolation der DNA aus Tochterzellen nach 1, 2, 3 Generationen

4. Analyse der DNA durch Dichtegradientenzentrifugation (isopyknische Zentrifugation) 1

Konservativ Ergebnis:

semikonservativ

dispersiv

Experiment zum Nachweis der semi-konservativen Replikation bei Eukaryonten 1. Wachstum von Zellen in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin (BrdUMP2 = Desoxythyminderivat) -> Einbau in DNA 2. Nachweis durch Giemsa-Färbung (hellere Farbe)

Durch Crossing-over Funktionsweise des Replisoms: - Koordinierung der gleichzeitigen Synthese von Leading und Laggingstrand Wie? 1. Bildung von DNA-Polymerasedimer 2. kontinuierliche Synthese am Leadingstrand entlang der Replikationsgabel 3. DNA-Polymerase am Laggingstrand bindet an Primer, diskontinuierliche Synthese entgegen der Replikationsgabel -> Schlaufenbildung am Laggingstrand 4. Nach Fertigstellung eines Okazakifragments dissoziiert DNA-Polymerase vom Laggingstrand, bindet erneut an nächsten Primer 5. entstandene Geometrie ermöglicht gleichzeitige Synthese 1000 Bp/s 1 DNA-Bande sammelt sich dort, wo Dichte dem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten entspricht 2 Ersetzung der Methylgruppe am 5‘ C-Atom durch Brom

Seminar 5 DNA-Methylierung und post-replikative DNA-Reparatur - Methylierung von Adenin (prok.) und Cytosin (prok., euk.) als post-replikative Modifikation -> Bei Bakterien: viele GATC-Sequenzmotive an A methyliert -> bei Eukaryonten: viele CG-Sequenzmotive an C methyliert, seltener auch CNG-Sequenzen => Sequenzmotive sind palindrom, deshalb sind Tochterchromatiden nach Replikation hemimethyliert, aber Methylierungsmuster werden Maintenance Methylase aufrechterhalten, indem diese neue Stränge entsprechend methylieren

Nutzen für MMRS bei der postreplikativen Reparatur von Fehlpaarungen! MutH bindet bevorzugt an hemimethylierte Sequenz, gleichzeitig bindet es an MutL-MutSKomplex (ist an Mismatch gebunden), Schlaufenbildung -> MutH erzeugt Es-Bruch im nicht-methylierten Strang, exonukleolytische Degradierung, sodass der ursprüngliche Strang erhalten bleibt -> keine Genkonversion bei post-Replikationsreparatur

Phänotypische Beobachtung der Genkonversion an Ascomyceten - Teilung der Zellen währen Meiose und Mitose in einer Dimension, bleiben aneinander hängen = Ascus mit 8 haploiden Sporen - Entstehung unterschiedlicher Asci, abhängig davon, ob Genkonversion durch Reparatur von Heteroduplex-Bereichen erfolgt ist -> unterschiedliche Möglichkeiten abhängig davon, ob überhaupt Reparatur erfolgt ist und welcher der Stränge degradiert wurden

Seminar 6 PCR: Polymerasekettenreaktion - deutlich schneller als DNA-Sequenzierung - exponentielle Amplifikation (Vermehrung) eines zwischen 2 Primern liegenden DNAFragments - Voraussetzung: + ein Teil des DNA-Sequenz beider ES muss bekannt sein, um Primer zu synthetisieren + Primer, dNTP’s, Taq-Polymerase (thermostabil), Puffer + Thermocycler, Gelelektrophorese-Equipment zur Analyse - Ablauf: 1. Denaturierung des DNA-DS bei 95°C 2. Anlagerung der Primer bei 60°C 3. Synthese des komplementären Strangs mithilfe der Taq-P. bei 72°C 4. Wiederholung der Schritte 1-3 => erst nach 3. Zyklus entstehen amplifizierte doppelsträngige DNA-Fragmente (=2) -> anfangs keine exponentielle Amplifikation, sodass gilt: 2n-2n -> exponentielle Amplifikation erst ab 4. Zyklus -> Abbruch des exponentiellen Verlaus nach gewisser Zyklusanzahl durch Mangel an dNTP’s, Primern oder Taq-Polymerase-Aktivität -> alle 10 Zyklen erfolgt Vertausendfachung (nach 10 Zyklen Vertausendfachung nach 20 Zyklen Vervielfachung um 1 Million)

Zu den Rechnungen 1. Wieviel DNA-Menge brauche ich um nach 27 Zyklen 100ng Produkt zu haben? 100 ng= 108fg (Femtogramm), wenn 100ng Produkt gebildet werden soll braucht man bei 27 Zyklen 100ng/227ng DNA-Menge als Template -> 227= 134217728 = 108x 1,3 => 108/ 1,3x108= 0,77 fg 2. Wie lang muss Primer sein, um durchschnittl. nur einmal im menschl. Genom vorhanden zu sein? Genomgröße = 3 x 109 Eine der 4 Basen kommt an Stelle mit P= ¼ vor Bei 16 Basen = 1/416= 1/ 4,3 x 109 => 16bp langer Primer kommt theoretisch nur einmal vor Gelelektrophorese - einer der häufigsten analytischen und präparativen Techniken in Molekularbiologie zur Größenfraktionierung und Aufreinigung von DNA-Fragmenten - Equipment: + elektr. ungeladenes Geliermittel: Agarose, Stärke, Polyacrylamid + Gelkammer mit Geltaschen + Gleichstromquelle + Laufmittel: Puffer = elektrisch leitfähige wässrige Lösung (häufig „TAE“ = Trisacetat) + EDTA als Konservierungsmittel - Ablauf: 1. Befüllen der Geltaschen an der Kathode (-) mit negativ geladenen DNA-Fragmenten 2. Erzeugung einer Spannung 3. DNA-Wanderung abhängig von Fragmentgröße und Ladung -> kleine Fragmente am schnellsten, aufgrund geringsten mechanischen Widerstands in porösem Laufmittel

3. Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Menschen für alle 12 VNTRs die gleiche Allelkombination tragen (Annahme: 10 mögliche Allele pro VNTR)? -> Bei diploiden ist Wahrscheinlichkeit pro Allelkombinatioen 1/100, für alle Allele also 1/100 x 12 = 10 -24 -> bei 10 Mill. Menschen = 1010 ist Wahrscheinlichkeit für Übereinstimmung aller Allele = 10-14...