De ziekte van Lyme - Volledig PDF

Preview

Summary

Mijn verslag van de presentatie voor de lessen biochemie en analytische biochemie tijdens het 2e jaar, eerste semester van de opleiding Biochemie via CVO Pantha Rei. Mijn presentatie ging over de ziekte van Lyme waarbij ik een inleiding gaf op de ontdekking, het voorkomen en de gevolgen van het etio...

Description

CVO Panta Rhei de Avondschool – Schoonmeersstraat 26 – 9000 Gent – 09/335 22 22 – www.avondschool.be HBO - Graduaat Chemie - optie Biochemie Academiejaar 2016-2017

De ziekte van Lyme: bespreking van membraanproteïnen en ELISA Door: Glenn Verhaeghe

CVO Panta Rhei de Avondschool – Schoonmeersstraat 26 – 9000 Gent – 09/335 22 22 – www.avondschool.be HBO - Graduaat Chemie - optie Biochemie Academiejaar 2016-2017

De ziekte van Lyme: bespreking van membraanproteïnen en ELISA Door: Glenn Verhaeghe

1

Samenv Samenvatting atting De ziekte van Lyme wordt veroorzaakt door spirocheten van het Borrelia-geslacht, voornamelijk B. burgdorferi, en wordt op de mens overgedragen door bloedzuigende insecten, met in het bijzonder de Ixodid-teek. De symptomen worden voornamelijk veroorzaakt door de reactie van ons immuunsysteem op deze bacteriën. De pleomorfe bacteriën zijn echter zeer aanpasbaar en dus moeilijk te bestrijden waardoor symptomen zich uiteindelijk opstapelen. Om deze aanpasbaarheid mogelijk te maken, gebruiken ze, naast het veranderen van hun uiterlijke vorm en metabolische activiteit, een arsenaal aan membraanproteïnen die instaan voor infectie van en overleving in de verschillende gastheren. Bij het stellen van een diagnose omtrent de ziekte van Lyme, schrijven de meeste protocollen voor om te beginnen met een ELISA-test en een Western Blot. Deze testen zijn niet éénduidig, iemand kan bijvoorbeeld al Borrelia-specifieke antilichamen in het bloed hebben zonder dat die persoon werkelijk aan de ziekte van Lyme lijdt. Er zijn namelijk meer Borreliasoorten bekend die niet virulent, niet ziekmakend, zijn dan wel. De virulente soorten die hier besproken worden, nl. B. burgdorferi, B. garinii en B. afzelii, worden hier onder de noemer van B. burgdorferi sensu lato (afgekort Bb) geplaatst.

2

Doelstellingen Een overzicht geven van de ziekte van Lyme waarbij het etiologisch agens wordt besproken en de manier waarop deze wordt overgedragen + de symptomen die erdoor worden veroorzaakt. Bespreking van de functie van enkele antigene, lipide-geankerde membraanproteïnen die voorkomen op het etiologisch agens. Bespreking van het principe en de werkwijzen van ELISA.

3

Voorwoord Toen ik een onderwerp moest vinden voor deze opdracht was mijn eerste idee 'de ziekte van Lyme', een ziekte waar ik nauwelijks bekend mee was behalve dan via een vriend van mij die zelf aan de ziekte lijdt. Later kwam daar een andere mogelijkheid bij vanuit een meer persoonlijke hoek, nl. fenylethylamine. Bij het onderzoeken tussen deze 2 mogelijkheden was ik eerder gefocust op fenylethylamine vanuit persoonlijke interesse. Echter, bij het zoeken naar artikelen hierover leek het er op dat de info veel beperkter was dan bij de ziekte van Lyme. Aangezien allebei de onderwerpen zo goed als onbekend waren voor mij, leek de ziekte van Lyme de veilige optie te zijn. Daarnaast moest ik eerlijk toegeven aan mezelf dat een bespreking over de ziekte van Lyme veel relevanter is voor mijn huidige situatie. Er was mij al benadrukt hoe weinig ik wist over de ziekte (een gezegde dat blijkt op te gaan bij lyme-patiënten is: you don't know Lyme until you've got it) en dat werd mij ook duidelijk bij het onderzoeken van de ziekte. Lyme-patiënten zijn als een speelbal van de maatschappij. Wie niet in de eerste maanden wordt genezen mag vaak een lange, slopende tocht verwachten waarbij van de ene onwetende dokter naar de andere wordt afgereisd tot het initïatief wordt genomen om zelf onderzoek te doen naar, al dan niet alternatieve, genezing. Chronische Lyme, het late stadium van de ziekte, wordt vaak ontkent door de medische wereld en verzekeringsmaatschappijen maken daar gretig gebruik van. De kosten voor behandelingen, waarvan de patiënten vaak niet weten of deze wel enig effect op hen gaat hebben, komen vaak aan de patiënt zelf toe. Er zijn verhalen bekend van kwakzalvers die een verzinsel of onbevestigde aanname (zoals het idee dat de bacterie die Lyme veroorzaakt een bepaald type neurotoxine zou afscheiden) onderbouwen met wetenschappelijk correcte documentatie om zo producten te kunnen verkopen waar zijzelf winst uit zouden maken die natuurlijk geen enkele geneeskrachtige, maar soms wel dodelijke, gevolgen hebben. Ik ben in zekere zin zelf slachtoffer geweest van die valse of onbetrouwbare informatie tijdens de opmaak van dit document. Het lijkt mij dus belangrijk dat alle mensen goed geïnformeerd worden over deze ziekte want het kan ieder mens overkomen. Jammer genoeg vraagt dit meestal om een hoop tekst door te nemen, informatie op het internet kan ook nog eens tegenstrijdig of incompleet zijn. Wetenschappers zijn bang voor het zaaien van paniek bij het informeren via media zoals televisie of radio waardoor iedereen uiteindelijk aan het lot wordt overgelaten. Waarschijnlijk zijn deze media niet de meest geschikte vorm om informatie over de ziekte te verspreiden maar er zou op zijn minst toch iets ondernomen mogen worden om het jaarlijks aantal geïnfecteerden te laten dalen, zoals dialogen met experts op dit vlak. Enkele voorstellen van mijn kant zijn het in kaart brengen van bekende endemische gebieden en het aanbieden van de correcte insecticiden (DEET heeft bijvoorbeeld maar een zeer beperkt effect op teken en kan bij veelvuldig gebruik schadelijk zijn voor de gezondheid. Permethrin daarentegen is zeer effectief tegen teken en hoeft gewoon op kledij te worden aangebracht). 4

Inhoudsopga Inhoudsopgave ve Samenvatting

2

Doelstellingen

3

Voorwoord

4

Lijst van Illustraties

6

Inleiding

7

1. Algemeen 1.2 Classificatie en structuur 1.3 Infectie van B. burgdorferi sensu lato bij de mens. 1.3.1 Geografisch voorkomen van de Ixodid-varianten. 1.3.2 Levenscyclus van B. burgdorferi sensu lato en de Ixodid-teek. 1.3.3 Overdracht van B. burgdorferi sensu lato naar en door de mens. 1.4 Symptomen van besmetting door B. burgdorferi sensu lato. 1.5 Co-infecties

8 8 9 9 9 10 11 12

2. Membraanproteïnen bij Borrelia burgdorferi s.l. 2.1 Inleiding 2.2 Het vasthechten van proteïnen aan een membraan. 2.3 Membraanproteïnen van B. burgdorferi sensu lato 2.3.1 Inleiding 2.3.2 Lipide membraan-anker bij de 'outer-surface proteins' (Osp) van Bb 2.3.3 Bespreking van de 'outer-surface proteins' op basis van hun functie.

13 13 13 14 14 15 16

2.3.3.1 Overleven binnen teken. 2.3.3.2 Tijdens Bb-overdracht van teek naar een zoogdierlijke gastheer. 2.3.3.3 Adhesie aan cellen van de gastheer 2.3.3.4 Ontwijken van de immunorespons van de gastheer

3. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 3.1 Inleiding 3.2 Antigen en antilichaam 3.3 Principe 3.4 Werkwijzen 3.5 De verschillende aspecten in de methodologie 3.5.1 De vaste fase 3.5.2 Het label proces 3.5.2.1 Koppelen van een enzym aan een proteïne 3.5.2.2 Enzymen

3.5.3 Substraat 3.5.4 Spectrofotometrie

16 17 17 17

18 18 18 19 19 21 21 22 22 22

23 23

Bibliografie

24

Afkortingen

25

5

Lijst vvan an Illustr Illustraties aties Figuren: Fig. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Beschrijving Detailvoorstelling van een spirocheet Vergelijkende foto van 2 teek-soorten Witvoetmuis Teken in verschillende levensstadia Vergelijking tussen een gevoede en ongevoede teek Erythema Migrans Drie verschillende transmembrale proteïnen Lipide-anker bij Osp (S-glycerine-cysteïne) Antigen en antilichamen Homogeneous Enzyme Immunoassay Competitieve ELISA ELISA: Sandwich-methode ELISA: indirecte methode Structuurformule: Lysine Structuurformule: Arginine Structuurformule: Glutaaraldehyde Reacties tussen reducerende suikers en verschillende concentraties perjodaat

Pg. 9 9 10 10 11 12 14 15 18 19 19 20 20 21 21 21 22

Tabellen: 1

Bruikbare enzymen in de verschillende immunoassays

6

22

Inleiding Het document is onderverdeeld in 3 delen: 1. Algemeen Hierin wordt informatie besproken dat een licht werpt op de ziekte en op het etiologisch agens. Deze informatie kan bijdragen aan het begrijpen van de functies van de membraanproteïnen die in een later deel worden besproken (zoals info over de levenscyclus van de Ixodid-teek) en het belang van een correcte diagnose (zoals info over de ontwikkeling van symptomen in verschillende stadia en over co-infecties). 2. Membraanproteïnen Dit is het theoretische gedeelte van de presentatie dat handelt over een specifiek biochemisch onderwerp. Er wordt maar een selecte groep membraanproteïnen besproken, nl. de 'outer-surface proteins' (Osp). Van een aantal van deze proteïnen is hun antigene werking bekend en die zou veroorzaakt kunnen worden door het lipide-anker waarmee ze aan het membraan vasthangen. Om deze reden wordt in dit deel ook een overzicht gegeven van de 3 manieren waarop membraanproteïnen zich kunnen vasthechten aan een membraan en wordt het lipide-anker bij de Osp ook apart besproken. 3. Enzyme-linked Imunosorbent Assay (ELISA) In dit deel wordt de praktische toepassing van een diagnostische test, die bekend staat als ELISA, besproken. ELISA behoort samen met de Western Blot (wordt niet besproken) tot de testen die meestal als eerste worden uitgevoerd bij het opstellen van een diagnose omtrent de ziekte van Lyme.

7

1. Al gemeen 1 . 1 O v e r d e o n t d e k k i n g va n h e t e t i o l o g i s c h a g e n s . In 1977 werd de ziekte van Lyme, ook wel Lyme-borreliose genoemd en vernoemd naar de stad Lyme in de Amerikaanse staat Connecticut, klinisch beschreven als een infectieziekte door Dr. Alan Steere en collega's. [CITATION Til08 \l 2067 ] Een infectieziekte is een ziekte met een meetbare reactie van een gastheer op het binnendringen van een agens waarbij een agens zowel biologisch, chemisch (voeding) of fysisch kan zijn. [ CITATION Mer13 \l 2067 ] Steere et al.1 suggereerden dat de epidemiologie (de wijze van voorkomen en verspreiding van de ziekte) er op wees dat de overdracht gebeurde door middel van een geleedpotigde vector2. Dit door de wijze waarop de patiënten vaak geografisch gegroepeerd zijn op of nabij het platteland en door de seizoensgewijze opkomst van de symptomen. [CITATION Til08 \l 2067 ] In 1984 publiceerde Willy Burgdorfer een artikel waarin hij zijn ontdekking van het etiologisch agens (de veroorzakende bacterie) van de ziekte van Lyme omschreef. In weefsel uit de middendarm (midgut) van teken, die verzameld waren uit de endemische3 regio, troffen W. Burgdorfer et al. spirocheten aan. [ CITATION Bur84 \l 2067 ] Deze spirocheten veroorzaakten een huidaandoening die vergelijkbaar was met erythema migrans (zie 1.4) wanneer ze bij konijnen werden geïnjecteerd en sera, afkomstig van patiënten met de ziekte, reageerden met de bacterie. Als erkenning voor zijn ontdekking werd de bacterie Borrelia burgdorferi gedoopt. [ CITATION Til08 \l 2067 ] In Amerika is er maar 1 soort bacterie die de ziekte van Lyme veroorzaakt onder de populatie, nl. Borrelia burgdorferi sensu stricto. In Europa en Azië daarentegen zijn er meerdere soorten verantwoorderlijk waarvan de 3 meest voorkomende B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii en B. afzelii zijn. Hiernaar wordt collectief verwezen onder de benaming B. burgdorferi sensu lato (Bb)4. [CITATION Til08 \l 2067 ]

1.2 Classificatie en sstructuur tructuur Het Borrelia-geslacht behoort tot de familie der spirocheten. Leden van deze groep bevatten een herkenbare morfologie (uiterlijk voorkomen en anatomie) waaronder een spiraal-/golfvormig lichaam [ CITATION Til08 \l 2067 ] met tussen het binnen- en buitenmembraan een periplasmatische ruimte die bestaat uit een peptidoglycaanlaag (een 3 dimensionale, gigantische molecule die de celwand verstevigd en vorm geeft) Et al. is Latijns voor 'en anderen', in dit geval verwijzend naar collega's van Steere. Een vector is een organisme dat ziekteverwekkers of parasieten kan overbrengen naar een gastheer (mens, dier of plant) (Mertens, 2013) 3 Met endemisch wordt bedoeld dat de ziekte tot een bepaald gebied beperkt blijft zonder dat de patiënten de ziekte buiten dit gebied hebben kunnen op lopen. (Mertens, 2013) 4 Sensu lato (s.l.) betekent 'in brede zin', hier verwijst het naar de verschillende Borrelia-soorten die de ziekte van Lyme kunnen veroorzaken waarbij B. burgdorferi de voornaamste oorzaak vormt. Sensu stricto (s.s.) betekent 'in strikte zin', beperkt tot het specifiek genoemde onderwerp.

1 2

8

en flagella (organen die zorgen voor de motiliteit5 van de bacterie) [ CITATION Mer14 \l 2067 ] (Fig. 1).

[ CITATION 2067 ]

Mid1 \l

Fig. 1 - Links: foto van een spirocheet, Rechts: detailtekening waarop te zien is hoe het axiaal filament

(het endoflagellum) rond het bacterie-lichaam is gewikkeld en bedekt is met het buitenste membraan. [ CITATION Mid1 \l 2067 ]

Bekende leden uit deze groep, naast de Borrelia-bacteriën, zijn Treponema pallidum (het agens bij syfilis) en Leptospira interrogans (Leptospirose/Rattenziekte). [ CITATION Til08 \l 2067 ]

1.3 Inf Infectie ectie vvan an B. burgd burgdorferi orferi sensu lato bij de mens. Een mens kan op verschillende manieren geïnfecteerd worden met Bb waarbij de voornaamste manier door middel van bloedzuigende vectoren (teken, muggen, dazen, vlooien,...) is met in het bijzonder teken van het geslacht Ixodid.

1.3.1 Geogr Geografisch afisch voork voorkomen omen vvan an de IxodidIxodid-v varianten. In de Verenigde staten worden de Bb-bacteriën voornamelijk overgebracht door Ixodes scapularis (deertick/herten-teek). Deze is kleiner dan een andere endemische teek in de VS, Dermacentor variabilis (dogtick/honden-teek), die over het algemeen niet als vector voor de mens bekend is. Fig. 2 - Links: I. scapularis, Rechts: Dercamentor variabilis (dog-tick)

Andere vectoren zijn o.a. Ixodes ricinus ('sheep tick'), Ixodes persulcatus en Ixodes pacificus die, respectievelijk, voorkomen in Europa, Azië en de Amerikaanse kust nabij de Grote Oceaan. [ CITATION Mur10 \l 2067 ]

1.3.2 Lev Levenscyclus enscyclus vvan an B. burgdorf burgdorferi eri sensu lato en de Ix Ixodid-teek. odid-teek. In de epidemiologie wordt onderscheidt gemaakt tussen een reservoir, een vector en een gastheer bij de dragers van ziektekiemen en pathogenen. 5

Motiliteit is de mate waarin een bacterie energie kan omzetten in arbeid.

9

Het reservoir of de besmettingsbron is de bron van waaruit ziektekiemen en pathogenen zich kunnen verspreiden en kan zelf niet door het agens besmet worden. De vector is een organisme dat een bacterie of parasiet kan overbrengen op de gastheer. De gastheer is een organisme die een ander organisme in zich draagt. Dit zijn relatieve begrippen. In de levenscyclus van Bb is het reservoir vaak een variëteit aan kleine dieren (bv. de witvoetmuis ( Peromyscus leucopus), Fig. 3). De infectie van deze natuurlijke gastheren leiden niet tot een ziekte in tegenstelling tot infectie bij de mens. Dit komt door de immunopathologische respons (de reactie van het immuunsysteem op het pathogeen) tegen de Borrelia-bacterie bij de mens. Bb infecteert een groot aantal diverse gastheren waaronder kleine zoogdieren, hagedissen en vogels. [ CITATION Til08 \l 2067 ] Fig. 3 - witvoetmuis (Peromyscus leucopus), merk het grote aantal teken op aan het oor.

De voornaamste vectoren bij de verspreiding van Bb zijn de Ixodid-teken. Kennis van de 2-jarige, 3 stadia-bevattende levenscyclus van deze teken geeft inzicht op de verspreidingswijze van Bb: 





De larve van de teek broedt in de zomer uit en is gewoonlijk nog niet geïnfecteerd met de Bb-bacterie. De teek kan in elk stadium van de levenscyclus besmet worden door het voeden aan een gastheer. [ CITATION Mur10 \l 2067 ] Teken kunnen besmet worden in de larve-fase tijdens het voeden aan geïnfecteerde knaagdieren. [ CITATION Til08 \l 2067 ] Daarna overwinteren de larves en komen ze tijdens de lente tevoorschijn in het nymfen-stadium. In dit stadium voeden de teken zich aan een wijd aantal verschillende dieren, waaronder knaagdieren. Teken die in het larven-stadium al geïnfecteerd werden kunnen zo Bb doorgeven aan nog ongeïnfecteerde dieren, die gaan dienen als reservoir. Ongeïnfecteerde nymfen kunnen op hun beurt de Bb-bacterie opvangen van een reservoir. [ CITATION Til08 \l 2067 ][ CITATION Mur10 \l 2067 ] Na dit stadium vervellen de nymfen tot volwassen teken in de herfst. In dit stadium voeden de teken zich exclusief aan grote dieren. Dit zijn niet altijd competente gastheren voor Bb (door de immunopathogene respons). Volwassen vrouwtjes brengen vaak de winter door bevestigd aan grote (zoog)dieren (vandaar de namen als 'deer-tick', 'sheep-tick' en 'dog-tick') waarna ze hun eieren leggen in de lente (zo'n 3000) voor ze sterven. [ CITATION Til08 \l 2067 ][ CITATION Mur10 \l 2067 ]

1.3.3 Ov Overdracht erdracht vvan an B. burgdorferi sensu la lato to naar en door de mens. Zowel nymfen als volwassen teken kunnen zich voeden aan de mens. Nymfen hebben echter meer kans om Bb over te dragen omdat hun geringe grootte (Fig. 4) ze moeilijk te vinden maakt waardoor ze zich lang genoeg kunnen voeden. Bb wordt meestal pas na

Fig. 4 - de verschillende stadia van I. scapularis, de

10 Lyme-vector in Amerika. voornaamste V.l.n.r.: Larve, Nymf, Volwassen vrouwtje, Volwassen mannetje [ CITATION Mur10 \l 2067 ]

48-72 uur voeden door de teek overgedragen (zie 2.3.3.2 - OspC) [ CITATION Til08 \l 2067 ].

Teken moeten dus aan 2 voorwaarden voldoen voor ze Bb kunnen overbrengen: 1) De teek moet geïnfecteerd zijn met de bacterie. 2) De teek moet zich lang genoeg kunnen voeden (48-72 uur) Die laatste factor heeft te maken met de wijze waarop de bacterie in de verschillende gastheren verblijft. Bij de teek is dit in de middendarm. Daar hecht Bb zich aan de wand via OspA (= outer-surface protein A), dit is een proteïne op het buitenste membraan van Bb. Naarmate de teek zich vult met bloed van de gastheer (Fig. 5), vermindert de concentratie OspA die aanwezig is op het buitenmembraan waardoor de bacterie loskomt van de wand. De spirocheten migreren dan naar de speekselklieren van de teek van waaruit ze de nieuwe gastheer betreden. [ CITATION Til08 \l Fig. 5 - De rechter teek is een voorbeeld van een teek

2067 ] (zie 2.3.3.1)

die zich tussen de 48 - 72 uur heeft kunnen voeden met bloed van de gastheer. Wordt een teek voor dit stadium verwijderd dan wordt enkel in het zeldzame geval de ziekte van Lyme overgedragen. [ CITATION Mur10 \l 2067 ]

B. burgdorferi kan, net als de spirocheet Treponema pallidum (etiologisch agens van syfilis), seksueel worden overgedragen door de mens. De bacterie werd zowel in uitstrijkjes van vaginaal vocht als in sperma terug gevonden.[ CITATION Mid15 \l 2067 ] Ook tussen een geïnfecteerde, zwangere vrouw en haar foetus kunnen de bacteriën worden overgedragen. Een acute infectie (vroeg stadium) wordt als risicovoller beschouwd dan een chronische infectie (laat stadium) omdat er bij de chronische infectie al IgG antilichamen tegen het pathogeen zijn aangemaakt. [ CITATION Myl \l 2067 ] Ook zou de bacterie zich via borstvoeding kunnen verspreiden. [ CITATION Uyt14 \l 2067 ]

1.4 Sy Symptomen mptomen vvan an besmetting door B B.. burgdorf burgdorferi eri sensu lato. De klinische manifestatie van de ziekte wordt geclassificeerd in verschillende stadia: 1) het vroege, lokale stadium (Acute Lyme) 2) het vroege, uitgezaaide stadium (Acute Lyme) 3) het late stadium (Chronische Lyme) 1) In het vroege, lokale stadium zijn de bacteriën nog gecentraliseerd rond hun ingangspunt. Dit wordt meestal (maar niet altijd) vergezeld van een huidontsteking die gekend staat als erythema migrans. Deze verschijnt op en rond de plaats van een tekenbeet na 3 - 30 dagen (meestal op of tussen de 7e en 14e dag). Dit kan zowel één enkele ontsteking als meerdere over het ganse lichaam z...