Tema 11 - Plegamiento de Proteínas PDF

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Apuntes completos, limpios e ilustrados de Estructura de Macromoléculas. Profesora: Irene Díaz Moreno...

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TEMA 11: PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS Hasta la fecha lo que se acepta es que es la secuencia de la proteína, es decir, su estructura primaria, la que contiene la información necesaria para llegar a la estructura tridimensional, el plegamiento, que siempre está dominado por interacciones débiles. En otras palabras, a partir de combinaciones de los 20 aminoácidos que forman las proteínas (no se sabe el código detrás de las combinaciones) se sabe empíricamente que esta secuencia contiene la información que posteriormente se manifiesta en el plegamiento. La misma secuencia puede adoptar distintos plegamientos, como en el caso de los priones, o si se realizan modificaciones postraduccionales, como fosforilaciones, que alteran el plegamiento. Es decir, se puede tener la misma secuencia con distintos plegamientos. Lo inverso también se puede tener, el mismo plegamiento con distintas secuencias (de hecho, de ahí nacen las clasificaciones de proteínas por plegamiento, como la CATH). Lo importante es que la información de estructura tridimensional siempre está en la estructura primaria. Las chaperonas evitan las “trampas energéticas”, aumentando la cinética del plegamiento, pero sin disminuir la energía de activación, no son catalizadores. Recordemos que el estado plegado es menos energético que el desplegado, es el estado de mínima energía en condiciones fisiológicas. Si consideramos que la secuencia determina la estructura, y la estructura determina la función, si somos capaces de determinar/descifrar el código de la estructura primaria se podrá predecir el plegamiento con sólo saber la secuencia aminoacídica, pudiendo explicar el mecanismo molecular de su función.

1. PARADOJA DE LEVINTHAL La paradoja de Levinthal demuestra que el plegamiento de proteínas no puede ser totalmente al azar: si se considera una secuencia aminoacídica normal de unos 100 aminoácidos, el conjunto de conformaciones diferentes posibles de estos 100 aminoácidos ocasionarán la existencia de 10100 confórmeros distintos, suponiendo unas 10 conformaciones diferentes por cada residuo. Por tanto, si las conformaciones cambian cada 10 -13 segundos, para que una proteína explore todo el espacio conformacional al completo, se requerirían 10 85 segundos, es decir, 10 77 años (mucho mayor que la edad del universo). Esto indica que el proceso de plegamiento no es totalmente aleatorio, tiene que haber otros mecanismos. Estos mecanismos se intentan explicar con los modelos de plegamiento de proteínas. Estos modelos pueden ser clasificados en dos tipos: los modelos clásicos y el actual.

2. MODELOS CLÁSICOS DE PLEGAMIENTO Alan Fersht, el padre de la teoría de plegamiento de proteínas, afirmó que es poco probable que sólo exista un único mecanismo en el plegamiento de proteínas. Se propusieron diversos modelos para explicarlo: •

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Modelo del rompecabezas (Jigsaw puzzle): Propone que diferentes moléculas de una misma proteína se pliegan a través de rutas diferentes que convergen en el estado nativo. Uno de los primeros en utilizar el término “ruta” referido a plegamiento. Modelo de armazón (Framework): La formación de elementos locales de estructura secundaria difunden y confluyen (difusión-colisión) en la estructura terciaria. En este modelo, los elementos de estructura secundaria se forman independiente de la estructura terciaria. Modelo de nucleación (Nucleation): Una serie de residuos próximos en la secuencia que forman un núcleo que presenta estructura secundaria preceden al plegamiento, formándose a continuación los motivos estructurales, asociaciones de estructuras secundarias. Sus pasos iniciales estarían dirigidos por la formación de puentes de hidrógeno Las hélices α se formarían espontáneamente. Modelo de colapso hidrofóbico (Hydrophobic collapse): El plegamiento tiene lugar por colapso hidrofóbico del polímero, sin que se formen elementos de estructura secundaria. El colapso está dirigido por la entropía del sistema. Los posibles intermediarios pueden quedar atrapados por barreras de naturaleza entrópica. En este modelo, las estructuras secundaria y terciaria se forman en paralelo.

3. MODELO ACTUAL DE PLEGAMIENTO: PAISAJE ENERGÉTICO Sea cual sea el modelo, se tiene que llegar a una estructura tridimensional dominada por interacciones débiles. Actualmente no se acepta un modelo que se base en las estructuras secundarias o terciarias, sino que el plegamiento viene controlado por rutas de interacciones débiles, por contactos entre grupos funcionales, que definen las rutas de plegamiento. Por tanto, se pasa de un concepto muy bioquímico (definir si ocurren primero las estructuras secundaria o terciaria) a un concepto más termodinámico, observando contactos entre grupos y los cambios de energía que generan. Se crea así el modelo del paisaje energético (Energy landscape), que considera múltiples rutas de plegamiento, todas dirigidas por los denominados contactos nativos (porque tienden al estado nativo), lo que consigue que el producto se forme mucho más rápido, al haber más rutas posibles. Si sólo existiera una única ruta, el tiempo de plegamiento sería mucho mayor. Existen “rugosidades” en el diagrama del embudo, por lo que dentro del estado desnaturalizado hay estados más favorecidos y otros menos, lo que provoca que la proteína se pliegue de una forma más eficiente o menos. Esto apoya que el plegamiento no se forme por estadios de

plegamiento, sino por múltiples rutas de plegamiento dominadas por contactos, en un tiempo relativamente corto. Este diagrama se puede describir desde un punto de vista termodinámico, estableciendo la entropía como el ancho del embudo, lo que hace que el estado desnaturalizado tenga un ancho de embudo mucho mayor que la del estado nativo (que supondremos que es único, a pesar de que tenga cierta variabilidad debido a la dinámica de la molécula). La altura del embudo representa la caída de energía, de entalpía, de tal manera que el estado desnaturalizado siempre está mucho menos favorecido energéticamente que el plegado; de no ser así, la proteína analizada sería una IDP. Aparte de esto, existen invaginaciones en el embudo (las rugosidades que hemos mencionado anteriormente): son trampas energéticas en las que la proteína puede caer al ser mínimos energéticos, formando intermediarios de reacción entre el estado desnaturalizado y el nativo (estaríamos considerando entonces una reacción de 3 estados: desnaturalizado, nativo e intermediarios). Además, existe un estado de transición, siendo la reacción irreversible si se alcanza dicho estado. Por eso no hay invaginaciones después del estado de transición, no hay más intermediarios, y la reacción de plegamiento hacia el estado nativo se lleva a cabo irreversiblemente. Si dibujamos el embudo del modelo paisaje energético, es importante no dibujar invaginaciones después del estado de transición. Si tenemos que representar las IDPs, el embudo tendría un ancho grande, ya que tienen una entropía grande al tener muchos estados de conformación, y existe una “meseta”, ya que todas tienen más o menos la misma energía, por eso no hay un estado favorecido y están desordenadas.

4. CARACTERIZACIÓN D E LOS ESTADOS CONFOR MACIONALES EN LA REACCIÓN DE PLEGAMIENTO Para seguir los estados de plegamientos se puede usar diversas técnicas, como puede observarse en la tabla.

Con respecto a la absorción UV, aunque no da información tridimensional, la absorbancia de los grupos prostéticos de las proteínas sí que cambia, de manera que, en algunas proteínas como los citocromos, se puede usar esta técnica para seguir el estado de plegamiento. El uso de la espectrometría de masas en estructura tridimensional es un caso muy particular que no veremos en la asignatura.

Si queremos hacer un experimento de desnaturalización química se suele usar una técnica, el “Stopped Flow”. Se tiene la proteína en estado nativo en tampón dentro de una jeringa y se va echando junto con urea en una probeta, en el mismo tampón para que no haya variaciones. Por tanto, se observa la desnaturalización de la proteína en presencia de agente desnaturalizante. Mientras se va echando la muestra en la probeta, se mide la fluorescencia. A medida que la proteína se desnaturalice, la intensidad de la fluorescencia debería aumentar ya que, en el estado plegado, las fenilalaninas y tirosinas pierden parte de su fluorescencia al sufrir un efecto de quenching con triptófanos cercanos. Al desnaturalizarse y perder el plegamiento, este efecto de quenching desaparece (la fluorescencia de triptófanos por tanto disminuiría al dejar de quenchear a las fenilalaninas y tirosinas, pero es mayor el aumento de fluorescencia de Phe y Tyr que la disminución de Trp, de ahí que la fluorescencia total de la proteína aumente). Se puede realizar un experimento de plegamiento si a la disolución que hemos obtenido anteriormente (proteína desnaturalizada con tampón y urea) se añade otra disolución sólo con tampón, diluyendo la muestra anterior y por tanto reduciendo la concentración de urea, provocando el plegamiento de la proteína. De esta manera se puede medir la fluorescencia a través del tiempo, inyectando parte de la jeringa 2 y midiendo fluorescencia alternativamente. Posteriormente, se ajustan los datos obtenidos a una ecuación monoexponencial creciente o decreciente, según sea de desplegamiento o de plegamiento respectivamente. En dicha ecuación, se tiene que: 𝐼𝑡 = 𝐼∞ · 𝑒 −𝑘·𝑡 Siendo 𝐼𝑡 la intensidad en un tiempo t, 𝐼∞ la intensidad tras un tiempo infinito (la asíntota), 𝑘 la constante cinética, y 𝑡 el tiempo. Estaríamos tratando en este caso una reacción del tipo: 𝐷 ↔ 𝑇𝑆 → 𝑁 Siendo D el estado desnaturalizado, TS el estado de transición y N el estado nativo.

Si se toman logaritmos a la ecuación exponencial [falso, según el libro de Alan Fersht se consigue sumando las ecuaciones de recta de las kf (k de plegamiento) y ku (k de desplegamiento), obteniendo kobs, y a continuación representándola frente a la concentración de desnaturalizante], se obtiene un diagrama de Chevron, o en uve, representando el logaritmo de la constante K frente a concentración de desnaturalizante, ya que a medida que aumenta el tiempo también aumenta la concentración de desnaturalizante. En este diagrama, se tiene una constante cinética a cada valor de concentración de desnaturalizante. Lo que se obtiene en definitiva son dos relaciones lineales con un punto de inflexión. La primera recta da los valores de Kpleg (K de plegamiento), es decir, la que se obtiene cuando se va diluyendo la muestra de proteína desnaturalizada y esta se va plegando; mientras que la segunda recta da valores de Kdes (K de desplegamiento), la que se obtiene cuando se va echando urea a una proteína nativa y esta se va desnaturalizando. Si existen intermediarios de reacción, estaríamos tratando una reacción de plegamiento de 3 estados. Entonces, la ecuación de la reacción, en lugar de ser monoexponencial, es biexponencial, con una fase primera rápida y una fase segunda lenta. Esto se debe a que, al obtener unos datos de fluorescencia, lo primero que se intenta es ajustar los datos a una función matemática, lo más simple posible. Si no se puede ajustar a una ecuación monoexponencial, se intenta con una biexponencial, como es este caso. De esta forma, la ecuación queda: 𝐼𝑡 = 𝐼∞ · 𝐴1 · 𝑒 −𝑘1 ·𝑡 + 𝐴2 · 𝑒 −𝑘2 ·𝑡 Fase rápida

Fase lenta

En el diagrama de chevron, esto ocasiona que los puntos obtenidos no siguen una recta, sino una curva. Al tener intermediarios, la recta que definía la reacción de plegamiento se curva en su extremo. Por tanto, no se puede extrapolar esta recta para determinar la constante de plegamiento en ausencia de desnaturalizante. En el caso de la constante de desplegamiento, sí que se puede extrapolar para obtener su valor en ausencia de desnaturalizante, ya que sigue siendo lineal. Si los intermediarios están en la reacción de desplegamiento, la curvatura aparecería en la recta de desplegamiento, y la reacción sería 𝑁 ↔ 𝐼 → 𝑇𝑆 → 𝐷.

No se puede tener curvatura en las dos ramas del diagrama de chevron simultáneamente, ya que una vez se llega al estado de transición la reacción se da irreversiblemente, y por lo que no puede haber intermediarios después de él. Si los intermediarios están después del estado de transición, la proteína será una IDP porque tendrá diversos estados conformacionales en lugar de un estado nativo. Podemos definir distintos tipos de estados conformacionales:

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Estados desnaturalizados o Presencia de interacciones locales e interacciones hidrófobas no locales: se forman “clusters”. El hecho de que la proteína esté en estado desnaturalizado no significa que la cadena esté totalmente desplegada, tiene ciertas interacciones. o Interacciones poco estables: plasticidad y dinamismo. o En presencia y ausencia de agentes desnaturalizantes: polipéptidos, mutantes inestables, modelos peptídicos, “proteínas desnaturalizadas en condiciones nativas”, intercambio de hidrógeno en condiciones nativas. Intermedios estables o Son representados por las invaginaciones del embudo en el modelo de paisaje energético. o Suficientemente estables (se mantienen a lo largo de un tiempo): glóbulos fundidos en equilibrio (molten globules). Los glóbulos fundidos tienen estructura secundaria, dando por tanto señal de dicroísmo circular en UV lejano, pero no tienen estructura tridimensional porque no se están dando todos los contactos nativos de la estructura nativa. Por tanto, el DC puede conducir a error en estos casos. En muchos casos, como en el glóbulo fundido del citocromo b562, no tienen la función de la proteína nativa. o Presentan: ▪ Gran cantidad de estructura secundaria. ▪ Ausencia de estructura terciaria. ▪ Molécula compacta. ▪ Superficie hidrofóbica accesible al solvente, lo que provoca que tengan tendencia a formar agregados. o Se suelen formar en el tiempo muerto de las técnicas o antes del paso limitante. Intermediarios cinéticos 0.8 Línea base estado nativo, N o Rápida formación durante el 0.7 0.6 tiempo muerto de aparatos de 0.5 flujo detenido, la fase ultraLínea base estado desnaturalizado, D 0.4 rápida. 0.3 0.2 o Sin embargo, pueden ser Fase ultra-rápida 0.1 registrados con técnicas 0.0 especializadas como el láser -0.1 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 pulsado, que permite medir los t (s) intermediarios cinéticos durante este tiempo muerto. Intensidad de Fluorescencia

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1.0

Como son inestables, no son representados como invaginaciones en el modelo de paisaje energético. o Las proteínas que no se pliegan secuencialmente pueden clasificarse en 3 categorías: primero, que el estado de transición tiene la misma energía que el estado desnaturalizado, dificultando que tenga lugar el plegamiento. Además, las prolinas suelen estar cambiando su conformación entre cis y trans en el estado desplegado, y por otro lado se pueden formar intermediarios no correctamente plegados. Estados de transición. o Es el estado de mayor energía a lo largo de la ruta que conduce del estado inicial al estado final. o El estado de transición (TS) se caracteriza por una elevada entalpía, porque se requiere un gran trabajo para generar las interacciones nativas que gobiernan el estado naturalizado. o La teoría del estado de transición supone que existe un equilibrio entre el estado de partida y el estado de transición. o

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También puede el caso de que haya una ausencia de A B intermediarios, en cuyo caso sería una reacción de dos estados, con un estado de transición. Su diagrama de Chevron sería lineal, tanto en la rama de plegamiento como la de desplegamiento, y su diagrama de energía sería como el representado en la imagen A, con un solo estado de transición. En el caso de que hubiera intermediarios, habría tantos mínimos de energía (y por tanto, tantos estados de transición) como intermediarios haya, como en la imagen B. La teoría del estado de transición considera que en una reacción de dos estados de plegamiento existe equilibrio entre el estado desnaturalizado y el estado de transición, y desde el estado de transición al estado plegado no existe equilibrio, es una reacción directa. Es decir: 𝐷 ↔ 𝑇𝑆 → 𝑁 Se pueden medir las diferencias energéticas entre los diferentes estados (desnaturalizado, de transición, y plegado) usando la técnica de calorimetría diferencial de barrido de alta sensibilidad (tema 10). La constante cinética de la reacción de plegamiento depende de la constante de Boltzmann (kB), la temperatura (T), la constante de Planck (h), y de la constante de equilibrio (K‡): 𝑘 = 𝑘𝐵 ·

𝑇 ‡ ·𝐾 ℎ

Conocida como ecuación de Eyring. Por otra parte, sabiendo que: ∆𝐺 ‡ = −𝑅𝑇 · ln 𝐾 ‡ Entonces, sustituyendo K ‡ en la ecuación de Eyring: ∆𝐺 ‡ 𝑇 − 𝑘 = (𝑘𝐵 · ) · 𝑒 𝑅𝑇 ℎ

Tomando logaritmos en esa ecuación se obtiene, de alguna forma oscura y desconocida, las fórmulas: ln(𝑘‡−𝑵,𝒖𝒓𝒆𝒂 ) = ln 𝑘‡−𝑵 + 𝑚‡−𝑵 · [𝑢𝑟𝑒𝑎] ln(𝑘‡−𝑫,𝒖𝒓𝒆𝒂 ) = ln 𝑘‡−𝑫 + 𝑚‡−𝑫 · [𝑢𝑟𝑒𝑎] Y la suma de ambas sería: 𝑘𝑢𝑟𝑒𝑎 = 𝑘‡−𝑵,𝒖𝒓𝒆𝒂 + 𝑘‡−𝑫,𝒖𝒓𝒆𝒂 Representando esta kurea frente a la concentración de urea, se obtendría un diagrama de Chevron del cual podemos obtener las constantes cinéticas extrapolando y viendo los puntos de corte con el eje Y.

Las ecuaciones y demás no las pregunta, aunque en realidad no son muy complicadas. Como la ecuación de Eyring es una exponencial se pueden tomar logaritmos.

4.0 3.5

ln k ‡-D

3.0 2.5

ln kurea

La idea importante es que este tipo de diagrama es una representación de medidas de fluorescencia en reacciones de plegamiento y desplegamiento, obteniéndose constantes de equilibrio y se pueden relacionar con constantes cinéticas.

2.0 1.5

m‡-D

1.0 0.5 0.0

m‡-N

-0.5 -1.0 -1.5

ln k ‡-N

-2.0 -2.5 0

2

4

6

8

[urea] (M)

Así, el diagrama de Chevron nos permite obtener datos cinéticos a partir de contantes de equilibrio.

5. SIMULACIONES DEL PLEGAMIENTO Se puede simular el plegamiento de una proteína mediante técnicas informáticas. Existen principalmente dos métodos o aproximaciones. El método Montecarlo perturba aleatoriamente el sistema: se calienta virtualmente la proteína a 300ºC y después se vuelve a enfriar la muestra, viendo lo que ocurre cinéticamente. Si el plegamiento es reversible sin añadir ningún tipo de proteína auxiliar o chaperona, se dará el replegamiento de la proteína. Así, se puede estimar la

caída en entropía una vez se repliega el sistema. Puede quedar atrapada en un mínimo energético local que no corresponde con la estructura de la que se parte, pero esto se minimiza si se repite el proceso muchas veces. La otra aproximación es el método de dinámica molecular, que aplica leyes de Newton de mecánica clásicas, usando funciones empíricas de energía potencial. El plegamiento determinado viene dado por los contactos nativos, de manera que, si representamos los contactos nativos frente a los contactos totales informáticamente, tenemos un estado desplegado con muy pocos contactos nativos y pocos contactos totales, frente al estado nativo que es muy discreto, con muchos contactos nativos y también totales. Los glóbulos fundidos tienen muchos contactos nativos y totales, pero menos que el estado totalmente nativo (es una estructura compacta después de todo). En la segunda gráfica, de temperatura frente a desnaturalizante, podemos ver que hay un estado de glóbulo fundido (MG, Molten Globule) que se presenta en un rango de temperatura más o menos amplio, pero en un rango bajo de concentraciones de agente desnaturalizante. Es decir, hay un estado nativo y desplegados estables en muchas variaciones de temperatura y agente desnaturalizante, y un estado de glóbulo fundido con una vida media mucho más restringida, con menos variabilidad de temperatura y agente desnaturalizante. La imagen muestra el tipo de simulaciones se puede obtener con estas técnicas. Aunque la simulación solo represente unos cuantos nanosegundos, hoy en día se pueden hacer simulaciones de uno o dos microsegundos. Estos métodos informáticos suelen ...