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Zusammenfassung Gentechnik Experimente

Experiment Transformation (Griffith) Griffiths Experiment, das 1928 von Frederick Griffith durchgeführt wurde, war der erste Nachweis der Transformation bei einem Bakterium, also der Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien. Er experimentierte dabei mit dem Bakterium Streptococcus pneumoniae, das bei Mäusen Lungenentzündungen hervorruft. Dieses Bakterium kommt in zwei Varianten vor: als "S-Zellen" (smooth, glatt), die Schleimkapseln bilden können und daher im Lichtmikroskop glatt erscheinen sowie krankheitserregend sind. Die "R-Form" (rough, rau) dagegen hat die Fähigkeit zur Kapselbildung verloren, erscheint rau und ist nicht pathogen, da sie wegen der fehlenden Schutzkapsel vom Immunsystem der Maus erkannt wird. Das Griffith-Experiment besteht nun aus folgenden vier Schritten: 1. Mäuse, denen Pneumokokken der S-Form injiziert werden, erkranken an Lungenentzündung. 2. Mäuse, denen Pneumokokken der R-Form injiziert werden, bleiben gesund. 3. Durch Hitze abgetötete Pneumokokken der S-Form werden injiziert. Die Tiere erkranken nicht. Tote Pneumokokken sind demnach nicht pathogen. 4. Wird Mäusen die abgetötete S-Form zusammen mit der lebenden R-Form injiziert, erkranken sie und sterben. Im Blut der erkrankten Mäuse können lebende Bakterien der S-Form nachgewiesen werden. Damit war bewiesen, dass eine Transformation stattgefunden hatte: die pathogene Fähigkeit der Schleimkapselbildung wird von den toten S-Zellen auf die lebenden R-Zellen übertragen.

Experiment Hershey + Chase: DNA Träger Erbinformation Mit dem als Hershey-Chase-Experiment bekannt gewordenen Versuch konnte nachgewiesen werden, dass genetische Information in DNA und nicht in Proteinen codiert ist. Das Experiment wurde 1952 durchgeführt von Alfred Hershey und Martha Chase.[1] Es lieferte eine unabhängige Bestätigung des Ergebnisses, das bereits 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty in ihren Versuchen zur genetischen Transformation von Bakterien erhalten hatten.

In dem Hershey-Chase-Experiment wurden Viren verwendet, die auf den Befall von Bakterienzellen spezialisiert sind. Solche Viren werden auch Bakteriophagen ('Bakterienesser') oder Phagen genannt. Sie bestehen im Wesentlichen aus einer Proteinhülle und darin DNA (selten RNA). Treffen sie auf ein Bakterium, setzen sie mit ihren Schwanzanhängen auf der Bakterienoberfläche auf und injizieren ihre gesamte DNA in das Bakterium. Die Proteinhülle bleibt dagegen außerhalb des Bakteriums. Die injizierte DNA regt das Bakterium dazu an, neue Phagen zu bauen (Selbstassemblierung), welche unter Zerstörung des Bakteriums schließlich freigesetzt werden. Hershey und Chase züchteten nun Phagen, die als T2-Phagen bezeichnet wurden, einmal unter Zugabe von radioaktiv markiertem Schwefel (35S) und in einer zweiten Petrischale unter Zugabe von radioaktiv markiertem Phosphor (32P). Der radioaktive markierte Schwefel wurde dabei in die Proteine eingebaut. Der radioaktiv markierte Phosphor in der anderen Petrischale wurde dagegen in die DNA der gezüchteten Phagen eingebaut. Daraufhin wurden den Phagen jeweils Bakterien ( Escherichia coli), die keinerlei radioaktiv markierte Stoffe aufwiesen, zugegeben. Kurz nachdem die Phagen sich auf die Bakterien aufgesetzt und ihre DNA injiziert hatten, gaben Hershey und Chase die Proben in einen Mixer. Die Scherkraft im Mixer reichte aus, um die leere Phagenproteinhülle von der Bakterienoberfläche zu lösen, jedoch wurden weder die Hüllen noch die Bakterien zerstört. In einer anschließend durchgeführten Zentrifugation setzten sich die schweren Bakterien im Sediment ab, während die leichteren Phagenhüllen im Überstand verblieben. In den Proben, bei denen die Proteine mit Hilfe des 35S markiert wurden, konnten Hershey und Chase im Überstand Radioaktivität messen. Die Proteine waren also nicht in die Bakterien eingedrungen, da diese sich ja ausschließlich im Sediment befanden, welches keine Radioaktivität aufwies. In den Proben, bei denen die DNA mit Hilfe des 32P markiert war, wurde dagegen Radioaktivität ausschließlich im Sediment festgestellt. Dies war der Nachweis, dass DNA in die Bakterien eindrang. Nur die DNA konnte mittels der von ihr getragenen Erbinformationen das Bakterium zur Produktion von Phagen animieren.

Experiment Watson + Crick: Struktur Doppelhelix

Experiment Arber: Restriktionsenzyme (Scissors)

Experiment Richardson: DNA-Ligase (Glue)

Experiment Boyer + Cohen: zwei Resistenzen auf einem Plasmid

Experiment Semi-Konservative DNA-Replikation (Meselson + Stahl)

Die Biologen Matthew Meselson und Franklin Stahl entwickelten den 1958 publizierten und nach ihnen benannten Meselson-Stahl-Versuch, mit dem sich nachweisen lässt, dass die Replikation der DNA semikonservativ (halb-bewahrend) ist, das Erbgut der Tochterzellen nach der Zellteilung also je zur Hälfte aus der Erbinformation der Mutterzelle besteht und zur Hälfte neu synthetisiert wird. Neben der semikonservativen wurden zuvor auch die Hypothesen von der konservativen und der dispersen Replikation diskutiert:   

Bei der konservativen Replikation bleibt die Mutter-DNA vollständig erhalten und die Kopien ihrer beiden Einzelstränge setzen sich zu einem neuen Doppelstrang zusammen. Bei der semikonservativen Replikation bleibt die Mutter-DNA in jedem Tochter-Molekül zur Hälfte erhalten. Die andere Hälfte wird neu ergänzt. Die disperse Replikation (auch dispersive Replikation) verläuft im Prinzip ähnlich, auch hier bleibt in jeder Tochter-DNA die Hälfte der Mutter-DNA erhalten, die andere Hälfte wird durch neue Nukleotide ersetzt. Allerdings ist der Ersetzungsmechanismus ein völlig anderer – denn die Nukleotide der Mutter-DNA wechseln sich hierbei mit den neu hinzukommenden Nukleotiden ab.

Für ihr Experiment züchteten die Forscher zunächst Bakterien auf einem Nährmedium, welches ausschließlich ein Stickstoffisotop mit der Masse 15 u enthielt. Dieses wurde dann von den Bakterien in ihre DNA integriert. Anschließend wurden Bakterien dieses Stammes auf ein Nährmedium aufgebracht, welches Stickstoff mit einer Masse von 14 u enthielt. Nach 20 Minuten wurden dann Bakterien der ersten Nachfolgegeneration (F1-Generation) entnommen und ihr Erbgut einer Dichtegradientenzentrifugation unterworfen. Es zeigte sich, dass die Sedimentationsebene der Bakterien-DNA genau zwischen den Referenzebenen von DNA, die ausschließlich 14 bzw. 15 u

Stickstoff enthielt, lag. Dadurch konnte die konservative Theorie ausgeschlossen werden, da sich sonst zwei Sedimentationsebenen auf Höhe der Referenzebenen hätten bilden müssen. Um entscheiden zu können, welche der beiden übrigen Theorien richtig sei, wurde der Vorgang mit Individuen der F2-Generation wiederholt. Dabei ergab sich, dass das Erbgut der Bakterien zur Hälfte in der Ebene der F1-Generation und zur Hälfte in der 14 u-Referenzebene sedimentierte. Dies entspricht genau den Vorhersagen der semikonservativen Theorie, schließt eine disperse Replikation aber nicht vollkommen aus[1]. Theoretisch könnten die Fragmente bei einer dispersen Replikation konserviert sein und immer neu und alte DNA-Fragmente sich (durch einen Mechanismus bedingt) abwechseln, wodurch sich die Dichte der DNA genauso verhalten würde wie in dem Experiment. Um die disperse Replikation vollkommen auszuschließen erhitzten Meselson und Stahl die DNA der F1Generation im Medium der Dichtengradientenzentrifuge für 30 min auf 100 °C wodurch die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgespalten wurde (Meselson und Stahl beobachteten, dass sich das Gewicht der Moleküle circa halbierte). In der Dichtegradientenzentrifugation zeigten sich nun zwei Banden die mit den Banden erhitzter reiner N15- bzw. N14-DNA übereinstimmten. Dies ermöglichte den Ausschluss der dispersen Replikation.

Experiment: Baltimore, Dulbecco and Temin: discovering an enzyme that overturned a central dogma of molecular biology – the reverse transcriptase

The Code is degenerated… Experiment Nirenberg + Matthei: ‚Poly-U-experiment‘ (discovered that RNA initiates protein synthesis when combined with contents of broken E. coli cells. By adding poly-U to each of 20 test-tubes (each tube having a different "tagged" amino acid) Nirenberg and Matthaei were able to determine that the codon UUU (the only one in poly-U) coded for the amino acid phenylalanine. )

Beim Poly-U-Experiment des US-amerikanischen Biochemikers Marshall Nirenberg und dessen deutschem Post-Doktoranden Heinrich Matthaei aus dem Jahre 1961[1] konnte erstmals eine genetische Codierungseinheit identifiziert werden – die Aminosäure Phenylalanin konnte dem Basentriplett UUU zugeordnet werden. Die entscheidende Experimentalserie in Nirenbergs Labor am NIH in Bethesda (Maryland), die zur Identifizierung des ersten Codes am 27. Mai 1961 führte, wurde ab dem 15. Mai 1961 von Matthaei konzipiert und durchgeführt,[2] so dass ihm aus Erkenntnissicht der Titel „Vater des genetischen Codes“ zugeschrieben werden könnte. Das Experiment Im so genannten „Triplettbindungstest“ von Nirenberg und Matthaei wurden kurze messenger-RNA (mRNA) Stücke mit bekannten Basensequenzen synthetisiert. Diese mischten die beiden Forscher mit Ribosomen, die aus Bakterien isoliert worden waren. Untersuchungen zeigten zunächst, dass sich Ribosomen und mRNA aneinander anlagerten. Danach erfüllten Nirenberg und Matthaei alle Voraussetzungen, die für Proteinbiosynthese nötig sind und gaben die notwendigen Bestandteile in ein Reagenzglas: Gereinigte Ribosomen, ein Gemisch aller 20 Aminosäuren (von Versuch zu Versuch war eine andere Aminosäure radioaktiv markiert) und schließlich eine synthetische mRNA, mit einer bekannten Basensequenz. Nachdem alle Komponenten zusammengefügt worden waren und einwirken bzw. miteinander reagieren konnten, wurde das Gemisch auf einen Filter gegeben, der Ribosomen, mRNA und neu synthetisiertes Protein zurückhielt, freie Aminosäuren aber durchließ (Filtrat). Dann wurde untersucht, ob sich radioaktives Material im Filtrat befand oder eben zurückgehalten wurde. Bei Zugabe einer mRNA der Basensequenz UUU in dieses zellfreie System zur Genexpression und mit radioaktiv markierter Aminosäure Serin, wurde keine Radioaktivität auf dem Filter gebunden (d. h. keine Synthese von Poly-Serin). Gab man jedoch im nächsten Versuch anstelle von Serin die radioaktiv markierte Aminosäure Phenylalanin hinzu, fand sich das radioaktive Signal auf dem Filter (d. h. Synthese von Poly-Phenylalanin). Auf diese Weise konnte bewiesen werden, dass das Basentriplett UUU die Aminosäure Phenylalanin codiert.

Mit der gleichen Methode konnte dem Basentriplett AAA und dem Triplett CCC die Aminosäuren Lysin und Prolin zugeordnet werden. Das Codon GGG konnte bei dem Experiment jedoch noch nicht entschlüsselt werden, aufgrund dessen Sekundärstruktur, die dazu führte, dass das Basentriplett nicht an die Ribosomen gebunden werden konnte.[3] In einem weiteren Versuch wurde dem System eine mRNA mit der Basensequenz UCU hinzu gegeben. Radioaktives Serin fand sich nun auf dem Filter (d. h. Synthese von Poly-Serin), radioaktives Phenylalanin hingegen im Filtrat (d. h. keine Synthese von Poly-Phenylalanin). Aus diesen Ergebnissen konnte man schließen, dass wenn das Basentriplett mit der Aminosäure zusammenpasst, eine Proteinbiosynthese stattfindet und die mRNA translatiert wird.

Hybridisierung-Experiment

Hybridisierung, Bildung einer Hybrid-Nucleinsäureduplex durch die Assoziation von Einzelsträngen der DNA und der RNA (DNA:RNA-Hybrid) oder von Einzelsträngen der DNA, die in einer natürlichen Duplex nicht aneinandergebunden sind (DNA:DNA-Hybrid). Es sind auch RNA:RNAHybride möglich. Die Hybridisierung dient dazu, spezifische Nucleotidsequenzen zu erkennen und zu isolieren und das Ausmaß der Homologie zwischen Nucleinsäuren zu bestimmen. Hierzu werden die beiden Nucleinsäuren durch Erwärmen über den Tm (Schmelzpunkt) hinaus denaturiert und anschließend eine Hybridisierung bei einer Temperatur, die 25°C unterhalb der Tm liegt, ermöglicht . Einzelstränge müssen ebenfalls durch Erwärmen denaturiert werden, damit Basenpaarungen innerhalb des Strangs aufgebrochen werden. Normalerweise liegt eine Komponente (RNA oder cDNA) der Hybridisierungsmischung in relativ niedriger Konzentration vor und ist radioaktiv (mit bekannter spezifischer Radioaktivität) markiert mit 32P oder 3H, während die andere Komponente (zelluläre DNA oder Fragmente davon) unmarkiert und im Überschuss vorhanden ist. Die H. wird bestimmt, indem die einzelsträngigen von den doppelsträngigen Nucleinsäuren getrennt werden und die spezifische Radioaktivität der doppelsträngigen gemessen wird. Zur Quantifizierung der Hybridisierung wird meistens die Filter- oder Geltechnik eingesetzt. Die DNA wird denaturiert und auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel aufgetrennt oder an einen Cellulosenitratfilter adsorbiert. Das Gel oder der Cellulosenitratfilter werden nun mit einer Lösung der radioaktiv markierten DNA oder RNA, die nachgewiesen werden soll, inkubiert. Das ungebundene radioaktive Material wird durch Verdauung mit Hilfe von Ribonuclease (DNA:RNA-Hybride sind gegen Enzyme resistent) oder einer Desoxyribonuclease, die bevorzugt einsträngige DNA angreift, entfernt. Die Menge an Radioaktivität, die nach dem Waschen auf dem Gel oder dem Filter verbleibt, ist ein Maß für die Komplementarität zwischen den Sequenzen der beiden Proben. Eine Hybridisierung kann auch in Lösung durchgeführt werden. In diesem Fall werden die einzel- und doppelsträngigen Verbindungen durch Chromatographie auf Hydroxyapatit getrennt. DNA:RNA-Hybride. Die Hybridisierung von RNA mit DNA kann zur Untersuchung der Genmultiplizität und zur Genisolierung genutzt werden. Bei der cytologischen Hybridisierung lässt man radioaktive RNA mit chromosomaler DNA eines histologischen Präparats hybridisieren. Dadurch erhält man Hinweise auf den Chromosomenort des Gens (der Gene) der betreffenden RNA. Umgekehrt können klonierte DNA-Gensonden dazu verwendet werden, die histologische Verteilung der mRNA aufzuzeigen, die dem klonierten Gen entspricht. DNA:DNA-Hybride. Wenn hitzedenaturierte DNA ( Schmelzpunkt) langsam abgekühlt wird, können sich wieder Doppelstrangmoleküle ausbilden, d. h. die Einzelstränge reassoziieren. Wenn zwei verschiedene DNAs gemeinsam denaturiert werden, wird das reassoziierte Gemisch Hybridmoleküle enthalten, vorausgesetzt die beiden DNAs besitzen gemeinsame Basensequenzen. Auch mit Hilfe von DNA:DNA-Hybridisierung kann die Kopienzahl von Genen ermittelt werden. Die DNA:DNAHybridisierung in Lösung, mit anschließender Bestimmung der Tm des resultierenden Hybrids, stellt in der biochemischen Taxonomie ein leistungsstarkes Hilfsmittel dar. Die Differenz der T m (ΔTm) zwischen konspezifischen (gleiche Arten) und heterospezifischen (verschiedene Arten) DNAHybriden ist ein Maß für die evolutionäre Nähe der beiden Organismen.

FISH-Experiment FISH: Examples of tumours with increased gene copy number detected by FISH. Gene copy number visualized by fluorescent in situ hybridization (FISH). Blue DAPI stain identifies the DNA present in each cell's nucleus. Red Cy5-labelled probes hybridize to the gene region targeted by each assay (EGFR or HER2). Green Cy3-labelled probes target the centromere of the chromosome appropriate for the gene-specific assay (chromosome 7 for EGFR, chromosome 17 for HER2). The ratio reported is the number of red probes/green probes (genes/chromosome) based on an average of 40 cells. A) Tumour cell without increased EGFR copy number, B) Tumour cell with increased HER2 copy number C) Tumour cell with greatly amplified EGFR.

In-situ-Hybridisierung (ISH, auch Hybridisierung in situ) ist eine molekularbiologische Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren (RNA oder DNA) in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure bindet ( Hybridisierung). Weite Verbreitung haben die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) für den Nachweis von DNA oder RNA (RNA-FISH) in Zellkernen einzelner Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen sowie die Untersuchung der Verteilung von mRNA in ganzen Embryonen, Schnitten oder Geweben mit farbgebenden (chromogenen) Molekülen (FISH-Test). Weitere verwendete Bezeichnungen sind genomische In-situ-Hybridisierung (GISH), bei der als Sonde gesamtgenomische DNA eingesetzt wird, sowie chromosomale In-situ-Suppressionshybridisierung (CISS-Hybridisierung), mit der die Markierung von ganzen Chromosomen möglich ist. Funktionsweise Die In-situ-Hybridisierung beruht auf der Paarung von komplementären Basen auf zwei NukleinsäureEinzelsträngen. Einer der beiden Stränge kommt dabei von einer zuvor hergestellten und markierten Sonde, der andere liegt im Präparat vor und soll nachgewiesen werden. Die ersten Arbeitsschritte sind

demnach Vorbereitung des Präparats sowie Vorbereitung der Sonde. Die Sonde besteht meist aus DNA, da diese stabiler ist als RNA und somit im Labor einfacher zu handhaben ist. Auch lässt sich DNA mit heutigen Verfahren einfacher vermehren. Die Markierung der Sonde kann indirekt mit Haptenen (z. B. Digoxigenin, Biotin oder 2,4-Dinitrophenol) oder bei der FISH auch direkt mit fluoreszierenden Molekülen wie FITC oder Cy3 erfolgen. Häufig eingesetzte Verfahren zur Markierung der Sonden sind Nick-Translation, PCR und In-vitro-Transkription. Da DNA normalerweise als Doppelstrang vorliegt, muss dieser zuvor getrennt (auch: aufgeschmolzen oder denaturiert) werden. Eine Denaturierung kann entweder durch Verschiebung des pH-Werts (sowohl sauer als auch alkalisch) oder durch Hitze erfolgen. Bei einer Hitzedenaturierung wird der Schmelzpunkt meist durch Zugabe von Formamid abgesenkt, welches durch seine starke Polarität die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Einzelsträngen abschwächt. Dadurch kann ein Aufschmelzen bereits bei Temperaturen um 70–75 °C erreicht werden, wodurch die Struktur der Chromosomen weniger stark zerstört wird. Weiterhin kann die DNA auch durch ein Molecular Combing gestreckt und ausgerichtet werden. Die eigentliche Hybridisierung dauert, je nach Sondenmaterial und Zielsequenz, zwischen einer Stunde und mehreren Tagen. Anschließend liegen im Präparat Hybridmoleküle aus den Nukleinsäuren des Präparats und der Sonde vor. Nicht oder unspezifisch gebundene Sondenmoleküle werden herausgewaschen und gebundene Sondenmoleküle können nachgewiesen werden. Bei der indirekten Markierung geschieht dies über eine Antikörperfärbung oder im Fall von Biotin mit Avidin. Die Antikörper (oder das Avidin) sind wiederum an Fluorophore (bei der FISH) oder an Enzyme gebunden, welche aus zuzugebenden chromogenen Substraten Farbstoffe bilden. Beides wird anschließend mikroskopisch ausgewertet. Nachweis von mRNA mit farbgebenden Enzymen Bei dieser Anwendung findet vor allem Digoxigenin-markierte RNA Verwendung. Das Digoxigenin kann mit Hilfe eines Antikörpers, der beispielsweise mit einem Enzym gekoppelt ist, erkannt werden. Das Enzym, meistens Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, kann dann durch Zusatz von Reagenzien einen Farbstoff umsetzen, der kovalent im Gewebe gebunden bleibt und sich daher nicht durch Diffusion verteilt. Beim Nachweis von mRNA in Geweben werden nur jene Zellen angefärbt (hybridisiert), in denen ein zu untersuchendes Gen aktiv ist: Nur hier liegt die entsprechende mRNA vor. Dieses Verfahren findet besonders in der Entwicklungsbiologie Anwendung. Hier ist es von besonderem Interesse, die Aktivität eines Gens beispielsweise während der Embryogenese in situ zu verfolgen. Das embryonale oder auch adulte Gewebe muss für die Färbung zunächst fixiert werden; die Aktivität kann daher nicht in Echtzeit verfolgt werden, sondern ist nur eine Momentaufnahme des Zustands, in dem sich das Gewebe befand, als es fixiert wurde. Ablauf Das zu färbende Gewebe - beispielsweise Embryonen von verschiedenen Modellorganismen wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Mus musculus, Danio rerio - wird mit Hilfe von formaldehydhaltigen Lösungen fixiert. Anschließend wird es in einen formamidhaltigen Puffer überführt und die markierte Sonde dazugegeben. Die Hybri...