Tinción de Feulgen - Nota: 9,5 PDF

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Universidad Nacional de Asunción

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biología

*Tinción de Feulgen

San Lorenzo- Ciudad Universitaria- Paraguay Año-2018 ______________________________________________________________ *Práctica n°1 presentada en la cátedra de Biología Celular **Alumna de la carrera de Biología Profesora de la cátedra Lic. Gloria Yaluff Profesora encargada de laboratorio: Lic. Sara Aguilar

Introducción La reacción de Feulgen depende de la presencia de desoxirribosa, en 1924 Feulgen y Rosenbeck desarrollaron la llamada reacción nuclear, en este método, los cortes de tejidos fijados se someten a una hidrólisis ácida débil con ácido clorhídrico y luego se trata con reactivo de Schiff, esta hidrólisis es suficiente para extraer el ARN, que desaparece, pero no el ADN. El mecanismo de la reacción, va de la siguiente forma, la hidrólisis ácida extrae las purinas a nivel de la unión desoxirribosa-purina del ADN y de esa manera libera los grupos aldehído de la desoxirribosa, luego los grupos aldehído libres reaccionan con el reactivo de Schiff, la

especialidad

de

la

reacción

se

confirma

tratando

los

cortes

con

desoxirribonucleasa, enzima que hidroliza el ADN (Robertis, 2008). Cuando se aplica a la célula, la reacción es positiva en el núcleo y negativa en el citoplasma. En el núcleo, las masas de cromatina condensadas son particularmente positivas; el nucléolo es Feulgen negativo, da como resultados el DNA (cromatina nuclear,

cromosomas)

teñido

color

fucsia

y

fondo

incoloro

(IBID).

Objetivos - Conocer las bases teóricas de la tinción de Feulgen. - Determinar experimentalmente el tiempo óptimo de la hidrólisis de células vegetales para la tinción de Feulgen. - Adquirir destreza en la preparación de láminas para observación microscópica.

Materiales - Raíces de Allium cepa - Hojas de bisturí y gillette. - Fijador - Guantes - Agua destilada - Tapabocas - HCl 5 N - Laminas y laminillas - Reactivo de Schiff - Ácido Acético 50%

Metodología -Se cortaron las raíces de Allium cepa. -Las raíces fueron colocadas en un recipiente que contenía:fijador, metanol y ácido acético (3 : 1) por 20 minutos. -Posteriormente se lavó con agua destilada durante 15 minutos. -En un recipiente que contenía HCl 5N, se realizó el proceso de hidrólisis, en 4 fases, 15- 30- 45 y 60 minutos respectivamente. -Cada muestra se lavó con agua destilada al cumplir su determinado tiempo con el HCl. -Se dejó la muestras en un reciente con reactivo de Schiff por 30 minutos. -Se lavó las muestras con agua destilada en dos ocasiones cada 5 minutos. -Se realizó un squash con una gota de ácido acético 50% y cada muestra fue observada en el microscopio.

Descripción y discusión de resultados Fig.1 Tiempo de hidrólisis: 15 minutos- Célula de la raíz de Allium cepa Se identificó el núcleo y el nucleolo que se encontraba en su interior. Observado en el microscopio óptico, A:400x. Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de desoxirribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada (Kiernan, 199) Fig.2 Tiempo de hidrólisis: 30 minutos- Célula de la raíz de Allium cepa La pared celular se había delimitado, se observa se observa el núcleo y en su interior el nucleolo. Observado en el microscopio óptico, A: 400x. Al momento de observar los cromosomas bajo el microscopio óptico, es importante que las células se encuentren dispersas formando una sola capa de células, evitando así la superposición, para lograr este objetivo se deben destruir tanto la pared celular y la pectina de las uniones intercelulares. Para tal efecto se pueden utilizar agentes químicos o tratamientos enzimáticos, o mezclas de ambos tales como la hidrólisis (Kiernan, 1999) Fig.3 Tiempo de hidrólisis: 45 minutos- Célula de la raíz de Allium cepa El citoplasma se encuentra totalmente teñido El núcleo está fuertemente teñido de un color lila. Se logra distinguir la membrana plasmática del nucleolo. Observada en el microscopio óptico, A: 400x. Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador, tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con borohidruro de sodio antes de ser teñido. El es resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teñido color fucsia y fondo incoloro (Kiernan, 1999).

Fig.4. Tiempo de hidrólisis: 60 minutos- Célula de la raíz de Allium cepa Se observó la existencia de cromosomas durante el estado de telofase. Observado en el microscopio óptico, A:400x. Durante los primeros 60’ en que el tejido a sido expuesto a la hidrólisis ácida se han ido rompiendo los puentes de hidrógeno, que unen la doble hélice, progresivamente liberando bases púricas generando grupos aldehídos (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba la base nitrogenada. A medida que aumenta el tiempo de hidrólisis se produce, por la depurinización, una mayor cantidad de grupos aldehídos expuestos que por reacción con el reactivo de Schiff, generan una coloración que se va haciendo más intensa a medida que el tiempo de exposición al ácido es mayor (Kiernan, 1999).

Análisis

Cuando se emplea el nitrato de plata el tiempo mínimo de hidrólisis es de 15 minutos, observando que la acción hidrolítica del HCl, útil para la reacción de Feulgen, debe realizarse a diferentes tiempos según el tipo de fijación del material biológico. La acción prolongada del agente hidrolítico puede modificar la reacción de Feulgen, debido a la solubilidad del ADN. En el proceso de fijación es utilizado porque,las células de los órganos y tejidos mueren y se descomponen cuando son extraídas de su medio si no se las mantiene en condiciones especiales como las que se dan en los cultivos celulares. El proceso de fijación no evita la muerte celular, pero preserva de la descomposición manteniendo inalterada la estructura morfológica. Entre los muchos líquidos fijadores utilizados, el formaldehído o formol es el más habitual. Otros fijadores son el alcohol y el ácido acético. (Paniagua, 2007) Para el estudio de la cromatina y los cromosomas se emplea con frecuencia los fijadores ácidos (generalmente ácido acético). (Robertis, 2008). La hidrólisis ácida extrae las purinas y deja en libertad los grupos aldehído que reaccionan con la leucofucsina (reactivo de Schiff) para dar el color púrpura. (Robertis, 2008).

Bibliografía De Robertis E. (2008). Biología Celular y Molecular 4ta edición.Argentina.El Ateneo. Pág. 58-63-64-445. Kiernan J.A. (1999). Histología médica teoría y práctica 2da edición. México. Mc GrawHill. Pag. 303, 304, 305. Paniagua R. (2007). Biología Celular 5ta edición. España.Mc GrawHill. Pag.6...