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TD d’absorption...

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TD Spectrométrie UV Exercice 1. Caractéristiques des ondes électromagnétiques Compléter le tableau suivant en précisant le domaine de la radiation étudiée à l’aide de la figure 1 (h = 6.62 10-34 J s).

λ (nm)

ῡ (cm-1)

ν (kHz)

E (kJ)

E (eV)

Domaine

200 103

Figure 1. Spectre électromagnétique Remarque : on rappelle que 1 eV correspond à 1.6 10-19 J. Exercice 2. Spectrométrie UV d’acides aminés aromatiques Des solutions contenant des résidus tyrosine et tryptophane peuvent être différenciées en milieu alcalin d’après leur spectre d’absorption dans l’UV. Dans une solution d’hydroxyde de potassium à 0.1 mol.L-1, les coefficients d’extinction molaire sont donnés dans le tableau 1 cidessous. -1

-1

 à 240 nm (L cm mol )  à 280 nm (L cm-1 mol-1)

Tyrosine 11300 1500

Tryptophane 1960 5380

Tableau 1. Coefficients d’extinction molaire de la tyrosine et du tryptophane. Un échantillon de 10 mg de protéine est soumis à une hydrolyse totale non acide et dilué dans un volume final de 100 mL d’hydroxyde de potassium à 0.1 mol.L-1. L’absorbance dans une cuve de 1 cm est respectivement 0.717 à 240 nm et 0.239 à 280 nm.

1) Donner les formules développées de la tyrosine et du tryptophane 2) Calculer les concentrations en tyrosine et en tryptophane 3) Estimer la quantité de Tryptophane et de tyrosine par masse de protéine. Exercice 3. Spectrométrie UV du NAD+/NADH (d’après Rover et al., Analytical biochemistry 260, 50-55 (1998)) Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide ou NAD est un accepteur d’électrons essentiel dans l’oxydation des molécules énergétiques telles que le glucose et les acides gras. Il est présent dans toutes nos cellules à des concentrations millimolaires. La partie réactive de sa forme oxydée NAD+ est son cycle nicotinamide, dérivé de la pyridine (Figure 2). Dans l’oxydation d’un substrat, le cycle nicotinamide accepte un ion hydrogène et deux électrons qui constituent l’équivalent d’un ion hydrure, ce qui aboutit au NAD réduit qu’on appelle le NADH (Figure 2, droite).

Figure 2. Formules développées du NAD+ et du NADH. Les groupements responsables des bandes d’absorption présentes sur le spectre UV entre 200 et 400 nm (figure 3) sont les groupements AMP (encadré sur la figure 2) et les groupements pyridines (encerclé sur la figure 2). Les calculs théoriques indiquent que les transitions → * des groupements pyridine absorbent à 320 nm et 249 nm pour la NADH et la NAD+ respectivement. 1) Quel spectre représenté sur la figure 3 correspond à celui du NADH ? 2) Calculer le coefficient d’extinction molaire de la bande d’absorption située à 260 nm, sachant que le spectre a été obtenu pour une solution de concentration 3.0  10-5 mol.L-1 et que l’épaisseur de la cuve utilisée vaut 1cm.

3) Le coefficient d’extinction molaire du NADH à 340 nm est de 6.22  103 L. mol-1.cm-1. Si 20.8 % de la lumière incidente à 340 nm d’une solution donnée de NADH est transmise, quelle sera la concentration du NADH en solution si le trajet optique de la cuve utilisée vaut 1 cm ? Groupement AMP

Figure 3. Spectres d’absorption obtenus pour des solutions de 3.0  10-5 M de NADH, adénine et adénosine mono phosphate (AMP) dans du tampon phosphate 0.1 M (pH 7.0)

Exercice 4. Dosage colorimétrique de protéine Afin de doser une protéine X par la méthode du biuret, on réalise dans un premier temps une gamme étalon à partir de l'albumine de sérum bovin (notée ASB). Pour des concentrations massiques d'ASB de 1,0 /2,0 /3,0 / 4,0 / 5,0 et 8,0 mg.mL-1, on mesure à 540 nm des absorbances A respectives de 0,120 / 0,240 / 0,360 / 0,480 / 0,580 et 0,760. Dans un second temps, on mesure les absorbances obtenues en travaillant par dilutions successives à partir d'un échantillon de concentration initiale Co en protéine X. Le mode opératoire du test du biuret est identique pour la protéine X et pour la gamme étalon. Les absorbances mesurées à 540 nm dues au complexe entre le cuivre alcalin présent dans le réactif utilisé pour le test et les liaisons peptidiques sont alors: Concentration C0 Absorbance 1.579

C0/2 1.103

C0/4 0.686

C0/8 0.360

C0/16 0.180

C0/32 0.090

C0/64 0.045

1) A partir des mesures faites sur l'ASB, calculer le produit [coefficient d’extinction molaire à 540 nm  longueur de la cuve], noté   l, en traçant A = f(C) ?

2) Pourquoi teste-t-on ici plusieurs concentrations de l'échantillon protéique? Quelles sont celles que vous retenez pour l'exploitation? 3) Quelle est alors la concentration C0 de la protéine X ?...