TD6-lamine~1 - Notes de cours Td PDF

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Td 2021...

Description

TD6 : filaments intermédiaires Les lamines A et C, codées par le gène LMNA, font partie de la grande famille des filaments intermédiaires et sont exprimées de manière ubiquitaire dans les cellules différenciées. Ce sont des protéines nucléaires qui s’associent avec la lamine B et les protéines de l’enveloppe nucléaire interne pour former la lamina nucléaire. 1/ Des mutations dans le gène LMNA conduisent à des cardiomyopathies familiales. Des analyses ultrastructurales en microscopie électronique à transmission ont été réalisées sur les cellules cardiaques d’un patient porteur d’une délétion dans le gène LMNA. A

B

C

A : cellule musculaire cardiaque d’un individu sain. B et C : cellule musculaire cardiaque d’un patient atteint d’une délétion du gène LMNA. Question : que pouvez-vous déduire de l’observation de ces images (l’image en C étant un grossissement de l’image en B)?

2/ Dans le but de mieux comprendre le rôle de la lamine A/C, des souris knock-out ont été obtenues par invalidation du gène correspondant de la manière suivante :

A la naissance, les souris KO -/- ne sont pas distinguables des +/+ ou des +/-. A partir de 3-4 semaines, leur taux de croissance diminue (poids diminué de 50%) alors qu’elles continuent à manger normalement.

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Elles présentent une démarche anormale, une incapacité à s’accrocher sur une structure à l’aide des pattes avant et montrent une cypho/scoliose. A 8 semaines, toutes les souris KO -/- sont mortes. Les KO +/- sont identiques aux +/+ sans mortalité prématurée.

Dans un premier temps, des analyses histologiques ont été réalisées sur 2 types de muscle : le muscle squelettique et le muscle cardiaque sur les souris +/+ et -/-. Que pouvezvous en déduire ?

Puis, des expériences d’immunofluorescence ont été réalisées sur des cellules issus des souris +/+ et -/-. Deux anticorps ont été utilisés (marquage rouge), un anticorps permettant de reconnaître la lamine A/C et un second reconnaissant la protéines Lap2 qui est une protéine de la membrane nucléaire interne. De plus le noyau a été marqué grâce au DAPI (molécule qui émet une fluorescence bleue lorsqu'elle se lie à l’ADN). Que pouvez-vous déduire de ces marquages ?

+/+ Un western-blot a été réalisé utilisant un anticorps anti-lamine A/C (qui révèle deux bandes de 74 et 65 kDa) et un anticorps anti-Emerine (protéine ubiquitaire de la membrane interne de l’enveloppe nucléaire dont l’anticorps révèle une bande de 34 kDa) (Figure a). Enfin, des marquages de la protéine Emerine ont été réalisés sur des cellules provenant des souris +/+, +/- et -/- (marquage rouge) et le noyau a été marqué au DAPI. Que pouvez-vous déduire de ces images ?

+/-

-/-

Enfin, des cellules provenant des souris lmna -/- ont été transfectées par un plasmide codant pour la lamine A/C. Puis les cellules ont été marquées par le DAPI (figure e), par un anticorps anti-lamine A/C (figure f), ou par un 2

anticorps anti-émerine (figure g). La figure h correspond à une superposition du marquage en f et en g. Que pouvez-vous conclure ? 3/ Des expériences in vitro ont ensuite été réalisées afin de mieux comprendre le rôle de la séquence NLS de la lamine A/C. Pour cela, la protéine a été délétée de son domaine NLS puis clonée dans un plasmide en fusion avec la GFP sous le contrôle d’un promoteur CMV (Figure A). Puis des cellules HeLa ont été transfectées avec un plasmide codant pour la protéine avec (LA) ou sans (LA-NLS) son domaine NLS et des immunofluorescences ont été réalisées en présence d’anticorps anti-GFP ou anti-lamine B1 (figure B). Enfin, la même expérience a été réalisées mais cette fois en présence d’anticorps spécifiques du réticulum endoplasmique granuleux (KDEL) ou de l’appareil de golgi (GM130). Que pouvez-vous déduire de l’ensemble de ces résultats ?

4/ L’actine nucléaire présente un rôle dans de nombreux processus biologiques mais son implication dans la viabilité et la fonction du noyau reste encore à éclaircir. Des expériences de co-immunoprécipitation (IP) ont donc été réalisées avec un anticorps anti-Lamine A/C (Lam A/C) ou un anticorps anti-Actine, et analysés par western-blot (WB) avec un anticorps anti-Lamine A/C, anti-G-actine ou anti-Lamine B. La piste protein G correspond au témoin négatif. Que pouvez-vous déduire des résultats de la figure ci-dessous?

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c) Afin de confirmer les observations précédentes au niveau ultrastructural, des expériences d’immunomarquage à l’or suivies d’observations en microscopie électronique à transmission ont été réalisées sur des coupes ultrafines de cellules cardiaques contrôles (G) ou provenant de souris lmna -/(H) à l’aide d’anticorps anti Laminine A/C couplées à des billes de petite taille (5 nm), et d’anticorps antiG-actin couples à des billes de plus grande taille (15 nm). Que peut-on conclure de ces clichés?

d) Enfin, l’assemblage des filaments d’actine est régulé par des facteurs tel que la cofiline qui se fixe à l’actine G et permet sa dépolymérisation et la profiline qui empêche sa re-polymérization. Des expériences de western-blot ont été réalisées à partir d’extraits nucléaires de cellules cardiaques de souris +/+, +/- et -/- . Les différentes bandes du western-blot ont ensuite été quantifiées. Que pouvez-vous en déduire ? Les paramètres requis sont manquants ou erronés.

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Sources : - Sullivan et al., 1999, The Journal of Cell Biology, 147, 913-919. - Diercks et al., 2010, Cardiovascular Pathology 19, e135–e136. - V. Nikolova-Krstevski et al., 2011, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 50, 479–486. Wu et al., 2014, Nucleus, 5 :1, 66-74.

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