Aantekeningen - Samenvatting Farmaceutische Analyse C PDF

Preview

Summary

Farmaceutische analyse CBischoffBioanalyseBioanalyse is de analyse van zowel geneesmiddelen en hun metabolieten als biomarkers in lage concentraties in complexe biologische samples. Om dit te doen, is het noodzakelijk om gebruik te maken van gevorderde analytische technieken met hoge gevoeligheid en...

Description

Farmaceutische analyse C Bischoff Bioanalyse Bioanalyse is de analyse van zowel geneesmiddelen en hun metabolieten als biomarkers in lage concentraties in complexe biologische samples. Om dit te doen, is het noodzakelijk om gebruik te maken van gevorderde analytische technieken met hoge gevoeligheid en selectiviteit, en om de methodologie gebaseerd op fysisch chemische eigenschappen van een analyte te verbeteren als ook grote kennis hebben over mogelijk interfererende matrix componenten. Er zijn verschillende applicaties voor bioanalyse: - Doping o Vrij weinig gebruikt, maar moet weten welk molecuul aanwezig is - Klinische en forensische toxicologie - Nieuwe pharmaceuticals - Biomarker ontdekking en analyse - Therapeutic drug monitoring - Generieke medicijnen  bio-equivalente studies o Lagere prijs en meer competitie o Moet aangetoond hebben dat het dezelfde werking heeft als het oorspronkelijke molecuul - Omgevings- en occupatie veiligheids- analyse o Bijvoorbeeld antibiotica die in het milieu terecht komen, dat er geen effect is. Kwalitatieve bioanalyse  substantie identificatie Kwantitatieve bioanalyse  gehalte of concentratie van substantie (belangrijk voor therapeutic window) Matrix  biologisch materiaal waarin een substantie bepaald moet worden. Bepaald heel sterk hoe de methode opgezet moet worden Blank matrix  biologisch materiaal zonder het analyte, om methode op te kunnen zetten Kalibrator  blanke matrix die een bekende concentratie van het analyte heeft Kalibratielijn  relateert het gemeten signaal aan de analyte concentratie Interne standaard  substantie die het analyte resembles en corrigeert voor de methode variabiliteit; heeft zelfde eigenschappen als het analiet, waardoor het goed kan corrigeren voor wat er wordt verloren. Voor bioanalyse zijn vier verschillende stappen nodig. Als eerst moet het sample geprepareerd worden, door het bijvoorbeeld in een bepaalde matrix te brengen. Daarna moet het gescheiden worden, dit kan aan de hand van een eiwit. Vervolgens moet het molecuul via een detector gemeten kunnen worden. Als laatste moet de ruwe data verwerkt worden, om op die manier een verbinding te geven. Het doel van een monster preparatie is vaak zorgen dat de juiste concentratie bereikt moet worden. Dit kan door te verdunnen, dan heb je te hoge concentraties, of door te verrijken, dan heb je een te lage concentraties. Het tweede doel is om zoveel mogelijk interfererende moleculen te verwijderen, om zo de methode specifieker te maken. De manier om dit te doen is met behulp van fase transfer, omdat elk molecuul een andere aversie heeft voor de stationaire fase. Tijdens de preparatie moet het

molecuul ook gestabiliseerd worden, wanneer je het namelijk laat staan wanneer het niet gestabiliseerd is dan geeft het een hele andere waarde. Een aantal manieren zijn invriezen, Dried Blood Spot. Als laatst kun je een chemische reactie doen met een analyt om de eigenschappen hiervan te verbeteren. Dia 15  voorbeeld van monster stabilisatie. Hierin is te zien dat in de tijd de spreiding afneemt en de intensiteit van de piek lager worden. Daarnaast is te zien dat het peptide in de tijd stabiliseert. Het is van belang dat je controleert wat de stollingstijd is voor een molecuul. Dia 16  vriesdrogen is een manier om te stabiliseren. Je vriest het monster in en houdt het beneden het vriespunt. Vervolgens wordt het water afgezogen in een vacuum, waardoor het sublimeert. Hierdoor wordt het water van het monster onttrokken zonder dat het ontdooid. Dia 17  voorbeeld van DBS. Hierbij is het van belang dat je schoon werkt. Dia 18  Blood Spot wordt verkregen met een vingerprik Dia 19  door deze methode hoeven mensen niet om de dag naar het ziekenhuis, aangezien het gedroogd naar het laboratorium gestuurd kan worden. Separatie wordt gedaan om moleculen van elkaar af te halen, omdat ze anders hetzelfde of een gelijke respons geven. Daarnaast zorgt separatie voor een verhoging van de diepte van de analyse en verbetering van de sensitiviteit en selectiviteit. Als laatste maakt het een sample verenigbaar met de massa spectrometrie analyse. Detectie moet gevoelig en specifiek zijn. Als deze heel specifiek is, dan zijn er minder voorwaarden nodig aan de preparatie en scheiding. Proximity, de detector geeft alleen een signaal als de twee moleculen heel dicht bij elkaar liggen. Als je licht instraalt op het ene molecuul en het andere molecuul neemt dit ligt op en straalt het uit, dan krijg je een signaal. De data wordt geanalyseerd om een bepaalde stof/compound te identificeren of te kwantificeren. Wanneer er echter sprake is van een biomarker dan spreken we van onderscheiden of diagnose. In het geval van het onderscheiden is vaak een groot verschil te zien tussen de patiënten en de controle personen, zoals in dia 24. Patiënten geven vaak een veel hogere intensiteit van een piek dan de controles. Biologische matrixen zijn vaak bloed en urine, maar bijvoorbeeld ook cerebrospinaal vloeistof, bronchoalveolaire lavage, haar en weefsel kunnen gebruikt worden. De vloeistof wordt alleen gebruikt wanneer het echt nodig is, omdat het gevaarlijk is om het weg te nemen. Dit geldt ook voor het longweefsel. Bij het gebruik maken van plasma is het van belang dat de detectie goed is, omdat er veel eiwitten aanwezig zijn. Daarnaast zorgen de zouten en lipiden ervoor dat het aan de kolom blijft plakken en het onderzoek beïnvloedt. Het is bijna onmogelijk om eiwitbinding te voorspellen! Om deze reden moet je de eiwitbinding dus meten. De meest gebruikte methode hiervoor is ultrafiltratie, hierbij zit het membraan tussen een onder en bovenstuk. De vloeistof moet door het membraan met een bepaalde grootte aan poriën. Als het aan een eiwit zit gebonden blijft het in de bound fraction, dus boven, maar is het vrij dan gaat het door het membraan heen en komt het beneden bij de vrije fractie terecht.

Sample preparatie De vloeistof-vloeistof extractie is een van de methode om fysisch-chemische eigenschappen van een molecuul te kunnen beïnvloeden. Je hebt een organische fase en een waterfase. Je wil moleculen vanuit de water naar de organische fase te krijgen. Fractie van het molecuul dat in de organische fase zit wil je zo groot mogelijk krijgen. Als je geen verlies hebt moet forg + faq = 1 gelden. De extractie opbrengst kan geoptimaliseerd worden door: - Keuze van het organische oplosmiddel o Je wil hydrofoob - pH in de waterfase veranderen o moleculen zijn ioniseerbaar, waardoor de lading beïnvloedt wordt bij een andere pH o pH hoog + base = neutraal; pH laag + zuur = neutraal - uitzouten o waterfase hydrofieler maken door zout toe te voegen o molecuul wil graag naar organische fase - ion-paar extractie o molecuul permanente lading geven dia 4 geeft verschillende oplosmiddelen van hydroboof naar hydrofiel. Er is echter een beperkte keuze aan oplosmiddelen, waarbij niet elk oplosmiddel even vriendelijk is voor zowel milieu als medewerker. De affiniteit van een analyte voor de organische fase is de log P. Is de log P klein (> 0) dan is het molecuul hydrofoob. Links wordt weergeven wat voor invloed de pH heeft op de extractie. Forg wordt beïnvloedt door de pH, vanwege de verdelingscoëfficiënt. Wanneer je een zuur wil extraheren moet je naar een lage pH en moet je dus een hoge concentratie H+. In de formule wordt de Ka/H+ dan naar nul, waardoor de forg 1 nadert. Dit is bij een base ook het geval, aangezien de concentratie H+ dan laag is. Als forg 1 nadert, zijn de meeste deeltjes neutraal wat gunstig is voor in de organische fase. Dia 7 geeft het voorbeeld van lidocaïne, dit is een hydrofoob molecuul. Wanneer je H+ toevoegt, wordt het molecuul meer hydrofiel en kan het dus niet geëxtraheerd worden. Het is dus van belang om een hoge pH te hebben voor een goede extractie.

Kom je boven de pKa dan is de extractie optimaal. 2 eenheden beneden de pKa, ligt de 50% (Ka). Dit is in het geval van een base, bij een zuur moet de pH namelijk onder de pKa liggen voor een optimale extractie. Morfine is een complex molecuul en die heeft zowel zure als basische groepen. Hierdoor heb je twee titratiecurve die over elkaar heen lopen, waar een optimum in het midden ligt. De extractie kan echter nooit op 100% komen. In de afbeelding hiernaast wordt weergeven hoe ion-paar extractie werkt. Door een ionpaar toe te voegen wordt de oplossing meer hydrofiel en zal het molecuul graag naar de organische laag willen gaan.

Voordelen van LLE: - heel makkelijk uit te voeren  weinig stappen - mechanisme is makkelijk te snappen Nadelen van LLE: - gelimiteerde keuze van selectiviteit - grote volumes van organische oplosmiddelen - potentieel verlies gedurende de oplosmiddel evaporatie - emulsie o geen mooie scheiding door schuim, wat moleculen bevat - analyte adsorptie - moeilijk te automatiseren De vaste fase extractie heeft een vaste, stationaire fase en een vloeibare fase. Je gaat een molecuul van de vloeibare fase naar de vaste fase brengen, aangezien deze ook hydrofoob is. Het voordeel ten opzicht van vloeistof-vloeistof is de ruime keuze. Daarnaast is het technisch heel simpel en kan het goed geautomatiseerd worden. De stappen zijn: 1. conditioning, er moet een evenwicht gebracht worden met de stationare fase 2. sample op kolom 3. wegwassen wat je niet wil hebben 4. elueren van analyte Een groot voordeel daarnaast is de high throughput, waardoor in een keer veel analyses gedaan kunnen worden. Bij reversed phase heb je een hydrofoob deel en is het monster hydrofiel. De werking is verder hetzelfde. Heb je een heel hydrofoob molecuul en een hydrofiel matrix, dan werkt dit niet goed. Hierdoor zal er geen wisselwerking zijn tussen de moleculen, waardoor het molecuul niet beschikbaar wordt. Door het juiste matrix te kiezen, wordt de beschikbaarheid hoger.

Bij normaal phase, heb je een hydrofiele kolom en laat je een hydrofoob mengsel door de kolom lopen. Dit werkt het beste bij zouten, omdat zouten hydrofiel zijn en ze graag aan de hydrofiele stationaire fase willen blijven zitten. Bij vast-vloeibaar is er ook sprake van ionen interacties. De stationaire fase heeft een zuur gebonden, als je dan de H+ concentratie verlaagt, wordt het molecuul negatief. Hierdoor kunnen positief geladen moleculen aan de stationaire fase gebonden worden. Naast verandering van pH kan er ook een zout toegevoegd worden om een ion te kunnen binden. Polymeren zijn van zichzelf al hydrofoob, dus ze zijn reversed-phase materiaal. Hydrofobe interacties zijn de belangrijkste bindingen van moleculen. Ze worden gedreven door de verhoging van de entropie, door middel van de verdringing van water. Water vindt het namelijk niet fijn om dicht bij een hydrofoob deel te zitten. Als water verdrongen wordt door een hydrofoob molecuul, wordt de onorde groter en gaat de entropie omhoog. Dit is een sterke kracht, thermodynamisch voordelig, die de interactie laat verlopen. Elektrostatische krachten geeft dat de tegenpolen elkaar aantrekken. Dit gebeurt zelfs op grote afstand, long-ranch interacties. Dit is dus de eerste kracht die interactie aangaat, waarop de hydrofobe interacties plaats kunnen vinden.

Vervolg sample preparatie We zijn geëindigd bij vaste fase extractie. Digoxine is een natuurstof, wat een complex molecuul is door de twee delen. Het eerste deel is hydrofoob en het tweede deel is een carbohydraat, dus heel hydrofiel. Om dit molecuul te kunnen extraheren is het van belang dat de stationaire fase zowel een hydrofoob als een hydrofiel deel bevat. Omdat het molecuul geen ion-groep heeft, kun je niet spelen met de lading, maar wel met de pH van de omgeving. Heeft meerdere extractie methodes nodig om het goed te identificeren. Bij de biomarker 4beta-hydroxycholesterol vindt er eerst een vloeistof-vloeistof extractie met hexaan plaats, waarbij alle storende stoffen verwijderd worden. Aangezien alleen de echt hydrofobe delen worden behouden. Vervolgens wordt er een vaste fase extractie gedaan om de stof volledig te extraheren. Mixed-mode cation-exchange phase als stationaire fase geeft dat je een elektrostatische wisselwerking gebruikt om het molecuul eruit te vissen. Citalopram wordt eerst onder zure condities gebracht, pKa 9.5, waardoor het geladen wordt. Dit zorgt dat het bindt aan de stationaire fase en de storende stoffen worden afgegeven. Door vervolgens in een basische omgeving te brengen, zal het molecuul neutraal worden en zo loslaten van de stationaire fase. geeft on-line solidphase extraction, waarbij het monster wordt gedetecteerd middels een 6puntsschijf en een HPLC pomp.

Dia 34 uitschrijven geeft een samenvatting!

Ligand binding assays Cross reactivity  je vist niet alleen het molecuul wat jij nodig hebt, maar vangt ook moleculen die er heel erg op lijken. Het is dus van belang dat de receptor/antilichaam heel specifiek is voor jouw molecuul. P + X  PX Je hebt een bepaalde hoeveelheid antilichaam en wanneer je X toe gaat voegen, wordt het signaal van het complex sterker. Echter zal deze curve die ontstaat afvlakken, omdat er sprake is van een Bmax. Op een gegeven moment zijn alle antilichamen namelijk bezet en kunnen er niet meer complexen gevormd worden. Deze saturatie bindings curve is echter heel moeilijk om mee te berekenen, hierom moet je via de Scatchard Analyse werken: - We hebben een evenwicht en dit heeft een evenwichtsconstante K D  KD = [PX] / ([P] • [X]) - P0 is de totale hoeveelheid van geïmmobiliseerde antilichaam/receptor  [P] = P0 – [PX] o P is de hoeveelheid antilichaam dat nog kan reageren - Scatchard vergelijking = [PX] / [X] = KD • [P] = KD • (P0 – [PX]) = KD • P0 – KD • [PX] - Wanneer je [PX/X] uitzet tegen [PX] dan krijg je een lineaire vergelijking waarbij de helling gelijk is aan -KD en daarmee is de evenwichtsconstante gevonden - Wanneer [X] >>> [PX], dan zijn alle mogelijke bindingsplekken bezet en dus is B max bereikt  [PX/X] = 0  snijpunt met de X-as is de Bmax Deze vergelijking kan gebruikt worden voor elk mogelijke saturatie curve! Een directe assay  complex wordt gevormd en je krijgt direct een signaal Een competitieve assay  je voegt een beetje gelabeld geneesmiddel toe, waarna een monster toegevoegd word. Hoe meer geneesmiddel er in je monster zit, hoe lager het signaal, aangezien het gelabelde geneesmiddel dan van de receptor/antilichaam wordt verdrongen. Dia 8  wanneer er een radioactief gelabeld molecuul wordt toegevoegd dan is de specifieke binding 100%, echter wordt een van de genoemde stoffen dan gaat het signaal met een sigmoïde curve omlaag. Wanneer er sprake is van een heterogene assay zijn er zowel gebonden als vrije moleculen. Echter is het dan niet mogelijk om te zien of het signaal van het gebonden of het vrije deel komt. Hierom is het van belang dat deze twee delen gescheiden worden. De scheiding moet eenvoudig zijn, bijvoorbeeld een spin kolom. Ook al is de scheiding makkelijk, er is altijd een extra stap. Om deze scheidingstap te voorkomen moet er een homogeen of mix & measure assay gevonden. Het belangrijkste hierbij is dat het gebonden signaal een ander signaal is dan het vrije signaal. Met behulp van een radioactief label kun je ervoor zorgen dat alleen het gebonden deel een signaal geeft, wat dus de hoeveelheid gebonden weergeeft. Het makkelijkste is om dit ook te combineren met een competitieve assay te doen, omdat het gelabelde molecuul dan door het geneesmiddel wordt verdrongen. Daarbij is het wel van belang dat het antilichaam enorm specifiek is! Immunoassays: - Meest gebruikte Ligand Binding Assays - Hebben antilichamen nodig

-

-

o Moeten gemaakt worden o Polyklonaal, monoklonaal Geneesmiddel-eiwit conjugaten moeten geprepareerd worden om render laag-molecuulgewicht farmaceutische immunogenen Antilichamen herkennen alleen een (klein) deel van het antigen  het epitoop o Hebben kleine bindingsplekken o Herkennen een surrogaat Eiwitten elicit een immuunrespons, maar specificiteit is een kritisch attribuut dat heel secuur gecheckt moet worden Geneesmiddelen zijn niet gemaakt om aan eiwitten te koppelen dus ze moeten worden geanhydreerd. Het geneesmiddel wordt niet herkend als geneesmiddel, maar het hele eiwit. Dus het immuunsysteem maakt antilichamen aan tegen het complex en daarmee dus ook deels tegen het geneesmiddel. Polyklonale eiwitten zijn antilichamen tegen verschillende moleculen, die een algemene structuur hebben.

Een monoklonaal antilichaam wordt gevormd via het principe van de hybridoma technologie. De antilichamen worden in B-cellen gemaakt, maar deze hebben een bepaalde omgeving nodig om te kunnen overleven. Als eerst moet het dier worden geïmmuniseerd, om vervolgens de B-cellen te isoleren. Deze cellen moeten fuseren met myeloma cellen, kankercellen, om zo te kunnen overleven in een celcultuur. De hybride cel, hybridoma, maakt elk een ander antilichaam. Om het juiste antilichaam te krijgen moet de cellijnen gescheiden worden en vervolgens moet gekeken worden welke cellijn de juiste is. Deze homogene cel wordt gemultipliceerd, om zo het juiste antilichaam te blijven kweken wordt het ingevroren. Een antilichaam heeft twee antigenbindingsplekken, die uit twee delen bestaat. Hierdoor is het heel makkelijk om verschillende bindingsplekken te vormen. De ketens zijn daarbij ook zwak verbonden door disulfidebruggen. De heavy chain is het constante deel en dit is gerelateerd aan de functie van het antilichaam. De light chain is variabel en bepaald welk antigen kan binden. Dia 17 laat zien dat het constante deel altijd naar buiten steekt, om zo bijvoorbeeld inflammatie aan

te zetten. Naast de functiebepaling zorgt het constante deel ook voor het detecteren van de binding, dit is onafhankelijk van wat gebonden wordt. Recetporassay: - Ligand Binding Assay dat farmacologisch actieve moleculen meet o Je meet alleen het actieve molecuul, omdat het metaboliet een ander vorm heeft - Productie door recombinant DNA technologie o Voorheen uit hersenen van dieren, meestal kalfjes, uit het slachthuis - Vanwege de moeilijkheid om actieve receptoren te zuiveren, wordt meestal de semi-pure vorm gebruikt Dia 19 geeft een voorbeeld van de progesteron receptor. Deze zit in de cel en wanneer iets bindt gaat deze naar de kern en zet een bepaalde transcriptie aan. Er zijn bepaalde herkenningspunten op het genetisch materiaal, bijvoorbeeld PIPA, die aan of uitgeschakeld moeten worden. De meeste receptoren veranderen bij binding van structuur, waardoor het signaal doorgegeven wordt. Het geeft intracellulair een celreactie. Om te kunnen functioneren hebben de receptoren dus een fosfolipide membraan nodig. Het was lang niet mogelijk om deze receptoren uit het membraan te halen, zonder dat het denatureert. Meer dan de helft van de geneesmiddelen reageren op de membraan gebonden receptoren! Dia 21 geeft een overzicht van de recombinant receptor preparaties. Detectie principes: - Radioactiviteit o Gebonden fractie bepalen, wanneer er ook een vrije fractie aanwezig is o Middels competitie o Niet meer veel gebruikt vanwege nadelen - Colorimetrie o ELISA  Assay gelinkt aan een substraat o Chromogenic  met kleur - Enzyme Multiplied Immunoassay Technique o Mix en Measure Assay o Meteen een read-out maken o Vaak gebruikt voor assays die snel moeten, toxicologisch of op straat - ChemoLuminescence - Fluorescence - Fluorescence Polarization - Surface Plasmon Resonance o Geen label nodig o Laag op een goudchip en dan kijken naar de brekingsindex In de biologie/farmacologie zijn 6 verschillende radioisotopen die gebruikt kunnen worden. Hoe korter de halfwaardetijd, hoe sterker de straling. Radioactiviteit kan gemeten worden door vloeistof schittering telling, lichtchromatografie of autoradiografie. De eenheid waarin gemeten wordt is Bq en dit geeft de desintegratie per seconden. Hoe meer becquerel per mol, hoe gevoeliger je kan meten.

De Enzyme Multiplied Immunoassay Technique hangt allemaal samen met een bepaald enzymgeneesmiddel conjugaat. Wanneer je een bepaald geneesmiddel wil meten, maak je een conjugaat met een enzym op een manier dat wanneer het door een antilichaam gebonden wordt de active site geblokkeerd wordt en er dus geen productformatie plaats kan vinden. Wanneer er veel geneesmiddel aanwezig is dan zal het substraat wel kunnen binden en is er veel product formatie. Dia 27 laat het principe van deze techniek zien. Hoe hoger de concentratie ...