5. Ricombinazione Omologa PDF

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RICOMBINAZIONE OMOLOGA Immaginiamo una forcella di replicazione che si sta spostando: c’è un nick non riparato, si interrompe la continuità dello stampo, la DNA polimerasi non può più ricopiare perché c’è lo stampo discontinuo. Dato che c’è l’altro filamento in corso di sintesi, viene sfruttata quell’informazione sul secondo filamento per ripristinare il meccanismo della riparazione, quindi per far ripartire la forcella interrotta. Riparazione omologa di forcelle interrotte 1. Quello che succede e che accomuna tutti i meccanismi basati sulla ricombinazione è la maturazione delle estremità del DNA: per innescare il meccanismo della ricombinazione omologa, si comincia a perdere materiale genetico, ma esso resta comunque identico a come era prima, perché è questo che distingue la ricombinazione omologa dal meccanismo di riparazione non omologo, quindi se c’è perdita di DNA ci sarà poi un meccanismo di riparazione che ripristina al completo questa informazione che è stata persa solo per un attimo, giusto per poter processare, maturare queste estremità. 2. L’estremità 3’ è responsabile dell’invasione del filamento. Questa coda a singolo filamento con estremità 3’ va a invadere la doppia elica integra, cioè quella dalla quale prenderà l’informazione per ripristinare quello che aveva perso, posizione riavviando così il processo di sintesi sulla forcella interrotta. L’altra doppia elica si apre e c’è un’attività che va a recuperare su quella doppia elica l’informazione omologa, grazie al principio della complementarietà. Quindi l’estremità 3’ cerca, grazie a un “motore”, la regione omologa e una volta trovata si ripristina la sintesi del DNA.

Riparazione omologa di Double Strand Break In questo caso c’è un DBS in sede di sintesi (durante la fase S); ancora una volta la regione che si andrà a cercare è la nuova molecola di DNA che si sta generando. Qui la maturazione avviene su due filamenti, si generano quindi due estremità 3’. Solo a delle due invaderà il filamento neo sintetizzato formando una struttura a filamenti sovrapposti chiamata branch point, così da raccogliere le informazioni mancanti, mentre l’altra "si troverà il lavoro fatto”. Alla fine si sintetizzano i filamenti di DNA e si sigillano le interruzioni.

Queste regioni di DNA sovrapposto si chiamano anche giunzioni di Holliday, che sono una sorta di “intermedio” della reazione di ricombinazione omologa, formato da una molecola processata, maturata, che genera l’estremità. C’è l’invasione e si genera questo intermedio a tre filamenti. NB: nel caso in cui la cellula non sia in fase S, adotta come meccanismo di riparazione non omologo rischiando di procurare “cicatrici” al DNA, invece che NB: Nell’immagine accanto viene descritto il meccanismo di riparazione omologa tra due alleli. Un allele è una variazione in sequenza dello stesso gene. Quindi sono due copie dello stesso gene che possono essere identiche (omozigosi) oppure ottenere delle piccole variazioni di sequenza (eterozigosi). Modello di Holliday Holliday ipotizzò che ci fossero dei tagli su ciascuna delle due molecole di DNA. Questi filamenti tagliati si incrociano (invasione) e si chiudono, formando la giunzione di Holliday: si sono incrociate le due molecole di DNA a livello dei due filamenti sovrapposti. La giunzione di Holliday si sposta MODELLO ATTUALE 1. Pathway RecBCD (negli E. coli): A livello delle estremità deve avvenire la maturazione, il processing, e Per risolvere la giunzione c’è bisogno intervengono le attività di determinate proteine, chiamate RecB, RecC e endonucleasi che c’ha due siti attivi e RecD, che formano il complesso RecBCD. Questo complesso si lega al DSB In verticale: I due filamenti hanno for (se fossimo stati in G1 si sarebbero legati al DSB Ku70/80), ma qui siamo sono incrociati i due cromosomi (i ricoin fase S. Queste proteine hanno sia attività elicasica sia endonucleasica, In orizzontale: i ricombinanti parziali, quindi man mano che allargano (denaturano la doppia elica), tagliano heteronduplex in cui differiscono i du entrambi i filamenti e stiamo quindi perdendo informazione genetica. come erano prima. Sulla sequenza dell’E. coli ci sono due sequenze chiamate sequenze chi; a livello di queste sequenze il complesso RecBCD degrada solo uno dei due filamenti, creando l’estremità 3’ (maturazione). A questo filamento singolo con estrenità 3’ si legano le SSBP e le RecA (il suo omologo negli eucarioti è il Rad51): meccanismo di processività, le proteine SSB aiutano la RecA a legarsi al filamento. 2. Invasione del filamento: RecA ( che è un’ATPasi!) si lega al filamento “coprendone” tre nucleotidi, cioè ogni RecA lega tre nucleotidi. Questa proteina idrolizza ATP e

cambia conformazione: cambiando struttura procede a strofinare la doppia elica che ha invaso (motore che scorre) per “scannerizzare” il DNA omologo fin quando non troverà la sequenza omologa.

3. Sintesi riparativa: A questo punto, una volta trovata tale regione omologa, recA si dissocia e comincia la sintesi del DNA (informazione persa) con il filamento invaso che fa da stampo (agisce la DNA polimerasi). Infine la DNA ligasi sintetizza l’ultimo legame fosfodiesterico (a livello della seconda giunzione di Holliday). NB: A sintetizzare il DNA possono essere sia DNA polimerasi 1 che 3 (DNA polimerasi riparative o replicasi). 4. Come si spostano le giunzioni di Holliday: L’elicasi RuvB e la proteina RuvA sono i responsabili di questo meccanismo. Ruv A non riconosce una sequenza specifica di DNA, ma riconosce una struttura di DNA in particolare, cioè le giunzioni. Queste proteine agiscono in maniera coordinata, formando il complesso RuvAB. Questo complesso estendono il tratto heteroduplex. 5. Risoluzione delle giunzioni di Holliday: In questo caso ci sono quattro possibilità, perché possiamo avere su una un taglio verticale o orizzontale combinandolo con un taglio orizzontale o verticale sull’altro; ma vedremo che alla fine gli esiti sono due, sempre gli stessi. Per risolvere le giunzione c’è l’attività di una endonucleasi chiamata RuvC (ha solo due siti attivi, può tagliare solo due filamenti). Orizzontale - orizzontale: succede poco, c’è solo un piccolo tratto heteroduplex: patch;

Verticale - verticale: succede poco, c’è solo un piccolo tratto heteroduplex: patch; Orizzontale - verticale: si ha una ricombinazione più consistente. Il Riconoscimento del danno deve essere RAPIDO ed EFFICIENTE Infatti se ci sono danni al meccanismo di riconoscimento del danno o quello di riparazione del DNA si ha una predisposizione di contrarre determinate malattie, come i tumori. A sentire questo danno per ricombinazione, cioè ad innescare il meccanismo per ricombinazione e funzionare come sensori del danno, abbiamo diverse proteine. Ku 70/80 sono quelle che innescano il meccanismo di riparazione non omologa del DNA. Altri sensori del danno sono le proteine ATM e ATR (due proteine chinasi). Svolgono quasi la stessa attività, con una piccola differenza fra i due: quando ATM è mutata si ha una malattia; quando ATR è mutata non si ha questa malattia (sindrome di alaxia telangectasia), perché la funzione di ATR non è solo quella di riconoscimento di riparo, ma non si hanno anche un’altra serie di eventi per cui l’embrione non va avanti nello sviluppo (topi knock-out). Quando i meccanismi di riparo al DNA non funzionano si ha una mutazione che predispone le cellule sane a generare cellule tumorali. BRCA1 e BRCA2 sono proteine che cooperano con l’attività di Rad51, quindi nel meccanismo di riparazione. Se sono difettive queste proteine evidentemente non avviene correttamente il riparo.

MEIOSI: processo che garantisce la formazioni dei gameti

Per innescare un processo di riparazione omologa serve un DSB che si generano in maniera sporadica, grazie a radiazioni ionizzanti o radicali di ossigeno. Per fare la meiosi pure ci devono stare questi DSB, per questo nelle cellule ci sono delle proteine che servono ad indurre questi tagli, in particolare c’è una proteina Spo11, che è una endonucleasi, che induce un DSB in maniera sfalsata. Poi interviene un altro complesso che si chiama Mer11 (che insieme alla Spo11) matura l’estremità. Poi si legano le SSBP e la MSC1 (?) e si ha la ricombinazione omologa.

Conversione genica: una molecola di DNA un tipo ci è incrociata a una molecola di una altro tipo Polimorfismo: variazioni delle sequenze, presenti in almeno l’1% della popolazione, che non necessariamente provocano una malattia, cioè è poco probabile che siano causa di patologie (sono differenti dalle mutazioni in quanto queste sono assai più rare ed hanno un’alta probabilità di provocare malattie). Tuttavia questi polimorfismi, pur non essendo dannosi, possono provocare delle suscettibilità a determinate malattie e alcune varianti alleliche, alcuni polimorfismi, sono predisposte a generare quel tipo di malattia. E’ molto importante anche per quanto riguarda la somministrazione di farmaci che possono risultare particolarmente dannosi al paziente....