Tentamen 13 april 2007, vragen en antwoorden PDF

Preview

Summary

BLOK FA-106 1Eindtoets Blok FA-106: Ligand-Receptor Interactievrijdag 13 april 2007, 13.30-16.Aanwijzingen: Schrijf je tafelnummer, naam, voorletter(s), studentnummer en handtekening op alle antwoordvellen en grafiekenpapier. Indien dit niet gebeurt wordt de vraag niet nagekeken. Leg je bewijs van i...

Description

BLOK FA-106

1

Eindtoets Blok FA-106: Ligand-Receptor Interactie vrijdag 13 april 2007, 13.30-16.30u. Aanwijzingen: 1. Schrijf je tafelnummer, naam, voorletter(s), studentnummer en handtekening op alle antwoordvellen en grafiekenpapier. Indien dit niet gebeurt wordt de vraag niet nagekeken. Leg je bewijs van inschrijving klaar rechtsboven op je tafel. Dit wordt direct na de start gecontroleerd. Op de tafel ligt verder niets anders dan het uitgereikte materiaal. Verder zijn toegestaan schrijfmateriaal, liniaal en rekenmachine. Geen BINAS. Op de achterkant van dit blad staat een lijst met formules en grootheden vermeld. 2. Mobiele telefoon uit en van tafel. 3. De eerste 45 minuten mag de zaal niet verlaten worden; dit om laatkomers de gelegenheid te geven alsnog deel te nemen. 4. Blijf niet bij de uitgang staan praten. Dat stoort de nog werkenden. 5. In geval van vragen: hand opsteken. In geval van toiletbezoek gaat een surveillant(e) mee tot aan de deur. 6. Bij dit formulier zitten 4 tentamenvragen. Verder zijn uitgereikt een geniet setje met antwoordvellen en 4 vel millimeterpapier. Gebruik ook de achterkant van het antwoordvel indien nodig. Ook is een vel kladpapier uitgereikt. Lever alles behalve het kladpapier weer in. 7. Beargumenteer de antwoorden beknopt. Geef de resultaten van berekeningen weer in decimale vorm (dus niet a = log√2, maar a = 0,150). Houd rekening met nauwkeurigheden (geef dus een juist aantal decimalen weer). Let op het teken en vermeld altijd de juiste eenheden bij assen en berekende waarden, ook als daar niet expliciet om gevraagd wordt!!! 8. De puntenwaardering is bij de opgaven aangegeven. Voor de duidelijkheid: Totaal 100 punten. 9. Vul de korte enquête in en lever deze in samen met de antwoorden. Zorg dat de onderwijsgroep correct is ingevuld.

Het gecorrigeerde tentamen en de antwoorden liggen na bekendmaking van de uitslag gedurende 30 dagen ter inzage op het secretariaat van de sectie Medicinal Chemistry and Chemical Biology op kamer Z703 (tel. 030-2537307).

Verspreiden niet toegestaan | Gedownload door: Jantje Groothuizen | E-mail: [email protected]

BLOK FA-106

2

De volgende eenheden, constanten en formules zijn beschikbaar bij de tentamens van blok FA-106. R =8,3145 J.K–1.mol–1 = 0,08206 L.atm.K–1.mol–1 = 1,9872 cal.K–1.mol–1 R.T (25°C) = 592,5 cal.mol–1 = 2479,0 J.mol–1 1 cal = 4,1840 J 0°C = 273,15 K m =10–3 µ = 10–6 n =10–9 p = 10-12 f = 10-15 Formules

k = Ae

−

⎛ α ⎞ pH = pK + log⎜ ⎟ ⎝ 1− α ⎠

Ea RT

ΔG° = ΔH ° − TΔS° y=

ν c

Δ G° = − RT ln K ⎛ y ⎞ log⎜⎜ ⎟⎟ = log K + logc ⎝ 1− y ⎠

Kc (1 + Kc)

⎛ S ⎞ V0 = Vmax ⎜⎜ ⎟⎟ ⎝ S + Km ⎠

= nK − ν K

V0 = Vmax − V0

Km S

V0 =

1 ⎛ Km =⎜ V 0 ⎜⎝ V maxS

Km 1 1 = + V 0 V max S V max ⎛ 1 1 Km = + ⎜⎜ V0 V max S ⎝ V max V I =1+ Vi Ki

Vmax S ⎛ I ⎞ ⎟⎟ S + K m ⎜⎜ 1 + ⎝ Ki ⎠

⎞⎛ I ⎞ ⎟⎟⎜⎜1 + ⎟ K i ⎟⎠ ⎠⎝

⎞⎛ I ⎟⎟⎜⎜1 + ⎠ ⎝ Ki

1 ⎛ K m ⎞⎛ I ⎟⎟⎜⎜1 + = ⎜⎜ V0 ⎝ Vmax S ⎠⎝ K i

V K =1 + m Vi Ki

⎞ 1 ⎟⎟ + ⎠ V max

⎞ ⎛ 1 ⎟⎟ + ⎜⎜ ⎠ ⎝ V max

⎛ I ⎞ ⎜⎜ ⎟⎟ ⎝ Km + S ⎠

⎞⎛ I ⎞ ⎟⎟⎜⎜1 + ⎟ K i ⎟⎠ ⎠⎝

BLOK FA-106 Vraag 1 (20 punten). α1-Adrenerge receptoren behoren tot de familie van G-eiwit gekoppelde receptoren en spelen een belangrijke rol bij de regulatie van diverse fysiologische processen in het lichaam. Op basis van farmacologische experimenten heeft men minimaal 3 receptor subtypes onderscheiden, te weten α1A-, α1B- en α1D-adrenerge receptoren. Het gebruik van α1A-selectieve antagonisten is interessant bij urineweginfecties, terwijl α1B-selectieve antagonisten bij hoge bloeddruk zouden kunnen worden toegepast. Onderzoekers wilden uitzoeken of cyclazosin, een α1B-selectieve antagonist, inderdaad werkzaam is op bloedvaten. Hiertoe hebben ze het effect van cyclazosin op noradrenaline-geïnduceerde contracties van ratte aorta bestudeerd. Van dit weefsel is bekend dat het voornamelijk α1B-adrenerge receptoren bevat. De volgende gegevens werden verkregen:

noradrenaline contractie (%) concentratie - cyclazosin (M) 3.10-11 1.10-9 3.10-9 1.10-8 3.10-8 1.10-7 3.10-7 1.10-6 3.10-6 1.10-5 3.10-5 1.10-4

0 11 24 45 65 80 91 100

contractie (%) + cyclazosin (3 μM)

0 2 5 20 30 51 70 86 93 99

Hierbij werd de contractie uitgedrukt als percentage van de maximaal haalbare contractie bij een hoge concentratie noradrenaline. a) Teken de concentratie-werkingscurves en bepaal voor beide curves de pD2waardes. (4 punten) b) Geef aan of cyclazosin kan worden aangeduid als een competitieve of een nietcompetitieve antagonist. Verklaar je antwoord. (2 punten) c) Bereken op basis van de gegevens uit bovenstaande tabel de inhibitie constante Ki voor cyclazosin. (6 punten) d) De onderzoekers bestudeerden ook de noradrenaline-geïnduceerde contractie van ratte aorta in aanwezigheid van 0,3 en 1 μM cyclazosin, waarbij EC50 –waarden van respectievelijk 0,08 μM en 0,3 μM werden gemeten. Bereken via lineaire regressie met behulp van de Schild-plot (tekenen mag, hoeft niet) de inhibitie constante Ki voor cyclazosin. Maak gebruik van de vergelijking:

pA2 = − log[I ] + log(CR − 1) waarbij CR (concentration ratio) = EC50 met antagonist / EC50 zonder antagonist. Gebruik bij je berekening alle beschikbare experimentele gegevens. (6 punten)

3

BLOK FA-106 e) Indien cyclazosin inderdaad selectiviteit voor α1B-adrenerge receptoren zou bezitten, wat verwacht je dan met betrekking tot de grootte van zijn pA2-waarde in weefsel waarin voornamelijk α1A-adrenerge receptoren aanwezig zijn (groter dan, gelijk aan of kleiner dan de waarde die je hebt gevonden in vraag d)? Verklaar je antwoord. (2 punten)

4

BLOK FA-106

5

Vraag 2 (25 punten). O2 N Jij als jonge onderzoeker participeert in een groter O onderzoek. Het is jouw taak een hydrolyse proces te bestuderen. Hierbij wordt een ester (zie structuur, MW O 181) gemetaboliseerd onder invloed van water en in aanwezigheid van het enzym chymotrypsine. Dit enzym kan ook peptide banden splitsen in de buurt van een grote hydrofobe groep. De reactie verloopt optimaal in aanwezigheid van 0,02 U/ml enzym en met een buffer met pH 8,0. Je gaat deze omzetting onderzoeken door het zelf opzetten van een experiment op kleine schaal. Daarvoor beschik je over een enzymoplossing met een activiteit van 50 U/ml. Verder beschik je alleen over kleine buisjes waar maximaal 1,5 mL in kan, een bekerglas van 50 mL en pipetten met een bereik van 20-200 en 2001000 μL. De ester heeft een maximale oplosbaarheid van 2,5 g/L in water en/of buffer. a) Maak een stockoplossing van de ester van 10 mM in buffer. Hoe ga je deze oplossing nauwkeurig maken? Beschrijf kort alle handelingen en berekeningen. (2 punten) b) Je wilt een Michaelis-Menten grafiek maken. Uit vooronderzoek is gebleken dat de Km in de buurt van 100 μM ligt. Maak een verdunningstabel voor dit experiment, waarbij het doel is de Km zo nauwkeurig mogelijk te bepalen. Omdat je productvorming wilt meten in de spectrofotometer mbv een kuvet is het totaal volume van het reactiemengsel l ml. Beschrijf alle essentiële stappen om tot deze tabel te komen. En geef ook aan in de tabel welke controles je meeneemt. (5 punten) c) Je partner in dit onderzoek is een farmaceutisch bedrijf dat een stof heeft gemaakt om dit proces te remmen. De structuur is nog niet vrijgegeven. Je voert een reeks experimenten uit waarbij je de omzetting stopt 10 minuten na het starten van de reactie. Hieronder staan je resultaten. De gemeten extincties zijn gecorrigeerd met een blanco. [Inhibitor] (mM) 0 1 2 4 8

Extincties Substraat (50 μM) Substraat (250 μM) 0,662 1,42 0,491 1,21 0,396 1,13 0,280 0,914 0,186 0,664

Bewerk deze data zodanig dat je de Ki van de inhibitor kunt bepalen. Teken de erbij horende grafiek. Bereken deze Ki zo nauwkeurig mogelijk. Gebruik daarbij lineaire regressie en geef de correlatiecoëfficiënt. Is dit een betrouwbaar experiment? Waarom of waarom niet? (6 punten) d) Wat is je conclusie over het type inhibitor? En meld je in je rapportage aan het bedrijf dat ze een “hit” hebben gemaakt? Verklaar je antwoorden. (2 punten) e) Het hydrolyse proces kan weergegeven worden zoals in onderstaand energiediagram. Beschrijf in je eigen woorden wat er in dit diagram wordt weergeven. Hoe heet dit type enzym mechanisme? (5 punten)

BLOK FA-106

f) Wat is het effect van toepassing van een buffer met een pH 6 op bovenstaand proces en zijn bindingsconstanten? (2 punten) g) Stel dat aan de fenylring van het ligand een extra carboxylgroep had gezeten, wat is dan het effect op het proces en zijn bindingsconstanten? (3 punten)

6

BLOK FA-106

7

Vraag 3 (25 punten). Door middel van een radioligand bindingsassay kan de binding van [3H]-oestradiol aan oestrogeenreceptoren worden bepaald. Deze bepaling is zinvol om zo effectief mogelijk de behandeling van borstkanker bij vrouwen in te kunnen zetten. De gegevens uit zo’n bindingsassay kunnen worden geanalyseerd d.m.v. lineaire regressie met behulp van de Woolf plot, waarbij F/B (op de y-as) wordt uitgezet tegen F (op de x-as) (F = vrije ligandconcentratie, B = specifiek gebonden ligand). De Woolf-formule kan worden afgeleid uit de volgende formule die het verband weergeeft tussen vrije ligandconcentratie en de specifieke binding:

B=

Bmax ∗ F KD + F

a) Leid zelf de Woolf-formule af. (5 punten) b) De analyse van een experiment leverde een KD van 235 pM en een Bmax van 40 fmol/mg eiwit op. Schets de Woolf-plot door de snijpunten op de x-as en y-as te bepalen en hierdoor een lijn te trekken. Geef de getalswaarde van de snijpunten met beide assen duidelijk weer. (5 punten) c) Schets in dezelfde figuur de lijn die zou worden verkregen indien de [3H]-oestradiol binding zou worden gemeten in aanwezigheid van een niet-competitieve antagonist. (5 punten) d) In sommige cellen zijn twee subtypes van oestrogeenreceptoren aanwezig. In onderstaande figuur zijn de resultaten weergegeven van een experiment waarin de binding van een radioactief gemerkte ligande werd gemeten in afwezigheid (curve 1) en aanwezigheid van een verdringer (curves 2 t/m 4, met verschillende verdringer concentraties). De radioactief gemerkte ligande bezit selectiviteit voor een van de receptor subtypes. Deze selectiviteit bedraagt een factor 1000. Neem de figuur over op je antwoordvel, en geef in deze figuur aan hoe je de 1000-voudige selectiviteit kunt bepalen en leg dit ook uit. (5 punten) e) Bezit de verdringer selectiviteit voor een van de receptor subtypes? Zo ja, voor de zelfde receptor als de radioactief gemerkte ligande of juist voor het andere receptor subtype? Verklaar je antwoord, waarbij je dient in te gaan op de concentratie afhankelijkheid van de interacties. (5 punten)

BLOK FA-106

8

Vraag 4 (30 punten). In een cel is een enzym E actief dat stof X omzet in Y. Dit reversibele systeem wordt in een reageerbuis (in vitro) bestudeerd. Gebruikt wordt een molaire ratio stof X ten opzichte van enzym van 5. Het mengsel van enzym en substraat wordt daarna een tijdje bij constante temperatuur gevolgd door het meten van concentraties. Het systeem komt na enige tijd in een evenwichtssituatie, waarbij maximaal 40% omzetting heeft plaatsgevonden. Voor deze vraag moet je twee aparte grafieken met vergelijkbare assen onder elkaar tekenen op hetzelfde vel grafiekpapier. a) Zet in een grafiek een as die de reactietijd voorstelt uit tegen de concentraties van zowel X, Y, E en EX in deze enzymreactie. Motiveer je keuzes in deze grafiek. (5 punten) b) In welk deel van de grafiek geldt het Michaelis-Menten model? Geef dit ook aan in de grafiek bij a). (2 punten) c) Stel je vindt in de reageerbuis onder Michaelis-Menten condities een omzetting van 20 μmol per minuut bij een concentratie X die tweemaal de Km is. Bereken de maximaal bereikbare snelheid. (4 punten) d) Het in vitro systeem heeft ook een associatie evenwichtsconstante. Bereken deze constante uitgaande van een startconcentratie aan stof X van 0,1 mM en een complexconcentratie in steady state die 50% bedraagt van de maximaal mogelijke. Geef duidelijk aan hoe je aan je antwoord komt. (5 punten) e) In de cel (in vivo) is deze omzetting echter onderdeel van een groter systeem: E1 + X ↔ Y + E2 ↔ Z De vorming van Z is een nu aflopende reactie. Schets in deze situatie in een grafiek wat er met de concentratie van stof Y gebeurt gedurende de complete omzetting van X naar Z. Zet voor de duidelijkheid ook de concentratie X in de grafiek. (5 punten) f) Stel dat cellulair onderzoek aantoont dat het product Z de vorming van Y nietcompetitief en concentratie afhankelijk kan remmen. Beschrijf nu zo volledig mogelijk in dit derde geval de situatie voor zowel de vorming van Y als de vorming van Z. (4 punten) g) Terug naar de reageerbuis. Enzym E1 en stof X (concentratie X gelijk aan Km) worden gemengd in aanwezigheid van 10 nM Z. Met in acht neming van de condities zoals in vraag c) vind je nu een omzetting van 12,2 μmol per minuut. Wat is de inhibitieconstante van stof Z? Geef duidelijk aan hoe je aan je antwoord komt. (5 punten)

Eindtoets FA-106 Antwoorden vraag 1. De gegevens in deze vraag zijn ontleend aan: Marucci et al., Eur. J. Pharmacol. 522, 100-107 (2005)

a)

pD2 van noradrenaline in afwezigheid van cyclazosin = 8 pD2 van noradrenaline in aanwezigheid van cyclazosin = 6 b) Cyclazosin is een competitieve antagonist, aangezien noradrenaline bij hoge concentraties nog steeds in staat is de maximale contractie te bereiken. c) schijnbare K D = K D * (1 +

[I] ) Ki

schijnbare KD = 10-6M, KD = 10-8M, [I] = 3 μM = 3.10-6M → Ki = 3.10-8M d) [I] (μM)

-log([I])

0

EC50 (μM)

log(CR-1)

0,01

0,3

6,5

0,08

0,85

1

6

0,3

1,46

3

5,5

1,0

2,00

pA2 = 7,7 (snijpunt rechte met de x-as) → Ki = 2.10-8M e) Je verwacht in dat weefsel een lagere affiniteit, dus een kleinere pA2-waarde (hogere Ki-waarde).

Antwoorden vraag 2. a) Een 1 M oplossing is 181 g/L = 181 mg/mL; 10 mM is dus 1,81 mg/mL. Dat is te weinig om nauwkeurig af te wegen: bv ongeveer 10,0 mg exact in 5,52 mL is 10 mM. Uitvoeren in bekerglas. Dit levert geen probleem op met de oplosbaarheid omdat deze 2,5 mg/mL is. Je kunt niet een meer geconcentreerde oplossing maken door deze beperking. Uitvoeren in een buisje van 1,5 mL is dus niet mogelijk. b) De volgende tabel is een van de mogelijkheden: Je gaat uitzetten ΔAbs/tijdseenheid tegen de [S]; buis 8 is gestopt op t=0 min; buis 1 is de blanco, buis 2 controle absorptie enzym; uitvoeren in duplo Verdun de ester met buffer van 10 mM naar 0,25 en 2,5 mM (of iets dergelijks; 250 + 750 μL (4x, 2,5 mM) en hieruit 100 + 900 μL (10x, 0,25 mM)). Verdun het enzym met buffer van 50 U/ml naar 0,2 U/ml (100 + 900 μL (10x) en hieruit 40 + 960 μL (25x); totaal 250x). Buisje 1 2 3 4 5 6 7 8

Enzym 0,2 U/ml (μL) 0 100 100 100 100 100 100 100

Buffer (μL) 1000 900 800 700 500 800 500 500

Ester 0,25 en 2,5 mM (μL) 0 0 100 (0,25) 200 (0,25) 400 (0,25) 100 (2,5) 400 (2,5) 400 (2,5)

Eind [Ester] (μM) 0 0 25 50 100 250 1000 1000

c) Uitzetten v/vi tegen [inhibitor] [Inhibitor] (mM) 0 1 2 4 8

Extincties/10 min Substraat Substraat (50 μM) (250 μM) 0,662 1,42 0,491 1,21 0,396 1,13 0,280 0,914 0,186 0,664

v/vi Substraat (50 μM) 1 1,35 1,67 2,36 3,56

Substraat (250 μM) 1 1,17 1,26 1,55 2,14

De omzetting in aanwezigheid van inhibitor is afhankelijk van [substraat], dus competitief. Formule: v/vi = 1 + (Km/Ki).(I/(Km + S)) Ki haal je uit de helling gebruikmakend van Km = 100 μM en S:

[S] = 50 μM geeft 0,320 = Km/(Ki.Km + Ki.S) → Ki = 2,08 mM (omdat [I] in mM); R2 = 0,9988 Voor [S] = 250 μM en helling 1,41 is Ki = 2,03 mM; R2 = 0,9976 Dit is een redelijk betrouwbaar experiment; beter in duplo. Eigenlijk dient de Km uit vraag b) exact bekend te zijn. d) Het is een competitieve inhibitor. Dit is geen “hit” omdat een goede remmer een Ki in het nM tot μM gebied behoort te hebben. e) Dit is een niet-sequentieel of Ping-Pong multisubstraat mechanisme. Ester + H2O + enzym →

O2N

+ HAc + 2H+ + enzym

O In het schema stellen voor: ES = complex van ester en enzym EA = het geacetyleerde enzym complex van ester en enzym; snelle reactie waarbij het fenolaat ion vrij komt EP = de hydrolyse van het covalent gebonden acetaat-enzym complex; langzame reactie P = het acetaat ion Er zijn twee transition state intermediairen. Volgens het schema is het een spontaan proces omdat ΔG° tussen begin en eind negatief is. f) De pH van 8 was optimaal dus gebruik van een buffer met lagere pH heeft een nadelig effect op de snelheid van omzetting. De Km wordt groter. Ook de andere bindingsconstanten (Ki, KD) zijn afhankelijk van de pH. g) Chymotrypsin knipt of hydrolyseert in de buurt van een hydrofobe groep. Indien een methyl groep wordt geplaatst op de ring neemt de snelheid al drastisch af door sterische hindering, maar een negatieve lading van de carboxyl groep zal de werking van het enzym volledig blokkeren. Er zal waarschijnlijk nog wel wat binding aan het enzym kunnen optreden, maar geen reactie.

Antwoorden vraag 3. a)

B=

Bmax ∗ F KD + F

→ →

F = ... + ... ∗ (F ) , B

want rechte y=ax+b met y=F/B en x=F dus:

B=

Bmax ∗ F K +F 1 F K +F F K 1 ⇒ D = ⇒ = D ⇒ = D + ∗ ( F) KD + F Bmax ∗ F B B Bmax B Bmax Bmax

b)

snijpunt x − as ⇒ y = 0 ⇒ 0 =

snijpunt y − as ⇒ x = 0 ⇒

KD 1 K + ∗ (F ) ⇒ F = − D ∗ ( Bmax ) = − K D = −235 pM Bmax Bmax B max

F K D 235 pM pM = = = 5.875 B Bmax 40 fmol / mg eiwit fmol / mg eiwit

c) Niet-competitieve antagonist: Bmax wordt kleiner, maar KD blijft hetzelfde. Dus, snijpunt met x-as blijft hetzelfde. Snijpunt met y-as wordt groter (zie formules vraag b). Ook goede redenering: helling = 1/Bmax, dus helling wordt groter.

d)

De concentratie-bindingscurve 1 laat duidelijk zien dat er sprake is van 2 bindingsplaatsen waarvoor de ligande verschillende affiniteiten heeft. De bindingsplaats waarvoor de hoogste affiniteit bestaat bindt de ligande in het concentratiebereik 10-11 – 10-7 M, terwijl hogere concentraties (10-7 – 10-4 M) nodig zijn om aan de bindingsplaats met lagere affiniteit te binden. Binding tot ca. 70% van het maximum vertegenwoordigt de bindingsplaats met hoge affiniteit, terwijl binding van 70 – 100% de lage affiniteits bindingsplaats vertegenwoordigt. Half-maximale binding aan de hoge en lage affiniteits bindingsplaatsen treedt op bij respectievelijk 10-9 M en 10-6 M (zoals aangegeven in de figuur), hetgeen overeenkomt met een 1000-voudig verschil in affiniteiten. e) De verdringer bezit selectiviteit jegens de 2 receptor subtypes. Immers, zou het niet-selectief zijn, dan zou een parallelle rechtsverschuiving zichtbaar moeten zijn (de ligande zou dan van beide subtypes evenveel worden verdrongen). De verdringer is in staat om de ligande van zijn hoge-affiniteits bindingsplaats te verdringen (de meeste verdringing is zichtbaar in het lage concentratie bereik, t.w. 10-11 – 10-7 M), dus de verdringer is selectief voor hetzelfde receptor subtype als de ligande.

Antwoorden vraag 4. a) Grafiek 1

b) Het allereerste stukje van de grafiek, waar stof Y nog vrijwel nul is en dus waar V0 geldt. V0 is de snelheid aan het begin van de reactie. c) M-M geldt, dus kun je de M-M formule gebruiken.

⎛ S ⎞ ⎟⎟ V0 = Vmax ⎜⎜ ⎝ S + Km ⎠ Hierbij is V0 20 μmol/min en [X] (= [S]) gelijk aan 2 * Km. Ingevuld in de M-M formule ...