Biomedizinische Grundlagen Cythoskelett PDF

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Kurzzusammenfassung zur VO Cythoskelett; biomedizinische Grundlagen; Humanmedizin...

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Verena F.

Cytoskelett o

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Zytoplasma eukaryotischer Zellen wird durch Cytoskelett strukturell organisiert Aufgaben: Multifunktionales intrazelluläres Filamentsystem  Zellstabilität  Polarisation  Positionierung von Zellorganellen  Zellbewegung (Zilien)  Muskelkontraktion  Zellteilung  Organell/Vesikeltransport Selbstorganisation und dynamische Struktur der Zytoskelettfilamente  Zusammensetzungen bestimmen die Eigenschaften der jeweiligen Filamenttypen 3 Haupttypen von Filamenten: Aufbau aus kleinen Untereinheiten (kleine, repetitive Elemente)  helicale Strukturen, nicht kovalent und spontan zusammenlagernd  Actinfilamente: Zellbewegung und Zellform  Mikrotubuli: intrazellulärer Transport (Spindelapparat, Zilien)  Intermediärfilamente (zelltypspezifisch, nicht in allen Zellen): mechanische Stabilität, Positionierung Geben Zelle Festigkeit und lassen sie mit anderen Zellen interagieren Alle 3 sind aus kleinen Untereinheiten aufgebaut und durch eine Helix gekennzeichnet, die nicht kovalent gebunden sind Kleine lösliche Untereinheiten können großräumige Strukturen bilden  großes fadenförmiges Polymer entsteht Wie Ameisenstraße, die gerade Futterquelle gefunden hat Man kann relativ schnell einen raschen Umbau bewirken und neuen Aufbau an anderer Stelle der Zelle  wenn eine Ameise neue Futterquelle findet, sortieren sich die anderen Ameisen auch um Thermische Stabilität von Filamenten des Cytoskeletts: Aufbau aus mehr als einem Protofilament resultiert im dynamischen Umbau an den Enden und erhöht die thermische Stabilität  Aktinfilamente wie Perlenschnur aufgebaut  kann schnell kaputt gehen und ist instabil  Mikrotubuli haben neben längsseitigen Bindungen auch noch Querverbindungen, die die Konstruktion stabiler, aber auch starrer machen  Intermediärfilamente: gestaffelte, lange Untereinheiten mit seitlichen Kontakten  hohe Elastizität, z.B. im Endothel vorzufinden

Actin und Actin-bindende Proteine -

Actin-Untereinheit: 375 Aminosäuren langes Polypeptid mit gebundenem ATP im Monomer (freies globuläres GActin) oder ADP im Filament (F-Actin) auch in Eukaryoten hochkonserviert (90% Identität) Actin-Monomer hat innen im Zentrum das ATP gebunden  oft hydrolysiert, was zu strukturellen Änderungen führt Für eine Windung etwa 37 nm lang, Durchmesser 8 nm Helikale Kopf-Schwanz-Anlagerung Asymetrischer Aufbau bewirkt geradliniges Wachstum  lineare Bündel oder Netze, am stärksten im Kortex angereichert Ein Ende wächst schneller (plus-Ende) als das andere (minus-Ende)

Verena F. - Thermische Stabilität/geradliniges Wachstum wird durchs Hilfsproteine erhöht - Aufbau: o Verlängerung findet durch Anlagerung weiterer Untereinheiten statt o Kinetische Barriere: Mononmere lagern sich langsamer zusammen als Filamentbruchstücke (Polymere) o Sobald ein gewisser Anteil an Polypeptiden vorhanden ist, kann der Aufbau deutlich schneller erfolgen o Leichte Konformationsänderungen durch Einbau (Polymerisation) führt zur Ausbildung des Plus- und Minusendes o Lösliche Untereinheiten sind in der T-Form (Anbau)  begünstigt Anlagerung/Polymerisation  T-Form mit ATP (Actin) oder GTP (Tubulin) o Polymere sind eine Mischung aus T- und D-Form (Abbau)  begünstigt Depolymerisation  D-Form mit ADP oder GDP o Hydrolyse des Nukleotids verändert die Länge und Stabilität der Filamente  so kann man unterschiedliche Verhaltensweisen innerhalb der Filamente beobachten o Gleichzeitiger Auf- und Abbau führt zum Tretmühlen-Verhalten  Wenn Anlagerung und Abbau (im Minusende) gleich sind, dann bleibt das Filament gleich lang, obwohl sich die Untereinheiten verschieben o Man braucht eine definierte Menge von Filamenten vor allem in Zellen, die langlebig sind  vor allem Sinneshaarzellen im Innenohr - Man hat den Aufbau beschreiben können, indem man bestimmte Gifte verwendet hat o Latrunculin  depolymerisiert Filamente, bindet Actin-Untereinheiten (kommt in Schwämmen vor) o Cytochalasin B  depolymerisiert Filamente, in Pilzen o Phalloidin  stabilisiert Filamente, bindet an Filamete (kommt in Amanita-Pilzen vor) - Bindende Proteine an freier Untereinheit regulieren Filamentverlängerung o Nicht-Muskelzellen (Vertebraten), 50% Actin in Filamenten und 50% löslich  50-200µM (2-8mg) o In vitro, kritische Konzentration der Actin-Polymerisation schnelleres Wachstum  Anlagerung Actin an plus-Ende  Konformationsänderung im Actin verringert Affinität zu Profilin  So kann Thymosin verdrängt werden und es kommt zum gezielten Wachstum o Actin-Thymosin-Komplex  Hemmung des Wachstums o Actin-Profilin-Komplex  schnelles Wachstum am Plus-Ende o Thymosin und Profilin konkurrieren um Actin-Bindung  lokale Profilinaktivierung führt zu Filamentverlängerung - Keimbildung der Actinfilamente o Höchste Dichte an Aktinfilamenten am Zellaußenrand (Schicht unter Plasmamembran = Zellrinde/Cortex) o Aktinfilamente im Cortex bestimmen Form und Bewegung der Zelloberfläche  Dornenartige Bündel (Mikrovili, Filopodien)  Flache, vorspringende Schleier (Lamellipodien) o Aktinfilamente keimen am häufigsten an Plasmamembran (im Gegensatz zu Mikrotubuli) o Keimbildung häufig durch äußere Signale  rasche Anpassung an äußere Signale o

Katalyse der Keimbildung durch zwei verschiedene Arten regulierter Faktoren (Proteinkomplexe)  Formine bewirken geradliniges, unverzweigtes Wachstum

Verena F. 

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Große Familie dimerer Proteine  Formin-Dimer kann für die Bildung eines neuen Aktinfilaments keimbildend sein, bleibt bei der Verlängerung des Aktin-Filaments mit dem Plus-Ende assoziiert  Je Untereinheit eine Bindungsstelle für Actin  viele Formine sind indirekt mit der Zellmembran verbunden und unterstützen die EinschubPolymerisation des Aktinfilaments unter Membranoberfläche  ARP-Proteinkomplex schafft verzweigte Strukturen  Actinverwandte Proteine (ARP), 45% identisch zu Actin o Plus-Enden sind ähnlich, Unterschiede liegen an den Seiten und am Minus-Ende vor  Unterschiede hindern verwandte Proteine an der Ausbildung von Filamenten  analog zu Gamma-TuRC keimt der ARP-Komplex vom Minus-Ende  schnellere Verlängerung am PlusEnde  ARP-Komplex bindet seitlich  Nach Aktivierung Konformationsänderung  Aktin-Monomere können sich an die Struktur anlagern  führt zu Keimpunkt und nicht nur geradliniges Wachstum, sondern Anlagerung an bestehende Filamente im 70°-Winkel und Ausbildung netzartiger Strukturen  Schnelle Verlängerung am Plus-Ende  Konservierter Mechanismus  ARP-Komplex verbleibt am Minus-Ende Actin-bindende Proteine verändern Dynamik des Filaments Tropomyosin stabilisiert Filamente und verhindert Filamentinteraktion mit anderen Proteinen  Nicht wachsende, hydrolysierte Filamente werden abgebaut  Wahrscheinlichkeit hoch, dass ATP hydrolysiert wurde, wenn das Filament schon älter ist oder nicht wächst Stabilisierung durch kappenbindende Proteine (plus-Ende) und Tropomodulin (minus-Ende)  Tropomodulin führt dazu, dass der Muskel immer die gleiche Länge hat und man die helle und dunkle Bande sieht Im Gegensatz zu seitlich bindenden Proteinen sind nur wenige End-bindende Proteine nötig, um strukturelle Dynamik zu verändern Cofilin bindet bevorzugt an hydrolysierten Filamenten (ADP-Aktinfilamenten)  bewirkt stärkere Verdrillung der Helix und macht das Filament kaputt  Cofilin wird genutzt, um das Aktinfilament zu deformieren, sodass die Strecke, die von zwei Windungen überbrückt wird, verkürzt ist  schnellerer Abbau des alten Filaments  Neu gebildete Filamente sind vor Abbau geschützt Gelsolin interagiert auf der Oberfläche zwischen zwei benachbarten Untereinheiten  Bruch in Lücke  Gelsolin verbleibt am Plus-Ende  das Cytoskelett wird bei einer Teilung zerstört Quervernetzungseigenschaften von Proteinen bewirken Unterschiede im strukturellen Aufbau von Aktinfilamenten  bündelnde oder gelbildende Proteine Stressfasern bilden kontraktile Bündel, die sich zusammenziehen und Zug ausüben können Aktinzellrinde liegt unterhalb der Plasmamembran und besteht aus gelartigen Netzwerken oder dendritischen Aktinnetzwerken, die das Vorwölben der Membran an den Lamellipodien ermöglichen Filopodien sind dornenartige, dichtgepackte Bündel aus parallelen Filamenten, die die Umgebung ertasten Aktin-vernetzende Proteine  Spectrin (Tetramer)  Sehr groß, interagiert mit anderen Strukturen des Cytoskeletts  Wichtig bei Erythrozyten  müssen wieder in ihre ursprüngliche Form zurückfinden, nachdem sie sich durch Kapillaren gequetscht haben  unter der Plasmamembran lokalisiert  Ausbildung einer Aktinzellrinde (mechanischer Schutz)  Fimbrin (Monomer)  hält einzelne Aktinfasern auseinander  Ausbildung paralleler Bündel in dichter Packung verhindert Eindringen von Myosin II zwischen die Aktin-Bündel

Verena F.  Alpha-Actin  bewirkt Abstand zwischen Aktinfilamenten und lässt zu, dass Myosin sich dazwischenschieben kann  Ausbildung kontraktiler Strukturen  Actin und Fimbrin  keine kontraktilen Strukturen  3D-Quervernetzung durch Filamin-Dimere gelartige Vernetzungen  Metastasierungskapazität von Melanomen kann charakterisiert werden  wenig Filamin-Expression lässt Melanomzelle langsamer metastasieren - Cytoskelett-Elemente bilden Befestigungen an Membranen o Verlinken zelluläre Signale mit cytoskelettaler Antwort o Zellmembran wird durch ERM-Proteine (ezrin, radixin und moesin) mit Actinfilamenten verankert  nach Aktivierung kann es zu gezielten Antworten kommen  Durch Phosphorylierung oder Bindung an PIP2 geregeltes Entfalten der Proteine der ERM-Familie legt zwei Bindungsstellen, eine für Actin und eine für ein Membranprotein, frei  Aktivierung der Proteine der ERMFamilie kann so als Antwort auf extrazelluläre Signale Vorstülpungen der Zelloberfläche bewirken und stabilisieren - Zusammenfassung – Regulation Actinfilamente o für Klausur: Nennen Sie zwei Dimerisierende und zwei polymerisierende Beispiele o Actin ist in hohen Konzentrationen in eukaryontischen Zellen vorhanden o Keimbildung/Polymerisation unterliegt kinetischer Barriere Monomere brauchen länger als Bruchstücke o Aufgrund der Hydrolyse sehr dynamisch  Gleichzeitiger Aufbau am Plus-Ende und Abbau am Minus-Ende = Tretmühlenverhalten  Länge des Filaments bleibt gleich o Dynamik und Struktur durch Vielzahl von Hilfsproteinen reguliert   

50% der Aktinmonomere sind durch Thymosin gebunden, die Keimbildung erfolgt durch Arp2/3 und Formin Zusammenspiel aus bindenden oder Kappenproteinen sowie auflösenden/depolymerisierenden Proteinen verlangsamt oder erhöht Auf- und Abbau Quervernetzung ermöglicht geometrisch definierte Strukturen und erhöht die Stabilität (Vernetzung mit Plasmamembran)

Myosin und Aktin o

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Actinzytoskelett kann mit Hilfe von Myosin-Motorproteinen kontraktile Strukturen schaffen Myosin II besteht aus 4 leichten Ketten und zwei schweren Ketten  die schweren Ketten lagern sich zusammen und bilden eine Doppelwendel aus zwei Alpha-Helices (Zusammenlagerung hydrophober Aminosäuren)  ein langes, bipolares „dickes Filament“ entsteht die leichten Ketten liegen zwischen der Gelenkregion, an der sich die beiden schweren Ketten voneinander lösen und den Myosinköpfchen (am Amino-terminalen Ende) Myosin II-Moleküle lagern sich mit Schwanzabschnitten zusammen (Schwanz-Schwanz-Wechselwirkungen)  mehrere hundert Myosinköpfe weisen am Ende in unterschiedliche Richtung  ermöglicht aneinander vorbeigleiten, ATP-Hydrolyse/Konformationsänderung  Bewegung  Schwanzbereiche bezeichnet man als „nackte Zone) Die Motordomänen aller Myosin-Typen sind ähnlich  Typ I, III und XIV sind Monomere  Myosin VI bewegt sich zum Minus-Ende des Aktins  Insertion in Motot-Kopfdomäne Skelettmuskeln: Durchmesser 50µm riesige, vielkernige Zellen, die durch Fusion vieler Muskelvorläuferzellen (Myoblasten) entstehen geordnete Struktur aus Actin und Myosin  Actin = dünnes Filament  helle Bande, in der Mitte der hellen Bande liegt die Z-Scheibe

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Stabilisierung: das Plus-Ende des Aktin-Filaments ist in der Z-Scheibe verankert, dort liegt auch die CapZ aus Alpha-Actinin  Myosin = dickes Filament  dunkle Bande, in der Mitte der dunklen Bande liegt die M-Linie Sarkomere = sich wiederholende, kleine kontraktile Einheiten, reicht von Z-Scheibe zu Z-Scheibe beteiligte Proteine  Titin reicht von der Z-Scheibe zur M-Linie (1µm) und ist am Myosinfilament angelagert  wechselt die Polarität an der M-Linie, der Rest ist elastisch  Nebulin ist so lang wie ein Actin-Filament und wickelt sich darum  Tropomyosin und Troponin bedecken Aktin  Tropomodulin bildet am Minus-Ende des Aktinfilaments eine Kappe Kontraktion durch aneinander Vorbeigleiten der Myosinköpfe, die sich am Aktin vorbeiziehen Rasche Kontraktion möglich  durch Anstieg der Calciumkonzentration in den Muskelzellen  Membransysteme, die das Aktionspotential mit dem Befehl zur Kontraktion von der Plasmamembran der Muskelzelle über die T-Tubuli und das Sarkoplasmatische Retikulum über den Calcium-Einstrom zu den Myofibrillen im Zellinneren weiterleiten und so eine Kontraktion auslösen  ATP-abhängige Calcium-Pumpen Ruhepegel (innerhalb von 30ms) Aktin und Myosin in Nicht-Muskelzellen Phosphorylierung einer der leichten Ketten des nicht muskulären Myosin II aktiviert das Myosin-Filament  bewirkt Konformationsänderung im Myosinkopf, sodass die Aktinbindende Stelle frei wird und der Myosinschwanz sich vom Kopf lösen und sich entfalten kann  Myosinmoleküle lagern sich zu kurzen bipolaren dicken Filamenten zusammen (auch bei glatter Muskulatur)  z.B. Entstehung von Stressfasern und fokalen Adhäsionspunkten (Verbindung zu anderen Zellen/Extrazellulärmatrix)  Zellen können sich kriechend fortbewegen Myosin ist nicht nur für Kontraktilität zuständig, sondern dient auch über eine zweite Actinbindungs- oder Membrandomäne als Verbindung zur Plasmamembran (Mikrovili, Myosin I) Myosin V  dauerhafte oder prozessbedingte Frachtanlagerung  langanhaltender Transport entlang des Actins  Auch im axonalen Transport wichtig: durch Diffusion würde es mehrere Dekaden dauern, bis Mitochondrium im Zeh ankommt Zusammenfassung wichtiger Punkte:  Durch Gelenkregion die als Hebelarm wirkt, vermitteln Myosine unter ATP-Verbrauch mechanische Arbeit und bewegen sich schrittweise entlang eines Aktin-Filaments  Skelettmuskeln setzen sich aus Myofibrillen zusammen (tausende Sarkomere aus Actin und Myosin IIFilamenten, gestützt von diversen Hilfsproteinen)  Muskelkontraktion durch Calcium stimuliert  Glatte und Nichtmuskelzellen haben keine so streng organisierten kontraktilen Bündel und nutzen Konformationsänderung über Phosphorylierung von Myosin (Myosin-Light-Chain-Kinase)  Myosin V transportiert Fracht entlang Actinfilamenten

Mikrotubuli -

Alpha-Beta-Dimere  Tubulin-Heterodimer, 75%ige Homologie zwischen Hefe und Mensch Polarität: Beta Ende ist + und Alpha-Ende ist Alpha-Tubulin wird nie hydrolysiert (hat permanent GTP gebunden, integraler Teil), Beta-Tubulin kann hydrolysiert werden (kann also GTP oder GDP gebunden haben, Bindung ist weniger fest) - Steife Hohlröhre aus 13 Protofilamenten kann Zelle immense Festigkeit geben  hohe Bindungsenergie zwischen Längs- und Querverbindungen  sehr gerade und fest, kann mehrere Millimeter lang werden o Wie weiß Mikrotubulus, welche Struktur geschaffen werden soll? Durch Hilfsproteine! - Dynamische Instabilität: o Wie auch bei Aktin beeinflusst die Nukleotidhydrolyse maßgeblich die Dynamik des Filaments

Verena F. o wenn sich eine GTP-Kappe am Ende befindet, wächst ein Mikrotubulus schnell  Filamentstruktur ist geschützt o wenn die GTP-Kappe verloren geht und vermehrt GDP vorliegt („Katastrophe“), wird der Mikrotubulus schnell abgebaut o ein Wiederaufbau der Kappe („Rettung“) kann zu einem erneuten schnellen Wachstum führen o wenn GTP zu GDP hydrolysiert wird, kommt es zu einer leichten Konformationsänderung der Untereinheiten und die Bindungen im Polymer werden geschwächt  das Protofilament biegt sich und ist weniger stabil o Kein kontinuierlich geradliniges Wachstum, sondern plötzlicher Wechsel zwischen Rettung und Katastrophe o Nachverfolgung durch Gifte  Taxol: Medikament in Krebstherapie, aus Eibe, bindet seitlich an Filamente und stabilisiert diese, führt zu Polymerisation  Höhergeordnete Struktur bricht zusammen  Wird bei austherapierten Patienten mit Lungen- oder Brustkrebs eingesetzt  dabei werden aber auch z.B. Darmepithelzellen und Haarfollikel in Mitleidenschaft gezogen  Nacodazol (synthetisch hergestellt) depolymerisiert Filamente und bindet Tubulin-Untereinheiten - Keimbildung: o die Keimbildung der Mikrotubuli verläuft über das Gamma-Tubulin, welches spezifische Funktionen hat o die Keimbildung findet immer an definierter intrazellulärer Stelle (Mikrotubuli organisierendes Zentrum = MTOC) statt in bisher allen untersuchten Zellen detektiert o die Keimbildung findet am Minus-Ende statt, von dort wachsen die Plus-Enden sternförmig aus dem MTOC hinaus und bilden die verschiedenen Anordnungen der Mikrotubuli aus o Bildung des MTOC (=Centrosom)  je zwei Gamma-Tubuline bilden mit verschiedenen Hilfsproteinen den Gamma-TuRC-Komplex  7 Gamma-TuRC-Komplexe lagern sich durch Überlappung zu einem Ringkomplex zusammen, bei dem die 13 zugänglichen Gamma-Tubulin-Einheiten den 13 Protofilamenten eines Mikrotubulus entsprechen  dieser Ringkomplex aus Gamma-Tubulin hält einen Mikrotubulus am Minus-Ende zusammen  das MTOC liegt nah am Kern und die Mikrotubuli entspringen in Sternform  in tierischen Zellen liegen im Centrosom mindestens 50 Kopien des Gamma-TuRC-Ringkomplexes  das Minus-Ende eines Mikrotubulus zeigt also in Richtung Centrosomenmatrix und das Plus-Ende in Richtung Zellmembran  Ausstrahlende Mikrotubuli definieren die Mitte der Zelle  in der Centrosomen-Matrix liegen Centriolen  im 90°-Winkel zueinander stehende Struktur  Gliederung der Centrosomenmatrix  bestehen aus modifizierten Mikrotubuli und Hilfsproteinen  Centrosom verdoppelt sich während Zellteilung (Wanderung der Centrosomen zu zwei Polen)  Mikrotubuli-Cytoskelett bildet Koordinatensystem (wichtige Platzierung von Zellorganellen)  in abgetrennten Zellbruchstücken orientieren sich die Mikrotubuli neu um ein Zentrum ohne Centriolen herum - Seitlich bindende Proteine können Filamente stabilisieren oder destabilisieren o Seitlich an Mikrotubuli bindende Proteine = Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) o Überexpression in Zellen  unterschiedlicher Aufbau der MT-Bündel  MAP2 bindet entlang des Mikrotubulus und streckt einen Arm mit mikrotubulibindender Domäne aus  wenn eine Zelle MAP2 überexprimiert, sind die MikrotubuliBündel einer Zelle gleichmäßig angeordnet  Tau-Aggregate (helicale Filamente) z.B. bei Alzheimer  Tau besitzt eine kürzere Domäne und bindet an zwei Stellen an den Mikrotubulus, sodass eine Schlaufe entsteht  die Mikrotubuli-Bündel einer Zelle sind bei TauÜberexprimierung ungleichmäßig verteilt und liegen enger zusammen

Verena F. o MAP und Katastrophenfaktor regulieren Länge und Dynamik der Mikrotubuli, z.B. beim Auf- und Abbau der mitotischen Spindel  Katastrophenfaktoren (Kinesin-13 aus der Kinesin-Motorprotein-Superfamilie) binden an Enden der Mikrotubuli und brechen diese auf  kürzere, dynamischere Mikrotubuli entstehen  MAPs stabilisieren die Enden des wachsenden Mikrotubulus  längere, weniger dynamische Mikrotubuli entstehen o +TIPs verbleiben am wachsenden Plus-Ende der Mikrotubuli und können sie mit anderen Strukturen wie z.B. Membranen verbinden o Stathmin bindet zwei Tubulin-Heterodimere und verhindert deren Anlagerung an Mikrotubuli-Filamente o o

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Katanin (abgeleitet aus dem Japanischen  „Schwert“) durchtrennt Mikrotubuli-Filamente und begünstigt schnellen Abbau Mikrotubuli-Motorproteine: Kinesine und Dyneine Kinesin: wandert (mit Ausnahme von Kinesin 14) immer zum Plus-Ende der Mikrotubuli, Transportgeschwindigkeit bis zu 2-3 µm/s  Kinesin 1: Aufbau ähnlich wie Myosin (konservierte Motordomäne am N-Terminus der schweren Kette), CTerminus bindet Lasten (Organ...