TD Enzymologie 2 PDF
| Title | TD Enzymologie 2 |
|---|---|
| Author | ZIH CHUN CHOULET |
| Course | Enzymologie |
| Institution | Université Claude-Bernard-Lyon-I |
| Pages | 6 |
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Summary
TD 2011...
Description
UniversitéLyon1–2010/2011
BCH3004L
TravauxDirigésd’enzymologie–UEEnzymologie2–L3Biochimie Exercice1:Monooxygenased’unebactériemethanotrophe Les hydrocarbures chlorés sont des polluants très fréquents dans les aquifères, leur biodégradation est donc très étudiée. Ces molécules sont transformées en composés moins toxiques par quelques espèces bactériennes, dont des bactéries méthanotrophes, qui utilisent l’oxydation du méthane pour leur croissance.Lapremièreétapedecetteoxydationestcatalyséeparuneméthanemonooxygenase,enzyme quiestégalementcapabled’oxyderdeshydrocarbureschloréscommeledichlorométhane. Pourdéterminerlesmeilleuresconditionsdecultured’un decesorganismes(Methylosinustrichosporium OB3b,ArchMicrobiol(1999)171:301‐308), la vitesse de fonctionnement de la méthane monooxygenase a étéétudiéeenfonctiondelaconcentrationendichlorométhane.Lesrésultatsobtenussontanalysésetles représentationsv=f([S])et[S]/v=f([S])indiquentquel’enzymeobéitaumodèledeMichaelisetMenten. Les vitesses mesurées sont en nmoles.min‐1 et les concentrations du substrat (dichlorométhane) varient de0à100μM.Onutilise1μgdecetteenzyme(63158Da)pourchaquemesure.
Ecrirel’équationdécrivantlareprésentationv=f([S])(faireladémonstration). Retrouvez,àpartirdecetteéquation,celledelasecondereprésentation. Sachantqueici:[S]/v=0.008x[S]+0.18
QuellessontlesvaleursdeKMetdeVmax? Quelleestl’activitéspécifiqueetquelleestlavaleurdekcat? Exercice 2: atrazine chlorohydrolase L’atrazine est un désherbant très largement utilisé depuis une cinquantaine d’années. La dégradation de cette molécule dans le sol étant très lente elle contamine de façon préoccupante les nappes phréatiques dans toutes les régions d’agriculture intensive. On dispose d’une atrazine chlorohydrolase recombinante qui catalyse la transformation de l’atrazine en hydroxyatrazine,cedernier composéétant moinstoxiqueet dégradépardenombreuxmicroorganismes. Cette protéine a une masse de 240kDa, le KM pour l’atrazine est 150μM et la constante catalytique est kcat=600min‐1. On met en place un essai de décontamination de 1m3 d’eau contenant de l’atrazine 13nM avec 0.1g d’atrazinechlorohydrolase? Quelleseralavitesseinitialedelaréactionenmoles.L‐1.min‐1(expliquezvotrecalcul)? Combiendetempsfaudra‐t‐ilpourque90%del’atrazinesoitdégradée?
Exercice3:InfluencedeKM UnesolutioncontientuncomposéXdontlaconcentrationest10‐4Metunemêmeconcentrationdedeux enzymes A et B respectivement capables de transformer X en P1 et P2. Le KM de l’enzyme A pour ce composé est de 10‐3M et celui de l’enzyme B est cent fois plus faible. Les deux enzymes présentent la mêmevaleurdek2.
Danscesconditions,quelseraleproduitforméenplusgrandequantité? Quesepasserat‐il sila concentrationducomposé Xest 10foisplusélevée?Justifiezvotreréponse par unebrèveexplication. 1/6
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BCH3004L
Exercice4:Localisationsubcellulairedelaglucose‐6‐phosphatase. Onhomogénéise5gdefoiederatdans50mldesaccharose0,25Metparcentrifugationdifférentielleon obtientlesfractionsindiquéesdansletableauci‐dessous. Pour déterminer lʹactivité de cette enzyme, on ajoute un volume de chaque fraction (VPE) obtenue par centrifugationdifférentielleàunesolutiontamponnée(pH7,4à37°C)contenantduglucose‐6‐phosphate 10mMdansunvolumefinalde5ml.Auxtempsindiquésdansletableau,onprélève0,5mldecemilieu deréactionpourydoserlephosphatelibéré(sousformedephosphoreenμg). Fraction
Noyaux
Mitochondries
Microsomes
Cytosol
Volumetotal(ml)
50
10
10
5
40
[Protéines](mg/ml)
24
34
49
31
2,2
0,5
0,5
0,5
0,05
1,0
0
1,0
1,0
2,5
0
2
5
24
7,5
21
18
3,5
10
47
13,5
40
30
3,5
15
71
21
56
46
4,5
20
92
28
78
64
4,5
Temps(min)
VPE(ml)
Phosphoredosé(μg)
Homogénat
Pourchaquefractioncalculer:
L’activitétotale(enUI),l’activitéspécifique,laquantitédeprotéineset lepourcentagederécupération (rendement). Présenter les résultats sous forme de tableau. Que pouvez‐vous conclure quant à la localisationdelaglucose‐6‐phosphatase? Exercice5:Fixationdel’AMPàl’adénylatekinase Lʹadénylatekinase(27500Da)permetdeconvertirlʹAMPenADPpartransfertdʹunrésiduphosphoryle delʹATP.Lastœchiométrie defixation delʹAMPestétudiéepardialyseà lʹéquilibreen absencedʹATP. Onamisdʹuncôtédelamembrane40ml detamponcontenant80mgdʹenzyme,delʹautre40ml dʹAMP à différentes concentrations. A lʹéquilibre, on prélève 25 ml dans chacun des 2 compartiments pour y mesurerlaconcentrationenAMP. [AMP]danslecompartimentavecenzyme(µM) AMP]danslecompartimentsansenzyme(µM)
10,5 4
44 20
70 36
120 74
212 156
280 220
DéterminerlaconstantededissociationdessitesdefixationdelʹAMPetleurnombre. t (min) 0 0.5 UneprotéinePquipossèdedeuxrésidus histidineaétéétudiéeparphoto‐oxydation. On 1 mesurelenombrederésidushistidinerestants(molesHis/moleP): 2 3 Sachant que la réaction d’oxydation suit une cinétique d’ordre 1, calculez la constante de 4 vitessed’oxydationpourchaquerésiduhistidine. 5.5 7 8.5 10
Exercice6:Photo‐oxydationdeshistidines
His 2.00 1.58 1.32 1.04 0.91 0.84 0.76 0.71 0.65 0.61 2/6
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Exercice7:Mutantsd’unealcooldéshydrogénase On dispose de plusieurs alcools déshydrogénase dont trois mutants: ADHm1‐3 et l’enzyme sauvage (ADHs).Toutescesprotéinesontlamêmemassemolairede125000g.mol‐1.Lʹenzymenormaleprésente uneactivitéspécifiquede2mmol.mg‐1.min‐1.Danstouteslesmesures,leNADHestsaturant,laréactiona lieuàpH7. Onutilise50μLdʹunesolutiondʹADHsà1mg.ml‐1,etavecuneconcentrationenacétaldéhydede10‐4M, onobtientVi=10μmol.min‐1.
CalculezKMpourl’ADHs. OnétudielʹenzymemutéeADHm1àlamêmeconcentration [acétaldéhyde](μM) 50 100 200 500 1000 2000
ViADHm1 (μmol.min‐1) 5.5 10 16.7 28 35.7 41.6
Comparez les constantes cinétiques des deuxenzymes. La mutation améliore‐t‐elle lʹefficacité catalytiquedelʹenzyme?
Onajouteauxdeuxenzymes10mMdʹuninhibiteur.Onobtientalorslesconstantessuivantes: ADHs ADHm1
KʹM=1800μM KʹM=400μM
Vʹmax=100μmol.min‐1 Vʹmax=50μmol.min‐1
Analysezlʹeffetinhibiteursurchacunedesenzymes.CalculezKI. Quepeutonconcluresurlamutationdelʹenzyme? L’alcooldeshydrogénasesauvage(ADHs)estégalementinhibéeparunsecondinhibiteurJ(ilestutiliséà uneconcentrationde50μM). En parallèle, l’étude d’un autre mutant de l’enzyme (ADHm2) révèle que celui‐ci possède un comportement différent de l’enzyme sauvage en présence de J (utilisé à la même concentration) mais qu’ilsecomportedemanièreidentiqueàl’enzymesauvageenabsenced’inhibiteur. Lesvaleursexpérimentalessontdonnéesdansletableausuivant. [acétaldéhyde](μM) 50 100 200 500 1000 2000
VitessesenprésencedeJ(50μM)enμmol.min‐1. Vi pourADHs VipourADHm2 3,3 4,8 6,1 8,3 10,25 13,3 17,6 20,8 23 25,7 27,2 29
A partir des données suivantes déterminer la nature de l’inhibition et en déduire les constantes ad hoc pourl’enzymesauvageainsiquepourADHm2. Que sepasse‐t‐il pourl’enzymeADHm2?Proposerune explicationrationnelle. Letroisièmemutantquantàluiprésenteleprofil présenté danslafigure ci‐contre:
Proposezunmécanismequiexpliqueraitlecomportementobservé. Etablirl’équationdevitessecorrespondante. 3/6
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Exercice8:Cinétiquesàdeuxsubstrats En admettant lʹhypothèse du quasi‐équilibre, établir lʹéquation de vitesse dans le cas de la fixation au hasarddedeuxsubstratsAetBsuruneenzyme,enposant: (E)(A) Ka= (EA)
Kaʹ=
(EB)(A) (EAB)
Kb=
(E)(B) (EB)
Kbʹ=
(EA)(B) (EAB)
SinoustravaillonsavecuneconcentrationconstantedeBetsicelle deAvarie,donnezuneexpression quipermetteunereprésentationlinéairedelʹéquationdevitesse. Déterminezlescoordonnéesdupointdʹintersectiondesdroites1/v= f(1/[A]))obtenues pour différentes concentrationsdeB. Déterminezlescoordonnéesdespointsdʹintersectionidecesdroitesaveclʹaxedesordonnées. Tracezlesreprésentationssecondairesi=f(1/[B]). Quedeviennentcesparamètreslorsquelaconcentration deAestconstante,etque laconcentrationdeB varie?
Exercice9:LʹUDP‐glucosepyrophosphorylase LʹUDP‐glucosepyrophosphorylasecatalyselaréaction: UTP+D‐glucose1‐phosphate(ouG1P)↔UDP‐glucose+PPi On supposera que les fixations de lʹUTP et du G1P sur lʹenzyme sont indépendantes lʹune de lʹautre. DanstoutcetexerciceonutiliseratoujourslamêmequantitédʹUDP‐glucosepyrophosphorylase. Onmesureensuitevienprésencededifférentes concentrations initiales dʹUTP, celle du G 1‐P étantconstante:
On mesure vi (nmoles dʹUDP‐glucose produit par minute) avec différentes concentrations initialesdeG1‐P,celleenUTPétantconstante: [G1P]x10‐4(M) 0,20 0,25 0,50 0,60 1
[UTP] x10‐4 (M) 1 2 4 6,66 10
vi(nmoles.min‐1) 0,403 0,455 0,629 0,667 0,772
vi(nmoles.min‐1) 0,200 0,269 0,320 0,350 0,365
AlʹaidedelareprésentationdeLineweaver‐Burk,déterminerKmetVmax: 1.pourlʹUTP
2.pourleG1‐P
On mesure vi avec différentes concentrations initiales dʹUTP, la concentration initiale de G1P restant constante,etenprésencededʹUDP‐glucose,quiestlʹundesproduitsdelaréaction. [UTP]x10‐4(M)
[UDP‐glucose]=7,5.10‐6 M vi (nmol.min‐1)
[UDP‐glucose]=2.10‐5M vi (nmol.min‐1)
1 2 4 6,66 10
0,114 0,179 0,244 0,294 0,323
‐ 0,115 0,179 0,227 0,270
Quel type dʹinhibition, vis‐à‐vis de lʹUTP, lʹUDP‐glucose exerce‐t‐il sur lʹUDP‐glucose pyrophosphorylase? 4/6
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Si lʹon assimile lʹUDP‐glucose à un inhibiteur, calculer la constante de dissociation KI du complexe UDP‐glucosepyrophosphorylase‐UDP‐glucose. Onmesureviavec différentes concentrationsinitialesdeG1P,laconcentrationenUTPrestant constante, etenprésencedʹUDP‐glucose,quiestlʹundesproduitsdelaréaction. [G1P]x10‐4(M)
[UDP‐glucose]=7,5.10‐6 M vi (nmol.min‐1)
[UDP‐glucose]=2.10‐5M vi (nmol.min‐1)
0,20 0,25 0,50 0,60 1
0,160 0,182 0,250 0,267 0,308
0,080 0,091 0,125 0,133 0,154
Quel type dʹinhibition, vis‐à‐vis du G 1‐P, lʹUDP‐glucose exerce‐t‐il sur lʹUDP‐glucose pyrophosphorylase? Si lʹon assimile lʹUDP‐glucose à un inhibiteur, calculer la constante de dissociation KJ du complexe UDP‐glucose pyrophosphorylase‐UDP‐glucose. Cette valeur est‐elle en accord avec celle obtenue dans précédemment? Auvudel’intégralitédesdonnées,proposerunmécanismed’actionpourcetteenzyme. Exercice10:Mécanismeséquentielordonné Après avoir posé le schéma réactionnel pour une réaction enzymatique à deux substrats présentant un mécanisme séquentiel ordonné, démontrer l’équation de vitesse correspondante, dans l’hypothèse de l’équilibre rapide.Proposerdesreprésentationslinéairede cetteéquationafin d’accéderaux constantes cinétiquescorrespondantes.
Exercice11:Etuded’uneprotéase Lʹétudedʹunenzymeprotéolytiqueaétémenéedelafaçonsuivante: La masse moléculaire de lʹenzyme est 40 000. Il catalyse la libération de p‐nitrophénol à partir de N‐ acétylphénylalanine‐p‐nitrophénylester (APNE). Cette réaction peut être suivie au spectrophotomètre à 410nmgrâceàlalibérationdelʹionp‐nitrophénatequidonneunecouleurjaune. UneétudecinétiqueaétéréaliséeafindedéterminerlaconstantedeMichaelisàpH7. HydrolysedelʹAPNEparlʹenzymeprotéolytique Temps(min)
125
200
333
1000
1 2 3 4 5
0,026 0,046 0,069 0,092 0,111
0,019 0,045 0,075 0,104 0,132
0,037 0,073 0,103 0,143 0,181
0,044 0,097 0,144 0,195 0,243
Concentration(µM)de lʹAPNE (DOà410nm)
Lʹexpérience suivante a été réalisée pour voir si on pouvait bloquer un groupe essentiel du centreactif:1,60 mgdʹenzymeesttraité parlechlorurede2‐phényléthane sulfonyle(ci‐ contre)marquéavecdu35S(activitéspécifique:57000cpm/µmole). Après dialyse, lʹenzyme nʹa plus dʹactivité. Après précipitation par lʹacide trichloracétique (TCA) et lavageduprécipitéonretrouveuneradioactivitéde2320cpmdanscelui‐ci.Unautreéchantilloninactivé
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de façon similaire est traité par H2S en milieu neutre pour rechercher le mode de fixation du soufre radioactif.Eneffet,lesesterssulfoniquesréagissentdelafaçonsuivante: R SO2
R HS R SO3 HS R
tandisquelessulfonamidesneréagissentpas:toutelaradioactivitéesticidécrochéedelʹenzyme. On détermine alors la composition en acides aminés dʹun échantillon de protéine ainsi traitée. Les résultatssontlessuivants: Compositionenacidesaminésdelaprotéaseavantetaprèstraitementparle2‐Phenyl‐Ethane‐Sulfonyl‐ChlorideetH2S Tyrosine Aspartate Glutamate Lysine Serine Thréonine Cystéine(acidecystéiqueaprès oxydation)
Acideaminé(µmol/mgprotéine) Avanttraitement aprèstraitement 0,252 0,251 0,376 0,377 0,553 0,549 0,129 0,123 0,151 0,124 0,049 0,047 0,101 0,123
Quelleestlastoechiométriedelaréactionduchlorurede2‐phényléthanesulfonyleaveclaprotéine. Le dérivé contenant un taux élevé de cystéine nʹest pas capable dʹhydrolyse lʹAPNE. Pour savoir si cela est dû à une modification de la capacité de lʹenzyme à fixer le substrat, un échantillon est dialysé contre une solution dʹAPNE marqué au 14C. Après équilibration, la radioactivité à lʹextérieur du sac à dialyse est de 2 430 cpm/ml alors quʹà lʹintérieur elle est de 3 190 cpm/ml pour une concentration en protéinede4mg/ml(RadioactivitéspécifiquedeAPNE:24000cpm/µmoles).
Quellesconclusionspeut‐ontirerdecesexpériencesencequiconcernelefonctionnementdelʹenzyme? Exercice12:Inactivationirréversible Etablir lʹéquationdevitessedʹuneinactivationirréversiblepartielle. Enconsidérantlʹexpression deVʹmax danscecasetenlacomparantàcelleobtenuedanslecasdʹuneinhibitionnoncompétitive,suggérezdes méthodes expérimentales permettant de distinguer une inactivation partielle de lʹenzyme dʹune inhibitionnoncompétitive. Existe‐t‐ildʹautresméthodesexpérimentalessimplespermettantdefairecettedistinction?
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