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Ingeniería Bioquímica TEMA 6. CULTIVOS CELULARES Y CRECIMIENTO MICROBIANO CONTEXTO Como resultados del aprendizaje asociado a este tema, se adquieren las siguientes competencias:     

Aprender conceptos generales y mecanismos básicos de biología molecular y biotecnología Adquirir conocimientos sobre estudios cinéticos de enzimas y mecanismos catalíticos y su aplicación posterior a sistemas de la industria bioquímica Analizar las características y peculiaridades de los fermentadores y la influencia de las condiciones de operación Diseñar reactores enzimáticos en fase homogénea Diseñar fermentadores para una producción óptima de productos, con análisis de la influencia de las condiciones de operación

Los contenidos abarcan los aspectos relacionados con la cinética de poblaciones y con el diseño y análisis de reactores enzimáticos y fermentadores. ÍNDICE 6.1. Crecimiento de cultivos celulares 6.1.1. Fases de crecimiento en los cultivos celulares 6.1.2. Cinética de crecimiento. Ecuación de Monod 6.2. Crecimiento celular, consumo de sustratos y generación de productos: estequiometría, rendimiento y aspectos cinéticos 6.2.1. Estequiometría de formación de producto 6.2.2. Rendimientos 6.2.3. Generación de calor 6.2.4. Cinética de consumo de sustrato y formación de producto 6.3. Diferentes modelos de crecimiento celular

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Ingeniería Bioquímica TEMA 6. CULTIVOS CELULARES Y CRECIMIENTO MICROBIANO 6.1. Crecimiento de cultivos celulares Cuando se añade una pequeña cantidad de células vivas a una disolución líquida que contiene nutrientes esenciales a pH y temperatura adecuados, el cultivo crece. El crecimiento tiene dos manifestaciones diferentes según la naturaleza de las células implicadas. Para organismos unicelulares, que se dividen cuando crecen, el aumento de biomasa va acompañado del aumento del número de células. Por tanto, el problema se plantea como el de crecimiento de la población. Sin embargo, en el caso de los hongos, el crecimiento supone el aumento de la longitud y el número de micelios, y por tanto el aumento del tamaño y de la densidad del cultivo, pero no necesariamente del número de individuos. Durante el crecimiento de una célula ocurren otros dos procesos asociados: captación de ciertos materiales del medio y liberación de productos metabólicos finales a los alrededores. La velocidad de estos procesos varía mucho a lo largo del crecimiento celular, y la complejidad de los modelos que proporcionen la descripción cinética adecuada depende de la complejidad del cultivo y del objetivo con el que se plantee la cinética. En la figura 6.1 se muestra un resumen de la situación, en la que hay implicados dos sistemas que interaccionan e intercambian materia, energía y cantidad de movimiento. Evidentemente no es práctico (ni posible) plantear un modelo cinético que incluya todos los detalles que se indican en la figura 6.1, y se suelen establecer una serie de aproximaciones:

• • • • • • •

Ambiente (medio) Multicomponente Reacciones en disolución Equilibrio ácido-base pH, T variables Cambio de propiedades reológicas Multifásico (G-L, L-L-, G-L-L) No uniformidad espacial

Nutrientes Sustratos Productos Calor

Interacciones mecánicas

• • • • • • •

Población celular Multicomponente Heterogeneidad de células Multirreacción Control interno Adaptabilidad Estocástico Deriva genética

Figura 6.1. Resumen de algunos parámetros, fenómenos e interacciones importantes que determinan la cinética de poblaciones celulares 



Se considera que todos los componentes del medio, excepto uno, están presentes a concentraciones suficientemente elevadas como para que los cambios de concentración no afecten a las velocidades globales. Por tanto, un único componente es el nutriente limitante de la velocidad, y sólo se necesita considerar la concentración de ese nutriente cuando se analiza la influencia de la composición del medio sobre la cinética de crecimiento. No obstante, ocasionalmente es necesario considerar otros componentes del medio, como por ejemplo inhibidores, para poder tener una descripción adecuada del crecimiento de un cultivo. En lo que se refiere a otros parámetros ambientales, se suele suponer que no afectan significativamente a la cinética de crecimiento microbiana en la escala de tiempo o en el intervalo de variación de las condiciones experimentales o de proceso típicas.

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El control externo de los biorreactores permite regular parámetros tales como pH, temperatura y concentración de oxígeno disuelto, aunque en ocasiones es necesario incluir en los modelos una descripción multicomponente y multivariable del medio.

6.1.1. Fases de crecimiento en los cultivos celulares Típicamente, los datos cinéticos de una población celular se pueden obtener utilizando reactores de tanque agitado, continuos o discontinuos. En el caso de reactores continuos, fijadas unas determinadas condiciones de operación, la población celular evolucionará hacia un cierto estado estacionario. Si se define:  

D = velocidad de dilución = Q/V, con Q = caudal de alimentación y V = volumen del reactor  = velocidad específica de crecimiento = rX/X con rX = velocidad de consumo de sustrato y X concentración de sustrato

y, si Xe es la concentración de células con que se alimenta el reactor, aplicando un balance de células: D·Xe = (D-)X

(6.1)

y, si la alimentación es estéril (Xe = 0): D = (6.2) Por tanto, fijando diferentes velocidades de dilución se obtienen diferentes velocidades de crecimiento que se podrán utilizar en estudios cinéticos. Esto será así mientras no se supere el límite de lavado del reactor, es decir, el punto en el que la velocidad de dilución es superior a la máxima velocidad de crecimiento. La obtención de datos cinéticos en reactores continuos tiene la ventaja de que se logra mantener a las células en un estado reproducible y relativamente bien definido. En contrapartida, la experimentación es más compleja, hay más riesgos de contaminación y se requieren tiempos de ejecución relativamente largos. En el caso de los reactores discontinuos, el crecimiento de las células tiene lugar dentro del reactor y, al no haber regeneración del medio de cultivo, el crecimiento se detiene cuando se llega a algún tipo de limitación. En la figura 6.2 se muestran las cuatro fases típicas de un crecimiento celular en discontinuo. En primer lugar existe una fase de latencia, en la que no se produce un aumento sustancial del número de células y en la que tiene lugar la adaptación al medio y condiciones de cultivo. A continuación se inicia la fase de crecimiento exponencial, en la que el crecimiento se efectúa a la velocidad específica constante . En esta fase se puede considerar que el crecimiento está balanceado, en el sentido de que no existen limitaciones y el comportamiento metabólico y fisiológico de las células es básicamente constante (a veces se define como un comportamiento pseudo-estacionario). La ecuación que describe el aumento de la concentración celular es:

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Si la concentración celular al final de la etapa de latencia (t lag) es X0 (depende del inóculo utilizado), la forma integrada de la ecuación es:

o bien:

Fase de Fase de Crecimiento latencia exponencial

Fase estacionaria

Fase de muerte

Ln X

t

Figura 6.2. Fases de crecimiento exponencial en discontinuo En un crecimiento discontinuo las células no pueden reproducirse indefinidamente y, al final de la fase exponencial, la velocidad va decreciendo a medida que aparecen limitaciones, haciéndose prácticamente nula en la denominada fase estacionaria de crecimiento. Finalmente se llega a una fase de muerte celular, en la que decrece el número de células: una vez que se agotan las reservas de nutrientes, los microorganismos metabolizan su propio material celular, sin que haya reposición, de forma que tiene lugar la destrucción de las células (respiración endógena). Tanto si se lleva a cabo la experimentación en reactores continuos o discontinuos, se termina obteniendo valores de la velocidad específica de crecimiento, bien directamente o por diferenciación de la curva de crecimiento, que se tratarán de ajustar a algún modelo, de forma que el ajuste numérico de los valores experimentales a los valores predichos por el modelo permitirá determinar los valores óptimos de los parámetros cinéticos, es decir, aquellos que minimizan el error entre los valores experimentales y los calculados. 6.1.2. Cinética de crecimiento. Ecuación de Monod La ecuación de Monod se utiliza para describir el crecimiento celular en función de la disponibilidad de un sustrato limitante: Sustrato (S) + células (X) → más células (X) + producto (P) 175

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donde rX es la velocidad de crecimiento de las células, m es el máximo valor que puede alcanzar la velocidad de crecimiento y KS es la constante de Monod. Es bastante habitual expresar la ecuación en función de la velocidad específica de crecimiento:

El máximo valor que puede alcanzar la velocidad de crecimiento (m) se alcanza cuando S >> KS y las concentraciones del resto de nutrientes no han cambiado de forma notable. KS es el valor de la concentración de nutriente limitante a la que la velocidad específica de crecimiento es la mitad de la máxima. Para valores de S inferiores a KS, la velocidad de crecimiento depende de forma lineal de S, mientras que para valores superiores, el valor de  se hace independiente de S. Uno de los inconvenientes que plantea el uso de la ecuación de Monod es la dificultad de una correcta determinación del valor de KS, dado que normalmente es muy pequeño. Por otro lado, se trata de una ecuación muy simple que no siempre es capaz de describir adecuadamente el crecimiento de los cultivos celulares. Por ello se han desarrollado otros modelos, algunos de los cuales se muestran en la tabla 6.1. Además, se debe también tener en cuenta que, en ocasiones, el crecimiento celular también está afectado por inhibición por el sustrato o inhibición por el producto (en la tabla 6.1 se recogen también algunas de las ecuaciones utilizadas en estos casos).

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Ingeniería Bioquímica Tabla 6.1. Principales ecuaciones utilizadas (además de la ecuación 6.7) para describir el crecimiento de cultivos celulares

Tessier

Crecimiento del cultivo Moser

Contois

Inhibición por el sustrato Andrews y Noack

Webb

Tipo Teissier

Aiba y col.

Tseng y Wymann

Inhibición por el producto Dagley y Hinshelwood

Holzber y col.

Ghose y Tyagi

Aiba y Shoda

Jerusalimski y Neronova

Levenspiel

La ecuación de Monod generalizada, propuesta por Han y Levenspiel, intenta cubrir la mayor parte de las situaciones mencionadas en la tabla 6.1, en particular la inhibición por el sustrato, el producto (Ci = P) o las mismas células (Ci = X):

o

con:

Ci = concentración de inhibidor Ci* = concentración crítica de inhibidor que detiene por completo el crecimiento celular

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Departamento de Ingeniería Química Universidad de Alicante n, m = constantes relacionadas con el poder tóxico del inhibidor Si en la ecuación generalizada se sustituye Ci por S, P o X, se puede tratar la inhibición por sustrato, producto o las propias células. Si C m > 0 inhibición generalizada (anticompetitiva), con m > n > 0 inhibición anticompetitiva, con n = m > 0 caso general, con n > 0 y m < 0

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2

b)

1/ 

a)

1/ 

2

Ci

Ci

0

0

-0,5

0,5

-0,5

0,5 2

d) Ci

Ci

0

0

-0,5

0,5

1/S

-0,5

e)

0,5

1/S

f) 1/ 

1/ 

2

1/S

1/ 

c)

1/ 

2

1/S

Ci

Ci

0 -0,5

0 0,5

1/S

-0,5

1/S 0,5

Figura 6.3. Representaciones de Lineweaver-Burk para distintas formas de inhibición por el porducto, de acuerdo con el modelo de Han y Levenspiel (los distintos casos se corresponden con los que se citan en el texto) Si se producen múltiples efectos inhibidores, las ecuaciones cinéticas deben modificarse convenientemente, por ejemplo sustituyendo los términos del tipo

por

, mientras que cuando existen varios sustratos, las ecuaciones pueden modificarse del modo siguiente:

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Departamento de Ingeniería Química Universidad de Alicante donde la ecuación (6.14) corresponde a un caso en que el crecimiento está determinado por S1 o S2 según las concentraciones relativas y los valores de los parámetros 1 y 2; (6.15) y (6.16) corresponden a consumo de múltiples sustratos de manera no competitiva, cuando entre ellos se afectan de forma aditiva y multiplicativa, respectivamente. En ocasiones se observa una tendencia opuesta a la que predice por el modelo de Monod, y se produce una disminución de la concentración de células al disminuir la velocidad de dilución en el reactor. Este comportamiento puede explicarse por el metabolismo endógeno, en el que en las reacciones celulares se consume el propio material celular. En estos casos puede aplicarse la siguiente ecuación:

donde el término adicional, ke·X, puede interpretarse como la velocidad de muerte celular y ke es la constante de velocidad del metabolismo endógeno. 6.2. Crecimiento celular, consumo de sustratos y generación de productos: estequiometría, rendimiento y aspectos cinéticos El crecimiento celular obedece las leyes de la conservación de la materia. Además, la cantidad de algunos productos metabólicos formados o de calor generado por el crecimiento celular es, a menudo, proporcional a la cantidad consumida de algún sustrato o a la cantidad formada de algún producto. Todo ello hace factible plantear balances del tipo siguiente: Fuente de C + Fuente de N + O2+ minerales + nutrientes específicos → → Masa celular + Productos + CO2 + H2O Desde el punto de vista cuantitativo, las cantidades necesarias de nutrientes pueden determinarse a partir de la estequiometria de crecimiento y formación de productos ya que un crecimiento microbiano puede expresarse en forma de reacción química. Por ejemplo, para el crecimiento aerobio de Saccharomices cerevisiae sobre glucosa: C6H12O6 + a O2 + b NH3 → c CHxOyNz + d CO2 + e H2O y para calcular los coeficientes estequiométricos, es necesario conocer la composición elemental del microorganismo (por ejemplo, para el caso anterior, CH1.703O0.459N0.171), aunque ésta puede variar en función del sustrato y las condiciones de crecimiento utilizadas. A la hora de escribir la ecuación química representativa del crecimiento, no pueden incluirse en la ecuación química todos los componentes presentes en el medio de cultivo, de forma que la reacción suele expresarse únicamente en términos de los nutrientes limitantes, que suelen incluir las fuentes de carbono, de nitrógeno y oxígeno.

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Ingeniería Bioquímica 6.2.1. Estequiometría de formación de producto Si el producto principal se produce como consecuencia del metabolismo primario, puede escribirse una ecuación química similar a la anterior, introduciendo la fórmula molecular del producto: a CHmOn + b O2 + c NH3 → d CHxOyNz + e CO2 + f H2O + g CHvOwNk aunque esto no puede hacerse así cuando el producto se obtiene de manera indirecta a partir del metabolismo primario o es un metabolito secundario. Para determinar los coeficientes estequiométricos, además de conocer la composición elemental de todas las especies que intervienen en el proceso, se requiere información sobre el cociente respiratorio (RQ), que se define como los moles de CO2 producidos por cada mol de O2. 6.2.2. Rendimientos El concepto de reactivo limitante permite definir rendimientos del proceso. Se define el rendimiento biomasa-sustrato como el cociente entre el incremento de masa celular obtenida y el consumo de sustrato (normalmente el sustrato será la fuente de carbono): YX/S = X/S

(6.19)

y se expresa en las unidades derivadas de las utilizadas para la medida de biomasa y sustrato. Los rendimientos globales de un proceso dependen de la fuente de carbono utilizada y de las condiciones de operación, y pueden variar a lo largo del proceso ya que hay usos del sustrato que no están directamente relacionados con la producción de biomasa. En general, la variación de la concentración de sustrato puede deberse a tres causas principales:   

asimilación como material celular, (S)as provisión de energía para la síntesis celular, (S)e.c. provisión de energía para el mantenimiento del cultivo, (S)e.m.

Es decir, S = (S)as + (S)e.c. + (S)e.m. (6.20) y si se introduce el concepto de rendimiento global:

El primer término del sumatorio de la ecuación (6.20) corresponde al rendimiento del crecimiento propiamente dicho, o rendimiento teórico, que ha de mantenerse constante si se mantiene constante la composición celular, mientras que el rendimiento global se mantendrá constante o no en función de qué cantidad de sustrato vaya a cada uno de los términos planteados. El rendimiento teórico del crecimiento puede obtenerse a partir de los coeficientes etsequiométricos. Por ejemplo, para el caso de la saccharomyces cerevisiae, con CH1.703O0.459N0.171: C6H12O6 + 3.942 O2 + 0.330 NH3 → 1.928 CHxOyNz + 4.072 CO2 + 4.854 H2O 181

Departamento de Ingeniería Química Universidad de Alicante el rendimiento teórico sería 1.928 mol biomasa/mol glucosa. Pueden definirse rendimientos para otras parejas de parámetros:    

YX/S: g de biomasa/g de sustrato consumido; si se expresa como g de biomasa/mol de sustrato consumido recibe el nombre de tasa de crecimiento molar YX/O: g de biomasa/g de oxígeno consumido o por mol de oxígeno consumido YP/S: g o mol de producto/g o mol de sustrato consumido YC/S: mol de CO2 producido/mol de sustrato consumido

Mediante las definiciones de los rendimientos, se pueden relacionar las velocidades de aparición y desaparición de las diferentes especies (ri) de forma que, una vez caracterizado el comportamiento cinético de una de ellas, se pueden obtener las demás:

6.2.3. Generación de calor Una parte de la energía de los sustratos se elimina en forma de calor. La generación celular de calor es el resultado del metabolismo energético y del crecimiento. Se define un factor de rendimiento, Y (g de biomasa/kcal generada), que se calcula en función de las entalpías de combustión del sustrato y del material celular (HS y Hc, respectivamente):

La ecuación (6.23) representa un balance aproximado de energía para un crecimiento aerobio e indica que la generación de calor por gramo de sustrato consumido en la fermentación que produce células, CO2 y H2O es igual a la generación de calor por gramo de sustrato completamente oxidado (HS) menos el calor obtenido por combustión de las células producidas a partir de la misma cantidad de sustrato (YX/S·Hc), o lo que es lo mismo, que la generación de calor viene dada por la diferencia entre el contenido energético del sustrato consumido y de las células producidas:

Los valores de Y dependen de la especie microbiana particular y del sustrato consumido aunque, en general, el crecimiento sobre hidrocarburos conduce a mayor producción de energ...