Title | Ciclo do Ácido CÍtrico |
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Author | Marina Souza |
Course | Bioquímica Veterinária |
Institution | Universidade Estadual do Ceará |
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Resumo do ciclo do acido citrico...
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CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO 1. INTRODUÇÃO O ciclo do ácido cítrico (também chamado ciclo de Krebs ou ciclo
dos ácidos tricarboxílicos) desempenha diversos papéis no metabolismo. É a via final para onde converge o metabolismo oxidativo de carboidratos, aminoácidos e ácidos graxos, em que seus esqueletos carbonados são convertidos a CO 2. Essa oxidação fornece energia para a produção da maior parte do ATP na maioria das células animais, incluindo humanos. O ciclo ocorre totalmente na mitocôndria e, portanto, está bastante próximo das reações de transporte de elétrons, que oxidam as coenzimas reduzidas geradas pelo ciclo. O ciclo do ácido cítrico é uma via aeróbia, pois o O2 é necessário como aceptor final dos elétrons. A maior parte das vias catabólicas do organismo converge para o ciclo do ácido cítrico.
Figura 1 Origem do acetil CoA e sua oxidação
Algumas reações, tais como o catabolismo de determinados aminoácidos, produzem intermediários do ciclo e são denominadas reações anapleróticas. O ciclo do ácido cítrico também participa em diversas reações sintéticas importantes. Por exemplo, o ciclo funciona na formação de glicose a partir de esqueletos
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carbonados de alguns aminoácidos e fornece blocos construtivos para a síntese de alguns aminoácidos e do heme. Portanto, esse ciclo não deve ser visto como um ciclo fechado, mas sim como um ciclo de tráfego, com compostos que entram e saem de acordo com as necessidades do organismo. O grupo acetila na forma de acetil coenzima A – acetil CoA – é um intermediário comum no metabolismo de quase todos os compostos biológicos, podendo ser formado a partir de carboidratos, lipídeos e aminoácidos. Qualquer que seja a fonte, grande parte dela é oxidada a CO 2 e H2O, mas qualquer excesso pode ser utilizado para a biossíntese de ácidos graxos, colesterol e corpos cetônicos, como se pode ver na figura 1. A figura 2 mostra uma visão geral do ciclo. Ele começa com uma condensação de acetil CoA com oxaloacetato para formar citrato e termina com a regeneração do oxaloacetato. Este atua como transportador para os dois átomos de carbono da acetil CoA no processo cíclico, sendo regenerado em seu final. A oxidação completa da acetil CoA via ciclo de Krebs, produz duas moléculas de CO2. Quatro pares de elétrons são retirados dos substratos e transferidos, via cadeia respiratória, para o oxigênio molecular. Três pares são removidos pelo NAD + formando três NADH e o par restante é removido por uma flavoproteína formando FADH2. A oxidação dos NADH e do FADH 2, pela cadeia respiratória, produz onze moléculas de ATP por fosforilações oxidativas. Uma molécula de GTP é formada a partir de GDP, H3PO4 (Pi) e energia, fornecida pela hidrólise de um intermediário do ciclo rico em energia. Este processo denomina-se fosforilação em nível de substrato para distingui-la da fosforilação oxidativa realizada na cadeia respiratória.
2. REAÇÕES DO CICLO No ciclo de Krebs o oxaloacetato é primeiramente condensado ao acetato, e a seguir regenerado, na medida em que o ciclo é completado. Entretanto, essas reações
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não devem ser encaradas somente como um círculo fechado, e sim como um circulo de trânsito, com compostos entrando e saindo conforme requerido.
Figura 2. Ciclo do ácido cítrico
2.1. Descarboxilação oxidativa do piruvato O complexo piruvato desidrogenase é um complexo multienzimático localizado na matriz mitocondrial. Ele converte o piruvato, o produto final da glicólise aeróbica, em acetil CoA, um importante combustível para o ciclo de Krebs (figura 3). A irreversibilidade da reação impede a formação de piruvato a partir de acetil CoA, e explica por que a glicose não pode ser formada a partir de acetil CoA na
gliconeogênese.
Estritamente
falando,
o
complexo
piruvato
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desidrogenase não é parte do ciclo de Krebs, mas é uma fonte importante de acetil CoA – o substrato de dois carbonos para o ciclo.
Figura 3 Descarboxilação oxidativa do piruvato
2.1.1. Enzimas componentes O
complexo
piruvato
desidrogenase
é
um
agregado
multimolecular de três enzimas: piruvato descarboxilase, diidrolipoil transacetilase e diidrolipoil desidrogenase. Cada uma delas catalisa uma parte da reação geral (figura 4). Sua associação física liga as reações na sequência apropriada, sem a liberação de intermediários.
2.1.2. Coenzimas O complexo piruvato desidrogenase contém cinco coenzimas que agem como transportadoras ou oxidantes para os intermediários da reação mostrada na figura 4.
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2.1.3. Inibição pelo produto O complexo enzimático é inibido pela acetil CoA, que se acumula quando é produzida mais rápido do que pode ser oxidada pelo ciclo de Krebs. A enzima também é inibida por níveis elevados de NADH, o qual ocorre quando a cadeia transportadora de elétrons está sobrecarregada de substrato e o oxigênio é limitado.
Figura 4 Mecanismo de ação do complexo piruvato desidrogenase. TPP=pirofosfato de tiamina; L=ácido lipóico.
2.1.4. Modificação covalente O complexo piruvato desidrogenase existe nas duas formas: uma
ativa, não fosforilada, e uma inativa, fosforilada (figura 5). As duas formas são interconvertidas por duas enzimas separadas, uma quinase e uma fosfatase. A quinase
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é ativada por um aumento na relação acetil CoA/CoA ou NADH/NAD +. Um aumento na relação ADP/ATP, o qual sinaliza um aumento da demanda para a produção de energia, inibe e quinase e permite à fosfatase produzir mais enzima ativa, não fosforilada.
Figura 5 Regulação do complexo piruvato desidrogenase
2.2. Síntese do citrato a partir de acetil CoA e oxaloacetato A condensação de acetil CoA e oxaloacetato para formar citrato é catalisada pela citrato sintase. Essa condensação aldólica apresenta o equilíbrio bastante deslocado na direção da síntese do citrato. A reação utiliza um intermediário do ciclo de Krebs (oxaloacetato) e produz outro intermediário deste ciclo (citrato). Assim, a entrada de acetil CoA neste ciclo não leva à produção ou consumo líquidos de intermediários de intermediários do ciclo.
2.2.1. Inibidores:
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A citrato sintase é inibida por ATP, NADH, succinil CoA e acil CoA, derivados dos ácidos graxos (figura 8). A velocidade da reação também é determinada pela disponibilidade de substratos.
Figura 6 Formação do α-cetoglutarato a partir de acetil CoA e oxaloacetato
2.2.2. Outras funções do citrato
Figura 7 Formação do malato a partir do α-cetoglutarato
O citrato, além de ser um intermediário no ciclo de Krebs, fornece uma fonte de acetil para a síntese citossólica de ácidos graxos. O citrato também inibe a PFK-1, a
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enzima determinante da velocidade na glicólise e ativa a acetil CoA carboxilase, a enzima limitante da velocidade da síntese dos ácidos graxos.
2.3. Isomerização do citrato O citrato é isomerizado a isocitrato pela aconitase (figura 6)
2.4. Oxidação e descarboxilação do isocitrato A isocitrato desidrogenase catalisa a descarboxilação oxidativa irreversível do isocitrato, originando a primeira de três moléculas de NADH produzidas pelo ciclo, e a primeira liberação de CO 2 (figura 2). Esta é uma das etapas limitantes da velocidade do ciclo de Krebs. A enzima é ativada por ADP – níveis elevados de
ADP mitocondrial sinalizam uma necessidade de geração de um fosfato de energia mais alta (ATP) . A enzima é inibida por ATP e NADH, cujos níveis estão elevados quando a célula possui depósitos abundantes de energia (figura 8).
Figura 8
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A. Produção de coenzimas reduzidas e CO2 no ciclo de Krebs. B. Inibidores e ativadores do ciclo
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A conversão de α-cetoglutarato em succinil CoA é catalisada pelo complexo αcetoglutarato desidrogenase (figura 7). O mecanismo desta descarboxilação é similar àquele usado para a conversão de piruvato em acetil CoA. A reação libera o segundo CO2 e produz o segundo NADH do ciclo. O equilíbrio da reação está deslocado na direção do succinil CoA, um tioéster de alta energia semelhante ao acetil CoA.
2.5.1. Coenzimas As coenzimas requeridas são o pirofosfato de tiamina, ácido lipóico, FAD, NAD + e CoA. Cada uma funciona no mecanismo catalítico de forma análoga à descrita para o complexo piruvato desidrogenase.
2.5.2. Inibidores A enzima é inibida por ATP, GTP, NADH, succinil CoA, mas não é regulada pelas reações de fosforilação/desforilação, como descrito para o complexo piruvato desidrogenase.
2.6. Clivagem de succinil CoA A succinato tioquinase cliva a ligação tioéster de alta energia do succinil CoA (figura 7). Esta reação e acoplada a fosforilação de GDP a GTP. O conteúdo de energia do GTP é o mesmo que do ATP, e os dois nucleosídeos são interconversíveis pela reação da nucleosídeo difosfato quinase: GTP + ADP
⇌ GDP + ATP
2.6.1. Fosforilação em nível de substrato A geração de GTP a partir de succinil CoA é um exemplo de fosforilação em nível de substrato, no qual a produção de um fosfato de alta energia é acoplada à conversão de substrato em produto, em vez de resultar da fosforilação oxidativa.
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2.6.2. Fonte e destinos do succinil CoA O succinil CoA também é formado a partir de ácidos graxos com número ímpar de átomos de carbono, e do propionil CoA derivado do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. O succinil CoA é usado na biossíntese do heme.
2.7. Oxidação do succinato O succinato é oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, produzindo a coenzima reduzida FADH 2. O FAD, e não o NAD+, é o aceptor de elétrons, pois o poder redutor do succinato não é suficiente para reduzir o NAD +. O malonato, um ácido carboxílico, inibe reversivelmente a succinato desidrogenase.
2.8. Hidratação do fumarato O fumarato é hidratado até malato em uma reação livremente reversível, catalisada pela fumarase.
2.9. Oxidação do malato O malato é oxidado a oxaloacetato pela malato desidrogenase. Esta reação produz o terceiro e último NADH do ciclo (figura 9).
Figura 9 Formação de oxaloacetato a partir do malato
3. ESTEQUIOMETRIA DO CICLO DE KREBS
A equação geral balanceada para a oxidação completa da acetil CoA é:
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Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O ⟶ 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 3 H+ + CoA
Quadro 1. Reações do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória ⇌ Citrato + CoA-SH Acetil CoA + oxaloacetato + H2O ⇌ Isocitrato Citrato + ⇌ α-cetoglutarato + NADH + H+ Isocitrato + NAD + ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP NADH + H + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2 ⟶ Succinil CoA + NADH + H+ + CO2 α -cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH + ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP NADH + H + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2 ⇌ Succinato + GTP + CoA-SH + H2O Succinil CoA + GDP + Pi + H2O ⇌ GDP + ATP GTP + ADP ⇌ Fumarato + FADH 2 Succinato + FAD ⟶ FAD + 3 H2O + 2 ATP FADH2 + 2 ADP + 2 Pi + 1/2O2 ⇌ L-malato Fumarato + H2O + ⇌ Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + ½ O2 ⟶ 2 CO2 + 13 H2O +CoA-SH + 12 ATP Acetil CoA + 12 ADP + 12 Pi + 2 O2 Fonte: FIGUEIREDO (1999)
Como esta reação é realizada em etapas pelas reações do ciclo do ácido cítrico, é útil examinar-se a estequiometria em detalhes. Há quatro reações de oxidação. Em cada uma delas, um par de elétrons e um par de prótons são removidos dos substratos e transferidos para três moléculas de NAD+ e uma molécula de FAD. Como vemos no quadro 1, a oxidação destas quatro coenzimas, por meio da cadeia respiratória, resulta na redução de quatro átomos de oxigênio, formando-se quatro moléculas de H 2O. Onze outras moléculas de água são formadas nas reações de fosforilação de onze moléculas de ADP (quadro 1).
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Figura 10 Principais origens da acetil CoA na célula e seu mais importante destino metabólico via ciclo de Krebs e cadeia respiratória
Examinando-se as reações do ciclo, pode-se notar que duas moléculas de água foram consumidas nas reações de formação do citrato e do L-malato. Duas moléculas de CO2 são produzidas nas reações do ciclo, exatamente nas etapas de formação do α-cetoglutarato e da succinil CoA. Estas duas moléculas de CO 2 são equivalentes aos dois átomos de carbono do acetil CoA (figura 1 e quadro 1). A reação de descarboxilação do α-cetoglutarato, análoga à reação de descarboxilação do piruvato, é irreversível; as demais reações do ciclo de Krebs são reversíveis. Por isso, embora apresentando reações reversíveis, o ciclo de Krebs não pode funcionar na direção reversa. Onze moléculas de ATP são biossintetizadas a partir de ADP, Pi e energia fornecida pela oxidação de três moléculas de NADH e uma molécula de FADH 2, através da cadeia respiratória. A molécula restante de ATP é biossintetizada a partir de GTP e
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ADP; o GTP formou-se, por fosforilação em nível de substrato quando da hidrólise de succinil CoA. O quadro 1 mostra as reações do ciclo de Krebs e o armazenamento de
energia, na forma de ATP. A oxidação completa do ácido acético no calorímetro libera 209.000 cal. Quando uma molécula de ácido acético, ativada sob a forma de acetil CoA, é oxidada até CO2 e H2O no ciclo de Krebs, 144.000 cal são armazenadas em doze moléculas de ATP, correspondente a um rendimento de 66 %. A figura 10 mostra as principais origens do acetil CoA, o ciclo de Krebs e a cadeia respiratória integrados.
4. REGULAÇÃO DO CICLO DE KREBS 4.1. Regulação por ativação e inibição da atividade enzimática Em contraste à glicólise a qual é regulada primariamente pela fosfofrutocinase, o ciclo de Krebs é controlado pela regulação de várias atividades enzimáticas (figura 8). As mais importantes destas enzimas reguladoras são a citrato sintase,
isocitrato
desidrogenase
e
complexo
α-cetoglutarato
desidrogenase. 4.2. Regulação pela disponibilidade de ADP 4.2.1. Efeitos do ADP elevado O consumo de energia devido à contração muscular, reações biossintéticas ou outros processos resulta na hidrólise de ATP em ADP e Pi. O resultante aumento na concentração de ADP acelera a velocidade das reações que utilizam ADP para gerar ATP, a mais importante das quais é a fosforilação oxidativa. A produção de ATP aumenta até que atinja a velocidade de consumo de ATP pelas reações que requerem energia.
4.2.2. Efeito do ADP de baixo
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Se o ADP está presente em concentrações limite, a formação de ATP por fosforilação oxidativa diminui devido à falta de aceptor de fosfato (ADP). A velocidade da fosforilação oxidativa é proporcional à [ADP][Pi]/[ATP]. Isto é conhecido como controle respiratório da produção de energia. A oxidação de NADH e FADH 2 pela cadeia respiratória também cessa se o ADP é limitante. Isto ocorre porque os processos de oxidação e fosforilação são intimamente acoplados e devem ocorrer simultaneamente. À medida que o NADH e FADH 2 se acumulam, suas formas oxidadas tornam-se depletadas, provocando a inibição da oxidação de acetil CoA no ciclo de Krebs, devido à falta de coenzimas oxidadas.
5. LEITURA “Como nasceu a idéia do ciclo do ácido cítrico” Esta é uma questão muito natural pois a existência de um ciclo tão complexo para a oxidação dos grupos acetil de dois carbonos até
CO2 , através do ácido
cítrico de 6 carbonos, pode parecer desnecessariamente complicada e em desacordo com o princípio da economia máxima da lógica bioquímica das células vivas. O ciclo do ácido cítrico foi, pela primeira vez, postulado como a via de oxidação do piruvato nos tecidos animais em 1937 por Sir Hans Krebs. A ideia do ciclo ocorreu-lhe durante um estudo sobre o efeito apresentado pelos ânions de vários ácidos orgânicos sobre a velocidade de consumo do oxigênio por suspensões de músculos peitorais de pombo durante a oxidação do piruvato.
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O músculo peitoral do pombo é usado durante o vôo e tem uma velocidade de respiração muito alta, sendo, assim, especialmente apropriado para o estudo da atividade oxidativa. Investigações anteriores realizadas por Albert Szent-Györgyi, na Hungria, haviam demonstrado que certos ácidos orgânicos dicarboxílicos com 4 átomos de carbono na molécula e sabidamente presentes em tecidos animais, os ácidos
succínico, fumárico, málico e oxaloacético estimulavam o consumo de oxigênio pelo músculo. Krebs confirmou estas observações e descobriu que os mesmos ácidos também estimulavam a oxidação do piruvato. Além disso, ele verificou que a oxidação do piruvato pelo músculo também era estimulada pelos ácidos de 6 átomos de carbono e tricarboxílicos – cítrico, cis-aconítico e isocítrico, como também pelo ácido α-cetoglutárico que tem 5 átomos de carbono na molécula. As estruturas desses ácidos estão mostradas na figura 2. Nenhum outro ácido orgânico de ocorrência natural, quando testado, mostrou possuir tal atividade. A ação estimuladora dos ácidos ativos era notável uma vez que mesmo a adição de diminutas quantidades de qualquer um deles podia promover a oxidação de quantidades várias vezes maiores de piruvato. A segunda observação importante feita por Krebs foi a de que o malonato (figura 12), um inibidor competitivo da desidrogenase succínica inibia a utilização aeróbica do piruvato pelas suspensões, não importando a adição de qualquer um dos ácidos orgânicos possuidores de atividade estimuladora. Isto indicava que o succinato e a desidrogenase succínica deviam ser componentes essenciais das reações enzimáticas envolvidas na oxidação do piruvato. Mais ainda, Krebs encontrou que quando o malonato é usado para inibir a utilização aeróbica do piruvato por suspensões de tecido muscular ocorre um acúmulo de citrato, de α-cetoglutarato e de succinato no meio de suspensão, sugerindo que o citrato e o α-cetoglutarato são convertidos normalmente em succinato quando o malonato não está presente.
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Figura 11 Malonato é análogo do succinato e potente inibidor competitivo da enzima succinato desidrogenase
Destas observações básicas e de outas evidências, Krebs concluiu que os ácidos di e tricarboxílicos citados acima podiam ser arranjados em uma sequência química lógica, onde cada passo é uma transformação química simples catalisada por uma enzima específica (figura 11). Além disso, como a incubação de piruvato e oxaloacetato com tecido muscular macerado resultava no acúmulo de citrato no meio, Krebs também concluiu que esta sequência funciona de forma circular antes que linear, de tal forma que o seu início e o seu fim estão unidos. Para o elo que fechava o ciclo, e que estava faltando, ele propôs a reação: Piruvato +oxaloacetato → citrato + CO 2
A partir destes experimentos simples e do raciocínio lógico, Krebs postulou o que ele chamou de ciclo do ácido cítrico como a via principal de oxidação dos carboidratos do músculo. Nos anos seguintes a sua descoberta o o ciclo do ácido cítrico tem sido encontrado não apenas no músculo mas em virtualmente todos os tecidos dos animais e plantas superiores e em muitos microrganismos aeróbicos. Por esta importante descoberta, Krebs recebeu o Prêmio Nobel de 1953, juntamente com Fritz Lipmann, o “pai” do ciclo do ATP.
6. BIBLIOGRAFIA CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioquímica Ilustrada. Porto Alegre: Artes Médicas, 1996, 446p.
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FIGUEIREDO, A. F. S. Oxidações biológicas. In: VIEIRA, E. C., GAZZINELLI, G., MARESGUIA, M. Bioquímica celular e biologia molecular . São Paulo: Atheneu, 1999. p. 151178. LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., COX, M. M. Princípios de bioquímica. São Paulo: SARVIER. 1995, 839p....