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Cours d'Enzymologie de L2 Biologie (Semestre 4) Université de Bordeaux Année 2017*2018...

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Enzymologie Claire Stines remplir quizz moodle avant le TD

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Généralités et cinétique des réactions enzymatiques à un seul substrat Les enzymes : catalyseurs protéiques Elles multiplient la vitesse de réaction par un facteur très élevé Les enzymes sont des protéines = polymères (enchaînement) d’acides aminés. Les enzymes sont des protéines à activité catalytique. Le catalyseur va accélérer la vitesse de la réaction mais ne va pas changer l’équilibre thermodynamique.

Exemple de l’invertase (E pour enzyme) Elle catalyse l’hydrolyse du saccharose en glucose + fructose v1 = vitesse d’hydrolyse du saccharose v-1 = vitesse de reconstitution du saccharose (réaction minoritaire)

kuncat = 5 x 10-11 s-1 (= constante de vitesse uncat = uncatalytique = sans enzyme) ➔ très lent + (E) Kcat = 10⁴ s-1 ( = constante de vitesse cat = catalytique = avec enzyme) ➔ plus rapide. Quand on ajoute l’enzyme la réaction est accéléré de 2 x 10 14 fois par l’enzyme.

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Notion d’équilibre thermodynamique [ P 1][ P 2] [ E] on peut supprimer les [E] car elle est au départ de la réaction et [ S] [ E ] comme c’est un catalyseur elle est régénéré en fin de réaction (on la récupère comme au début) Keq=

➔ l’enzyme ne modifie pas l’équilibre thermodynamique v1 = k1 x [S] v-1 = k-1 x [P1] x [P2] à l’équilibre v1 = v-1 k ➔ 1 [S] = k-1 [P1] [P2]

L’eau est à 55M en solution donc quand une molécule d’eau disparaît ou apparaisse lors de la réaction ça ne va pas changer le 55M donc on en tient pas compte. Ces enzymes sont des composés ubiquitaires pour les transformation biochimique, on les retrouve partout : chez les plantes, les animaux, les bactéries … Ces enzymes sont inertes, une fois que la protéine est faite elle ne se multiplient pas, se diviser … C’est important car une enzyme en biotechnologie on va pouvoir l’utiliser pour récupérer les électrons transférés lors de la réaction enzymatique. L’enzyme va transférer 2 électrons, 4 électrons au mieux par cycle catalytique. Certains vont préférer utiliser des microorganisme car avec 1 glucose on va pourvoir récupérer 24 électrons en utilisant toute la machinerie du microorganisme (chaîne respiratoire, glycolyse …) L’avantage de l’enzyme c’est qu’elle est inerte mais ne permet pas de récupérer beaucoup d’électrons. L’avantage du microbe c’est qu’on peut récupérer beaucoup d’électrons mais il va poser des problèmes de contamination etc si on le met chez l’homme par exemple car il peut se multiplier.

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Grande sélectivité, spécificité de reconnaissance et de transformation de leurs substrats en particulier stéréospécificité absolue L’enzyme va transformer le glucose en gluconolactose par exemple et rien d’autre. On va pouvoir sélectionner l’enzyme qui transforme tel substrat. Ça a un intérêt en biotechnologie, c’est que par exemple les fils à combustible, on a une anode et une cathode, et ces fils à combustible il faut les séparer par une membrane qui est très grosse pour pas que l’anode n’interfère avec la cathode. Si on utilise des piles enzymatique, à l’anode on utilise le glucose, à la cathode on utilise l’oxygène par exemple, on a plus besoin de membrane, l’oxygène n’interfère pas l’anode, et le glucose n’interfère pas avec la cathode. On peut miniaturiser notre biopile. Autre exemple, en chimie, pour fabriquer par exemple ce qui empêche le gel de carburant dans les avions, on met du 1,2 propanediol. La chimie sait fabriquer du propanediol mais fabrique le R et le S. On va trouver des enzymes qui vont fabriquer que du R et du coup on aura du R pur pour mettre dans les carburants. L’enzymologie c’est faire des choses que la chimie seule ne sait pas faire.

Fonctionnement optimal pour température, pression, et force ionique du compartiment biologique qui les contient Il faut prendre en compte la température, la pression et la force ionique. Les compartiment cellulaire ne sont pas tous au même pH : •

lysosome pH acide ➔ on va avoir une phosphatase qui va fonctionner à pH acide

•

cytosol on est à pH neutre

•

mitochondrie pH basique vers 8

Dans le corps humain on est à 37°C donc il faut que les enzymes soient actives à 37°C. Chez le serpent ça va être plus froid. En fonction du compartiment cellulaire dans lequel on se trouve, la nature va sélectionner des enzymes différentes qui fonctionne suivant le pH (acide, neutre, ou basique), suivant la température. Il y a aussi la force ionique, il y a des enzymes halophile qui résiste au sel. Pour les trouver on va souvent chercher chez des organismes qui réside au fond des océans. Quand on produit des enzymes qui viennent d’organisme halophile on a besoin d’une forte concentration en sel pour qu’elle se replie, qu’elle soit active, voire stable.

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Le sel c’est important, certaines enzymes ne supporte pas le sel, elle sont inhiber quand on augmente le sel et donc la force ionique. Elles sont inhibées par le chlore par exemple. Dans le sang la concentration en sel est de 140mM, il y a quand même du sel dans le corps humain. La température est aussi importante, on a des enzymes thermophiles. Mésophiles enzymes fonctionnent autour de 60°C ou hyperthermophiles peuvent résister à 90°C 100°C. On peut les chercher sur des organismes qu’on trouve dans des volcans par exemple. Quand on travaille sur une enzyme il faut dire à quelle température, quel pH et quelle force ionique on a fait l’expérience (la pression est souvent la pression atmosphérique).

Enzyme souvent régulée par des inhibiteurs ou des activateurs y compris enzymes auxiliaires de régulation Exemple du foie Capable de fabriquer et de détruire du glucose : glycolyse et néoglucogenèse Ce ne sont pas les même enzymes qui font ces 2 réactions : •

Glycolyse ➔ Phospho – fructokinase

•

néoglucolyse ➔ fructose 1,6 – diphosphatase

Ces 2 enzymes catalysent la réaction reverse donc elles catalysent la même réaction mais en sens inverses. Si c’est pas contrôlé et que les 2 enzymes fonctionnent en même temps dans le foie, une consomme de l’ATP mais l’autre n’en fabrique pas. Donc on va avoir les deux réactions en sens inverses qui vont fonctionner, on va avoir une consommation d’ATP. ➔ Bilan final : on va s’épuiser en énergie et on ira ni vers la glycolyse ni vers la néoglucogénèse car les 2 réactions fonctionnent en même temps en sens inverse Dans le foie, il y a des activateur et des inhibiteur, l’activateur de l’un est inhibiteur de l’autre. Si on a beaucoup de sucre à dégrader l’activateur de la phospho-fructokinase va activer la glycolyse et inhiber la néoglucolyse et inversement. ➔ Au niveau métabolique, c’est essentiel de réguler ces enzymes Idem, la cellule fabrique des ATGC, il y a une régulation, s’il y a trop de AT il faut arrêter d’en fabriquer et fabriquer des CG et inversement. Quand on fabrique des médicaments c’est souvent pour inhiber des enzymes fabriquer lors de l’inflammation par exemple. On va faire des études de pharmacocinétique. On va utiliser des grandes chimiothèques qui sont des grandes plaques avec différentes molécules chimiques, on injecte l’enzyme et on voit si l’enzyme est inhibé ou pas.

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Quelques enzymes Enzyme est un polymère d’aa et on a différentes structure : •

structure primaire : séquence d’aa qui se replie pour former structure secondaire

•

structure secondaire : hélice α en rose et feuillet β en jaune sur les schémas

•

structure tertiaire : structure secondaire se replie en sous unité → monomère ou protomère de l’enzyme

•

structure quaternaire : les sous unités peuvent s’assembler entre elles pour faire des homodimères, homotétramères (mêmes sous unités) ou hétérodimères, hétérotétramères (sous unité différentes)

Phospolipase A2 humaine

Sur chaque diapo on va voir un code (1KQU ici), c’est le code pdb = protéines data bank = base de donnée où sont déposées toutes les protéines connues (obligé d’être déposé dans cette base de donner avant de publier, 1an après elle est accessible à tout le monde). Cette enzyme phospholypase A2 humaine hydrolyse le phospholipide qui est sur le carbone 2 du glycérol. Cette structure a été réalisé avec un analogue de substrat phospholipide (en gris), ➔ c’est un monomère car une seule sous unité Un analogue de substrat ressemble au substrat mais il ne va pas y avoir de catalyse, il va se lier dans le site actif mais va y rester car pas transformer en produits. On peut observer des structures du complexe Michaelien. On a E pour enzyme, S pour substrat, et P pour produit. E + S ⇌ ES ⇌ EP → E + P Le complexe Michaelien c’est ES (substrat lié à l’enzyme mais la catalyse n’a pas encore eu lieu, S n’est pas encore transfromer) Donc utiliser un analogue de substrat est une technique pour voir le complexe Michaelien.

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Il existe une autre technique utilisé par les cristallographes, le snapshot : on a un cristal de phospholipase, on fait diffuser le substrat à l’intérieur du cristal et on enregistre le clicher de diffraction toutes les secondes par exemple et on va enregistrer différents moments de la catalyse. En plus on voit en vert, le calcium. Il est représenté car l’enzyme a besoin de calcium pour fonctionner ➔ c’est une enzyme calcium-dépendante.

Glutathion peroxydase humaine

Le glutathion a des rôles physiologique important, il permet d’éliminer les espèces réactives de l’oxygène (H2O2) GSSG : c’est glutathion – pont disulfure – glutathion Le glutathion c’est un tripeptide :

C’est le soufre de la Cystéine qui va pouvoir faire un pont disulfure avec un deuxième glutathion. Rôle important il va aider à éliminer le H 2O2 , dans la cellule c’est souvent la superoxydes dismutases qui transforme le O23- en O + H2O2, donc ici la glutathion peroxydase humaine ça contribuer à éliminer le H2O2. Sa structure : on voit 2 axes de symétrie, un vertical et un horizontal. Cette enzyme répète 4 fois la même sous unité ➔ c’est un homotétramère. Au niveau de l’ADN on a une séquence d’ADN qui va codé pour une protéine qui représente un sous unité, la cellule va produire plusieurs protéines et elles vont s’assembler entre elles en tétramère. Les sites actif en bleu, ont du sélénium qui est essentiel à l’activité de l’enzyme ➔ c’est une séléno-protéine. Donc la on a l’enzyme qui oxyde le glutathion en glutathion oxydé et on a une autre enzyme GSSG réductase humaine qui va régénérer le glutathion sous forme réduite.

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GSSG réductase humaine Régénère glutathion sous forme réduite.

Cette enzyme a besoin de NADPH pour fonctionner qui va être transformer en NADP+, le NADPH vient de la voie des pentoses phosphates. Cette enzyme est un homodimère.

Si on fait un zoom sur le site actif : On voit qu’il y a une flavine dedans. La flavine est un deuxième cofacteur qui va comme le NADPH être essentiel à la catalyse. La flavine est un cofacteur ancré dans le site actif c’est-àdire qu’elle va être oxydé et réduite sous forme FAD et FADH2 dans l’enzyme, elle ne ressort pas de l’enzyme. Le NADPH, est réduit oxydé plusieurs fois au cours de la catalyse. Ce NADPH arrive de la voie des pentoses phosphate, il va rentrer dans l’enzyme, le NADP+ ressort, la cellule fournit un nouvel NADPH qui va rentrer NADP+ ressort etc ➔ c’est un cofacteur externe. Il faut que la cellule ai un ration NADPH / NADP+ qui doit être stable et doit fournir en continue les cofacteur nécessaire. Mais c’est intéressant en biotechnologie car c’est intéressant d’avoir un cofacteur ancré dans l’enzyme comme flavine, on a pas besoin d’en fournir.

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Cyclooxygénase COX2

C’est un homodimère. C’est une structure qui a été trouvé avec un analogue de substrat. Cette enzyme est précurseur de beaucoup d’hormone et elle est beaucoup étudier car quand on prend de l’aspirine on va inhiber COX2, qui est fabriquer lors de l’inflammation pour nous dire « j’ai mal » Le mécanisme est assez complexe, il y a plusieurs intermédiaire.

Zoom sur le site actif :

On voit en gris avec au milieu une boule bleu : c’est un name avec du fer au milieu. C’est une enzyme à site actif porphyrique.

➔ Pour qu’une enzyme fonctionne il n’y a pas que la séquence protéique qui est importante mais aussi les cofacteurs.

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Complexe pyruvate déshydrogénase bactérien (reconstitution ME/RX/RMN)

C’est un complexe car il est constitué de 3 enzymes différente et chaque enzyme est répétée en plusieurs exemplaires ce qui forme le complexe enzymatique. C’est intéressant car l’avantage de ces complexes c’est que l’enzyme 1 va décarboxylé, ce produit va être transmis directement à la 2ème enzyme. Le produit n’est pas relargué en solution, tout reste dans l’enzyme, rien n’est dilué dans la cellule pour trouver la 2ème enzyme qui serait ailleurs. Donc la catalyse est très efficace comme les 3 enzymes fonctionnent simultanément avec le produit 1 qui devient substrat 2. c’est transféré directement de site actif en site actif. Les complexes rendent beaucoup plus efficace l’activité enzymatique.

Cœur central du complexe PDH

On a que le cœur de l’enzyme de Bacillus stearothermophius qui est une bactérie.

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Pourquoi une enzyme est-elle un catalyseur très efficace ?

Les enzymes sont très grosse mais on va voir qu’il n’y a que 2 aa essentiels à la catalyse sur toute la protéine. Il faut savoir qu’on va avoir des protéines de structure très différentes qui vont catalyser la même réaction, donc on peut se demander comment la nature a sélectionner ces enzymes pour catalyser la même réaction. Et inversement on a des structures qui se ressemblent beaucoup mais elles ont évoluer complètement différemment et catalyse des réactions différentes. Donc c’est des évolutions convergentes et divergentes. On va voir 2 théorie : ✔ La théorie de la collision Elle est utilisé en cinétique chimique A–B + C → A + B–C On utilise cette théorie pour calculer les chocs entre les molécules dans une solution et la vitesse de réaction. ✔ La théorie de l’état de transition = TST (1935 Eyring) C’est celle que l’on va utiliser, elle est plus sophistiquée. A–B + C ⇌ A … B … C ⇌ A… B–C ⇌ A + B–C … = liaison covalente est en train de se défaire entre A et B et de se former entre B et C A … B … C = complexe intermédiaire A … B–C = complexe limite

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Si on regarde l’évolution des coordonnées de la réaction

pic ➔ état de transition qu’on ne peut pas caractériser vallée ➔ intermédiaires covalents qu’on peut isoler

ΔG (= barrière énergétique) diminue en présence d’enzyme On va avoir plusieurs intermédiaires et plusieurs états de transition.

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Quelques exemples de réactions à un seul substrat

On peut voir qu’il peut y avoir 1 ou plusieurs produit même s’il y a qu’un seul substrat (hydrolyse) •

isomérisation : transforme molécule et son isomère: l’enzyme va casser une liaison, on aura la même formule brute mais une formule semi développée différente

•

condensation intramoléculaire : elle fabrique une liaison C–C, on a l’adénylate cyclase qui est une enzyme membranaire par exemple

Les cinétiques d’enzymes solubles vont être différentes des cinétiques d’enzymes immobilisé dans la membrane Les enzymes solubles donc l’enzyme et le substrat sont mobiles et vont se rencontrer. Quand l’enzyme est immobilisé dans la membrane il faut que le substrat arrive jusqu’à la membrane pour rencontrer l’enzyme. •

Hydratation, déshydratation : comme l’anhydrase carbonique qui est une enzyme très efficace (10⁷ / 10⁸ s-¹), elle transforme le CO2 en HCO3- , la fumarase transforme l’alcène en alcool

•

Hydrolyse : un substrat donne plusieurs produit. Quand on a une molécule d’eau impliqué dans une réaction d’hydrolyse, on va couper le substrat en plusieurs morceaux (au moins 2).

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Site Actif

Un site actif peut être une poche, une crevasse ou un conduit. Il est composé de 2 choses : •

site(s) de liaison qui sont les résidus essentiels pour la liaison des substrat et des cofacteurs, ce qui est essentiel c’est quels sont les aa responsable de la reconnaissance du substrat et ceux responsables de la reconnaissance des cofacteurs.

•

site catalytique qui est un résidus essentiels pour la catalyse, c’est là où se passe la réaction enzymatique. Il faut un acide aminé catalytique. Quels sont les aa essentiels à la catalyse

Pour trouver les différents aa essentiels on peut utiliser la mutagénèse dirigée.

Exemple de la triose phosphate isomérase Le site actif est construit sur un motif supersecondaire classique qui est le tonneau β, motif qu’on retrouve dans plusieurs structure. Si on zoom sur le site actif, on a identifié le glutamate 165 qui a un rôle essentiel dans la catalyse. Même quand on a des hydrolyses, ce n’est pas H2O qui fait l’hydrolyse c’est OH- donc dans le site actif on a la molécule d’eau et on aura peut être un glutamate ou un autre aa essentiel qui va attirer un proton de H2O ce qui va activer la molécule OH- pour faire l’hydrolyse.

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Notion d’ajustement induit On a le modèle clé serrure : reconnaissance clé serrure directe, modèle très obsolète

On a aussi le modèle de l’ajustement induit : On a une enzyme qui a une forme pas définie, quand le substrat s’approche de l’enzyme, celle ci va subir un changement conformationnel et adapter sa conformation à celle du substrat pour faire la catalyse. On prend en compte le fait qu’une protéine elle vibre = respiration. Elle est tout le temps en mouvement.

Plusieurs liaisons sont en cause, le substrat va être reconnu et va impliqué différentes liaisons. On peut parler de : diapo •

liaisons de Van der Waals, elles se font entre 3 et 4 Å (angstrom) on a un atome A avec un rayon RA, un atome B avec un rayon RB et quand on aura la distance RA+RB = 3 ou 4 Å on aura une liaison de VDW.

•

liaisons hydrogène, elles se font à une distance de l’ordre de 2 Å, on va avoir des donneur (OH, NH ...) et des accepteurs (O, N … ) de liaisons hydrogènes. En fonction du pH les aa vont jouer soit le rôle d’accepteur, soit le rôle de donneur. Par exemple, l’acide glutamique sous la forme COOH va jouer le rôle de donneur et d’accepteur à pH acide, mais à pH basique sous forme COO- il va seulement avoir un rôle d’accepteur.

•

interaction électrostatiques, dans les protéines on va avoir des pont ioniques, qui sont de faibles distance, environ 2,8 Å. Comme une Lys avec un Glu … pour ces interactions électrostatiques, les molécules d’eau vont venir perturber le système, en fonction du pH le pont ionique sera là ou absent d’où le fait que l’enzyme fonctionne ou non suivant le pH dans lequel elle se trouve

•

interactions hydrophobes, si on a un groupement apolaire il va avoir tendance à exclure les molécules d’eau et ça va favoriser les interactions entre molécules apolaires.

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On a dit que l’enzyme catalyse la transformation d’un substrat en 1 ou plusieurs produits •

1 substrat donne 1 produit, on va parler de réaction uni uni

•

1 substrat donne 2 produit, on va parler de réaction uni bi

Il existe 2 solutions pour suivre la réaction : •

soit on suit la disparition du substrat en fonction du temps