Corrections TD Sequencage Peptidique (2016 ) PDF

Preview

Summary

TD POLYTECH Séquencage peptidique...

Description

TD-SEQUENÇAGE PEPTIDIQUE CORRECTIONS 1- CORRECTION : On sait que l’DNP permet tout comme le chlorure de DANSYL d’identifier l’extrémité NTerminale. La carboxypeptidase A libère l’aa C terminal et le DNFB l’aa N terminale, on aura donc : Asp(N terminal)- ?- ?- ?- ?- ?- ?- ?-Val (C-terminal) On sait que la trypsine clive les liaisons peptidiques en C-Terminal des aa basiques tels que la lysine et l’arginine (ATTENTION, ne fonctionne pas avec l’histidine) Ainsi : PEPTIDE A + Trypsine donne : 1ier peptide neutre à pH 6,4 : (Lys, Asp, Glu, Ala, Tyr) Asp(Nterminal),Ala, Tyr, Glu-Lys(C-terminal) on positionne Lys en C-terminal car c le seul aa basique. 2ième peptide : (His, Glu, Met, Val) On place la methionine à proximité de la Valine car on sait que BrCN clive du côté CTerminal d’une Met. De plus, l’obtention de DNP-His permet de positionner His : Soit la séquence du 2ieme peptides: His-Glu-Met-Val(C-terminal) A ce stade le peptide A : Asp(N terminal)- ?- ?- ?- Lys- His- Glu- Met-Val (C-terminal) La digestion du peptide A par la chymotrypsine coupe en C-terminal des aa aromatiques comme la Tyrosine. Ainsi : Peptide A+ Chymotrypsine donne 2 peptides : 1ier peptide : Asp, Ala, Tyr soit le seul enchainement possible : Asp(Nterminal)-Ala-Tyr (Cterminal) A ce stade, on obtient le peptide A : Asp(N terminal)- Ala- Tyr- ?- Lys- His- Glu- Met-Val (C terminal)

2ieme peptide (obtenu via la chymotrypsine) : Lys-His-2Glu-Met,Val On en déduit facilement que la sequence du peptide 2 est : ?-Lys-His-Glu-Met-Val (Cterm) Soit : Peptide 2 : Glu-Lys-His-Glu-Met-Val (Cterminal) D’où la séquence du peptide A : 1

Asp(N terminal)- Ala- Tyr- Glu- Lys- His- Glu- Met-Val (C terminal) 2- CORRECTION : On sait que la Dansylation sur le polypeptide donne le Dansyl-Val, on determine ainsi : Val (N terminal)---------------------------------------------On sait que BrCN coupe après une méthionine et la trypsine coupe apres un aa Basique : On peut donc positionner 2 fragments en N et C terminal car on connaît l’aa N term qui est Val et on peut donc positionner l’aa non HSL comme C terminal. L'homosérine lactone (HSL) est le produit de la réaction du bromure de cyanogène (CNBr) avec un résidu méthionine au sein d'une protéine. C'est une réaction importante dans le séquençage des protéines, qui permet de cliver sélectivement les protéines au niveau des méthionines. On aura donc à ce stade de l’étude : Val (N terminal)-Ala-Arg-------------------------------------------Gly-Cys-Phe (Cterminal) On sait que la chymotrypsine coupe après un aa Aromatique. On peut donc par chevauchement rallonger les 2 peptides précédemment positionnés : Val (Nterm)-Ala-Arg-Glu-Phe----------------------------------------Met-Gly-Cys-Phe (Cterm) Par chevauchement avec l’hydrolysat tryptique on aura: Puisqu’on obtient le fragment Glu-Phe-Val-Pro-HSL : On aura donc : Val (Nterm)-Ala-Arg-Glu-Phe-Val-Pro-Met-----------------------Met-Gly-Cys-Phe (Cterm) Puisqu’on obtient le fragment Tyr-Cys-Glu-Trp-HSL : On aura donc : Val (Nterm)-Ala-Arg-Glu-Phe-----------------Tyr-Cys-Glu-Trp-Met-Gly-Cys-Phe (Cterm) Ainsi notre polypeptide aura la séquence : Val(Nterm)-Ala-Arg-Glu-Phe-Val-Pro-Met -Tyr-Cys-Glu-Trp-Met-Gly-Cys-Phe(Cterm) 3- CORRECTION: Puisque L’analyse de l’extrémité N terminale donne Leu et l’action de la carboxypeptidase libère Val. On en déduit : Leu(Nterm)- ?- ?- ?- ?- ?- ?- ?- ?-Val(Cterm) On sait que la chymotrypsine coupe les aa après un aa aromatique On peut donc déduire une carte partielle des 3 peptides : 2

Leu- ?- ?- ?- ?-Phe Ala-Val Lys-tyr Sachant que Val est le C terminal et que le Val numéro 2 est dans le peptide 1 on peut donc placer le peptide 2 en position centrale soit : Leu(Nterm)- ?- ?- ?- ?- Phe- Lys- Tyr- Ala-Val(Cterm) On sait que le traitement à la peptidase du peptide 1 libere Phe puis Gly donc: Leu- ?- ?- ?- ?-Phe = Leu- ?- ?- ?-Gly-Phe Soit à ce stade de l’étude une séquence de peptide= Leu(Nterm)- ?- ?- ?- Gly- Phe- Lys- Tyr- Ala-Val(Cterm) On sait que la trypsine coupe après un aa basique : Ainsi, on peut facilement placer le peptide 1’ avec Arg en position C-ter, D’où à ce stade de l’étude une séquence de peptide= Leu(Nterm)- Val- Arg- ?- Gly- Phe- Lys- Tyr- Ala-Val(Cterm) il reste alors une seule place possible pour la cystéine soit un peptide de séquence : Leu(Nterm)- Val- Arg- Cys- Gly- Phe- Lys- Tyr- Ala-Val(Cterm) 4- CORRECTION : Le nombre de chaîne de HbA est donc : (0,73/117)/(100/64000)= 4 5- CORRECTION : On obtient un DNP-histidine et l’action de la carboxypeptidase A se traduit par la libération d’une Thr. Ainsi à ce stade de l’étude on aura la séquence : His(Nterminal)------------Thr(Cterminal) Des séquences obtenues après digestion avec Trypsine on obtient : 1=Arg 2=Tyr-Leu-Asx-Ser-Arg (qui ne migre pas à pH 6) 3=His-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-Ser-Lys (qui migre vers la cathode à pH 6) 4=Ala-Glx-Asx-Phe-Val-Glx-Trp-Leu-Met-Asx-Thr (qui migre vers l’anode à pH 6) Ainsi on peut donner l’ordre des séquences (1 à 4) dans le polypeptide : His(Nterminal)-3-(1,2)-4-Thr(Cterminal)

3

Ainsi à ce stade de l’étude on aura la séquence : His(Nterminal)-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-Ser-Lys-(1,2)-Ala-Glx-Asx-Phe-Val-Glx-Trp-LeuMet-Asx-Thr(Cterminal)

Des séquences obtenues après digestion avec la chymotrypsine on obtient : 1’=Val-Glx-Trp (qui ne migre pas à pH 6) 2’=Leu-Met-Asx-Thr (qui ne migre pas à pH 6) 3’=Ser-Lys-Tyr 4’=Leu-Asx-Ser-Arg-Arg-Ala-Glx-Asx-Phe (qui ne migre pas à pH 6) 5’=Thr-Ser-Asx-Tyr (qui migre vers l’anode à pH 6) 6’=His-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe (chargé positivement à pH 6) Ainsi on peut donner l’ordre des séquences (1’ à 6’) dans le polypeptide : His(Nterminal)-6’-(1’,3’,4’,5’)-2’-Thr(Cterminal) Ainsi à ce stade de l’étude, par regroupement avec la digestion à la Trypsine on pourra insérer les fragments 3’ et 4’ dans la séquence du polypeptide : His(Nterminal)-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-(Ser-Lys-Tr)---(Leu-Asx-Ser-Arg-Arg)-AlaGlx-Asx-Phe-Val-Glx-Trp-Leu-Met-Asx-Thr(Cterminal)

Ainsi, on peut insérer le fragment 2(2=Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg) obtenu avec la Trypsine. His(Nterminal)-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-Ser-Lys-(Tyr-Leu-Asx-Ser-Arg)-Arg-Ala-GlxAsx-Phe-Val-Glx-Trp-Leu-Met-Asx-Thr(Cterminal)

Ainsi, nous obtenons la séquence du polypetide : His(Nterminal)-His-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asx-Ser-ArgArg-Ala-Glx-Asx-Phe-Val-Glx-Trp-Leu-Met-Asx-Thr(Cterminal) Au regard des charges des fragments trypsiques et chymotrypsiques, on peut repositionner les amides éliminés par hydrolyse acide du polypeptide : Pour la trypsine : 2=Tyr-Leu-Asx-Ser-Arg (qui ne migre pas à pH 6) Donc ce fragment a une charge globale « nulle » soit : Tyr(+)-Leu-Asx(-)-Ser-Arg (+,-)=Tyr(+)-Leu-Asp-Ser-Arg (+,-) 3=His-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx-Tyr-Ser-Lys (qui migre vers la cathode à pH 6) Donc ce fragment a une charge nette OU GLOBALE (+) Soit : His(+,+)-Ser-Glx(?)-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asx(?)-Tyr-Ser-Lys (-,+) His (+,+) et Lys (-,+) donnent une charge: (+,+) donc pour avoir une charge « globale ou nette » (+) on doit avoir Glx et Asx tels que : Glu() et Asp (neutre) ou Glu(neutre) et Asp (-) 4=Ala-Glx-Asx-Phe-Val-Glx-Trp-Leu-Met-Asx-Thr (qui migre vers l’anode à pH 6) Donc ce fragment a une charge GLOBALE (-) Soit : Ala(+)-Glx( ?)-Asx( ?)-Phe-Val-Glx( ?)-Trp-Leu-Met-Asx( ?)-Thr(-) 4

Ala(+) et Thr(-) donnent une charge nulle. Donc : on doit avoir Glx1(- ou neutre), Asx1(- ou neutre), Glx2(- ou neutre) et Asx2(- ou neutre) tels que la charge globale ou nette soit (-) Pour la Chymotrypsine on a : 1’=Val-Glx-Trp (qui ne migre pas à pH 6) Ne migre pas donc la charge nette ou globale est nulle soit : Val(+)-Gln-Trp(-) 2’=Leu-Met-Asx-Thr (qui ne migre pas à pH 6) Ne migre pas donc la charge nette ou globale est nulle soit : Leu(+)-Met-Asp-Thr(-) 3’=Ser-Lys-Tyr Aucunes infos !!! 4’=Leu-Asx-Ser-Arg-Arg-Ala-Glx-Asp-Phe (qui ne migre pas à pH 6) Ne migre pas donc la charge nette ou globale est nulle soit : Leu(+)-Asp-Ser-Arg(+)-Arg(+)-Ala-Glx(?)-Asx(?)-Phe(-) (en utilisant le trypsique 2) 5’=Thr-Ser-Asx-Tyr (qui migre vers l’anode à pH 6) migre vers l’anode donc la charge globale est (-) donc : Thr(+)-Ser-Asp-Tyr(-) 6’=His-Ser-Glx-Gly-Thr-Phe (chargé positivement à pH 6) chargé positivement à pH 6 donc : His(+,+)-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe(-) Ainsi on aura: His(Nterminal)-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-SerArg-Arg-Ala-Glu*-Asp*-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Cterminal) Avec un des 2 aa avec * portant une fonction amide.

5...