Informe de Laboratorio de Bioquimica I #14 Activadores E Inhibidores Enzimáticos--Quinto Semestre PDF

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Carrera: Química y Farmacia INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRÁCTICA N°: 1 4 GRUPO: 2 C

TÍTULO DE LA CALIFICACIÓ PRÁCTICA: N: ACTIVADORES E INHIBIDORES ENZIMÁTICOS ESTUDIANTE: Déjame tu � si lo haz FECHA DE REALIZACIÓN: 3/02/2020 descargado FECHA DE ENTREGA: 10/01/2020 DOCENTE: Q. F. Karina Cordero López M.Sc

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:

1. Experimentar el efecto de activación de los aniones cloruros y la inhibición de los iones cobre sobre la actividad de la reacción catalizada por la enzima alfa amilasa. 2. Determinar el % de almidón hidrolizado en la reacción catalizada por la enzima alfa amilasa en las condiciones de ensayo establecida. 3. Calcular el % de activación e inhibición en la reacción catalizada por la enzima alfa amilasa 4. Establecer, ¿qué clase de inhibidor es el cobre? INSTRUCCIONES PREVIAS Y/O MEDIDAS DE SEGURIDAD La actividad catalítica de las enzimas puede modificarse de manera sustancial, por medio del empleo de inhibidores y activadores específicos que influyen en la velocidad de la reacción catalizada. Una enzima utilizada para manifestar este efecto es la alfa amilasa que es activada por los aniones cloruros e inhibida por los iones cobre. MARCO TEÓRICO / FUNDAMENTO Las enzimas son proteínas de alto peso molecular, actúan como catalizadores y controlan los procesos metabólicos de la célula, determinando el inicio y la marcha de algunas reacciones. Los catalizadores son sustancias que aceleran o retardan la velocidad de una reacción, sin sufrir un cambio químico en el proceso. A los que aceleran una reacción se les llama positivos y a los que las retardan, negativos. Las enzimas actúan generalmente como catalizadores positivos. (Arias, 2008) Las enzimas realizan una determinada función, por ejemplo, la enzima de la saliva (la amilasa) actúa sobre los almidones que comemos y los transforma en maltosa, las células utilizan procesos catalíticos para acelerar la velocidad de cada reacción. Las reacciones catalizadas por enzimas se encuentran bajo estricto control celular. Los biólogos han encontrado que casi todas las reacciones químicas de los seres vivos se llevan a cabo con la ayuda de catalizadores. Cada enzima interviene en una sola

reacción; debido a la forma de su superficie, sólo pueden acoplarse en ella ciertos tipos moleculares. Activadores enzimáticos Las reacciones químicas en los organismos vivos actuales, se realizan dentro de un margen de temperatura muy estrecho. Varias enzimas sólo pueden funcionar en presencia de uno o más iones o de determinadas moléculas llamadas activadores enzimáticos. Estas moléculas no toman parte directa en la acción, pero mantienen a la enzima, en un estado catalítico activo. Entre los iones más comunes encontramos al potasio (Na +), (K+), el magnesio (Mg++), el calcio (Ca++), el cobalto (Co++), el zinc (Zn++) y el aluminio (Al+++). A estas moléculas activadoras se les llama coenzimas y también pueden ser proteínas. (González, 2014)

Reacción de enzima sobre un sustrato y con un activador enzimático. Inhibidores enzimáticos Los inhibidores enzimáticos son sustancias que tienen en común la propiedad de disminuir la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas, sin que esto signifique que se haya producido la desnaturalización de la misma. Se distinguen dos tipos generales de inhibidores: reversibles e irreversibles. En la forma reversible, el inhibidor forma con la enzima un complejo enzima-inhibidor (EI) unido por fuerza no covalentes, y por lo tanto pueden disociarse. En la forma irreversible se producen modificaciones covalentes de la enzima que no pueden eliminarse fácilmente.

Reacción de enzima sobre un sustrato y con un inhibidor enzimático. La inhibición enzimática puede ser irreversible o reversible, esta última comprende a su vez tres tipos: inhibición competitiva, acompetitiva y no competitiva. 1. INHIBICIÓN IRREVERSIBLE. Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima uniéndose covalentemente a algún grupo funcional esencial para la catálisis con lo que el enzima queda inactivado irreversiblemente. El estudio de este tipo de inhibidores ha resultado de gran utilidad para identificar los grupos funcionales esenciales para la catálisis en aquellos enzimas a los que inactivan. Este tipo de inhibición se conoce también como "envenenamiento" del enzima. Por ejemplo algunos compuestos organofosforados tóxicos llamados venenos nerviosos, que se utilizan como insecticidas, actúan inhibiendo irreversiblemente al enzima acetilcolinesterasa, la cual interviene en la actividad del sistema nervioso. Se sabe que estos compuestos organofosforados inactivan al enzima formando un enlace éster fosfórico con el grupo hidroxilo de un determinado resto del aminoácido serina, lo que demuestra que ese grupo funcional es esencial para la catálisis. 2. INHIBICIÓN REVERSIBLE. Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se combinan con el enzima libre

sino con el complejo enzima- sustrato. Se distinguen tres tipos de inhibición reversible:  INHIBICIÓN COMPETITIVA: El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. El inhibidor forma con el enzima libre un complejo enzima-

inhibidor de características cinéticas análogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lógicamente, no puede descomponerse a continuación para dar lugar al enzima libre y a los productos:



NHIBICIÓN INCOMPETITIVA. El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unión al sustrato, sino que lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-sustrato- inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos. El inhibidor se coloca próximo al centro activo situado de tal manera que impide físicamente la salida de los productos:



INHIBICIÓN NO COMPETITIVA. El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzimasustrato, interfiriendo en la acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en el una alteración que dificulta bien la formación del complejo enzima-sustrato o bien la descomposición de éste para dar lugar a los productos. La unión con el inhibidor produce dos formas inactivas: los complejos EI y ESI, ninguna de las cuales puede descomponerse para dar lugar a los productos y al enzima libre:

(Nelson, D. & Cox, M.; 1992). REACTIVOS

1- Solución de almidón 2- Sulfato

de cobre 3- Cloruro de sodio 4- Lugol 5- Alfa amilasa

MATERIALES DE LABORATORIO 1. Tubos de ensayos 2. Gradilla 3. Pipetas serológicas 4. Pipetas automáticas 5. Auxiliares de pipeteo EQUIPOS DE LABORATORIO 1. Espectrofotómetro 2. Baño de María PRÁCTICA PROCEDIMIENTO (ACTIVIDADES POR DESARROLLAR/TÉCNICA OPERATORIA)

TUBOS

1

2

2.5 mL

ALMIDÓN 5%

2.5 mL

NaCl 1%

----

-----

CuSO4 1%

----

-----

3 2.5 mL

4 2.5 mL

50 μL ------

----50 μL

Mezclar bien – Calentar a baño de María a 37ºC por 5 min ENZIMA ALFA AMILASA

----

50 μL

50 μL

50 μL

Mezclar bien – Calentar a baño de María a 37ºC por 10 min Leer en Absorbancias 640 nm RESULTADOS OBTENIDOS

1

0,757

2 3 4

Blanco

0,378 0,252 0,733

Hallar % No Hidrolizado Tubo 2.

Tubo 3.

0,757 ------------ 100% 0,378 ------------ x x = 49,93%

0,757 ------------ 100% 0,252 ------------- x x = 33,28%

Tubo 4. 0,757 ------------ 100% 0,733-----------x x = 96,82%

Hallar % Hidrolizado Tubo 2. 100% − 49,93% = 50,07%  Actividad enzimática Tubo 3. 100% − 33,28%= 66,72%  Activador Tubo 4. 100% − 96,82%= 3,18%  Inhibidor

% de Activación: NaCl

% de Inhibición: CuSO4

50,07% ------------ 100% 66,72% ------------ x x = 133,25%

50,07% ------------ 100% 3,18%-----------x x = 6,27%

133,25% − 100% = 33,25% de Activación

100% − 6,27% = 93,73% de Inhibición

Foto donde se aprecia el final de la reacción debido a la coloración dada. CONCLUSIONES 1. Se experimentó el efecto de activación de los aniones cloruros obteniendo una reacción completa por la apreciación de color café debido al color de la solución de Lugol (por el yodo presente) ante la primera coloración y la inhibición de los iones cobre debido a que se observó que no hubo gran cambio del color de antes de la reacción y luego de la reacción en la actividad de la reacción catalizada por la enzima alfa amilasa. 2. Se determinó el porcentaje de almidón hidrolizado en el tubo 2 con 49,93%; el tubo 3 con 33,28% y en el tubo 4 con 96,82% que fue catalizado por la enzima alfa amilasa. 3. Se determinó el efecto de activación de los aniones cloruros en el tubo 3 con un porcentaje de 33,25% de activación y el efecto de la inhibición de los iones cobre en el tubo 4 con un porcentaje de 93,73% de inhibición sobre la reacción catalizada por la enzima alfa amilasa. 4. El cobre se establece como inhibidor irreversible, ya que reacciona con el grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente e impidiendo su actividad enzimática. RECOMENDACIONES 1. Lavar todos os materiales usados en la práctica, en especial, los tubos quitando perfectamente los restos de la muestra y el marcador con que se rotuló. 2. Llevar el control de tiempo cuando se coloque la muestra en Baño de María. 3. Encerar el Espectrofotómetro y colocar la medida de absorbancias que se refiere en la práctica. BIBLIOGRAFÍA  Arias, E. (2008) Introducción a la Bioquímica. Enzimología. Editorial Reverté S.A.  González, C. (2014) TEMA 14: ENZIMAS. Editorial Reverté S.A.  Nelson, D. & Cox, M. (1992). Capítulo 8 Enzimas cinética e inihibición. Principios de Bioquímica de Lehninger. 2ed. Madison, Wisconsin...