Informe de laboratorio ||mitosis en células de cebolla|| PDF

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Recibido 08 noviembre 2019 IDENTIFICACIÓN DE LAS FASES MITÓTICAS EN CÉLULAS DE ALLIUM CEPA Melo L, Ríos J Pontificia Universidad Javeriana Cali, Colombia Departamento de Ingeniería y Ciencias Entregado: Jenny Johana Gallo RESUMEN. Todos los procesos que permiten la existencia y desarrollo de la vida...

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Recibido 08 noviembre 2019

IDENTIFICACIÓN DE LAS FASES MITÓTICAS EN CÉLULAS DE ALLIUM CEPA Melo L, Ríos J Pontificia Universidad Javeriana Cali, Colombia Departamento de Ingeniería y Ciencias Entregado: Jenny Johana Gallo RESUMEN. Todos los procesos que permiten la existencia y desarrollo de la vida se deben a la habilidad de las células de transmitir y conservar la información genética completa en células hijas en cada generación, permitiendo así la subsistencia de todos los seres vivos. En el laboratorio se identificaron las fases mitóticas de células de tejido apical de Allium cepa o cebolla común, explicitando las diferencias y características en cada fase. Con el empleo del microscopio óptico y la tinción del ADN fue posible distinguir los estados propios de replicación, migración y separación mitótica comprendiendo que es un proceso continuo en todas las células eucariotas. INTRODUCCIÓN Por ciclo celular se comprende a la serie de procesos bioquímicos y funcionales que tienen lugar en todas las células y que comprende un amplio espectro evolutivo que ha permitido la formación y proliferación de la vida, gracias a que todas las células son capaces de duplicar su información genética y transmitir esa información a sus células hijas con el fin de permitir el crecimiento celular y la supervivencia de las especies. Una célula se reproduce siguiendo una secuencia ordenada de eventos en donde se duplica todo su contenido y luego la célula se divide en dos, este ciclo de duplicación y división se conoce Ciclo Celular, que es el mecanismo esencial donde todo lo que se considere vivo se reproduce mediante este mecanismo esencial.(1) (Alberts, 2015). Aunque la división celular ocurre en todos los organismos, ésta se lleva a cabo de manera levemente diferente en procariotas y eucariotas (2) (Karp, 2008) pero los mecanismos que operan en la división celular poseen características muy similares e incluso universales. Cuando se refiere a reproducción no sexual de los organismos eucariotas, se relaciona con un proceso similar a la escisión binaria de los procariotas pero en este caso se trata de organismos con un contenido genómico en mayor proporción y con la diferencia de que las células eucariotas pueden formar un ser pluricelular completo, siendo este caso de reproducción llamado mitosis.(3) (Gallori). donde el número de cromosomas presentes en la célula se duplica (pasa de 2n a 4n) pasando de una sola célula a producir dos con el mismo contenido de cromosomas. De acuerdo con las fases visibles en el microscopio óptico, los ciclos de división celular se dividen en dos prominentes fases: la fase M y la interfase (entre fases) donde se diferencian visualmente los estados de replicación. (4) (Cooper y Hausman, 2017).

Figura 1. Ciclo Celular (1) Durante el ciclo celular tienen lugar dos sucesos clave: 1. Se duplica el material genético en los cromosomas y 2. Ocurre el reparto de cromosomas a las dos células hijas y se separan (5) (Freeman, 2009). Es decir que la fase M incluye el proceso de mitosis (duplicación) y la citocinesis cuando ya la célula se escinde en dos para finalmente formar dos células idénticas, mientras que la Interfase es el periodo entre las divisiones celulares con mayor duración ya que es el periodo donde la célula comienza a crecer y duplicar sus organelos manteniendo la mayor parte del tiempo preparándose para la fase posterior (2). El 95 % del ciclo celular ocurre en la interfase que es donde los cromosomas se descondensan y se distribuyen por todo el núcleo presentando visiblemente un aspecto uniforme (4). Como la interfase demanda mayor tiempo para la célula (1), entonces se dividirá la interfase en tres fases críticas: 𝐺1 , 𝑆 𝑦 𝐺2 . En la fase 𝐺1, la célula monitorea las condiciones exteriores para comenzar a crecer, luego de terminar la fase 𝐺1, comienza la fase crítica denominada 𝑆 que es el periodo en que la célula replica el número de cromosomas y una vez finalizada la síntesis del ADN, la célula entra en la fase 𝐺2 en la que se sintetizan las proteínas en preparación para la mitosis (4). Una vez completada la interfase, viene la fase M donde las cromátidas hermanas son separadas y distribuidas a un par de núcleos idénticos donde cada uno tendrá su propia copia del genoma (1). En la fase M, se proceden cinco fases de acuerdo con el comportamiento de los cromosomas que se visualiza en la célula: Profase, Prometafase, Metafase, Anafase y Telofase (6) (Khan Academy, 2019). Al estudiarse la fase M de acuerdo con el comportamiento de los cromosomas, es meritorio mencionar que esta fase es la que permite distinguir definitivamente si una célula está entrando en mitosis. MATERIALES Y MÉTODOS Para la identificación de las fases mitóticas en células apicales de Allium cepa, se utilizaron tres placas de corte lateral y una placa de corte polar proporcionadas por el laboratorio con el fin de determinar la migración del ADN visiblemente, para la cual fue necesario disponer de muestras ya teñidas con el método Feulgen que le confieren coloración al contenido genómico de la célula. La visualización de cada muestra se determinó con el modelo de microscopio óptico Dm750 (Leica) observando cada placa por aproximadamente 10 minutos. Cada placa individual fue analizada con los tres objetivos de 10x, 40x y 100x, utilizando para el último aceite de inmersión. Adicionalmente, se determinó el Índice Mitótico (IM) con el objetivo de observación de 40x en la placa de corte lateral registrando las diferencias entre células en estado de mitosis y aquellas en las que no se presentaban los estados de división.

RESULTADOS Corte Lateral: 10x

Figura 2. Corte lateral de Allium cepa

En el corte lateral se pueden observar las fases de mitosis ya que se está identificando cada célula desde un perfil de referencia y por ende es posible evidenciar como ocurre el proceso de divisón con mayor detalle. Profase: 100x

Figura 3. Corte lateral de Allium cepa

En la figura 3 se evidencia el inicio de la condensación del material cromosomico, debido a la agrupación preeliminar y el desvanecimiento de la membrana nuclear, es posible además notar como en la célula se forman puntos o pequeñas agrupaciones de cromososmas que dan indicio de una pronta preparación para la profase.

Metafase: 40x

Figura 4. Corte lateral de Allium cepa

Se observa que en la figura 4, los cromosomas han tomado una posición en la placa metafásica o línea ecuatorial de la célula.

Anafase: 40x

Figura 5. Corte lateral de Allium cepa

Los cromosomas (rosa) se separan y migran hacia los polos de la célula permitiendo que los microtúbulos se acorten arrastrando consigo las cromátidas (3) a las que estén unidos, se pudo identificar la anafase mediante la forma en que se ven alejados los núcleos sin poseer su forma definitiva de núcleo.

Telofase: 40x

Figura 6. Corte lateral de Allium cepa

Los cromosomas se agrupan conjuntamente en cada núcleo cellular ya que se descondensan y se comienza a formar una barrera o pared celular entre los dos nuevos núcleos, se puede ver cómo las dos células comienzan a reorganizer sus cromosomas y a juntarse. Por tanto, las células mostradas están preparadas para la fase final de separación. Índice Mitótico: 40x

Figura 7. Corte lateral de Allium cepa

El índice Mitótico se calculó determinando la relación entre células en estado de division y el número de células totales en un campo visual estático a 40x. IM =

Células en estado de mitosis Células totales

=

8

90

= 0.089

Corte polar: 10x

Figura 8. Corte polar de Allium cepa

Cuando se observó la placa con corte polar, no fue posible identificar completamente las fases de divisón mitótica ya que desde ese ángulo no se pueden diferenciar los husos mitóticos o la migración de los cromosomas puesto que todo el proceso se observa superpuesto. DISCUSIÓN Desde el descubrimiento de la mitosis en la época de 1870, por Flemming y Strasburguer en células animales y vegetales, la cantidad de estudios que se han desarrollado sobre la fase de división del núcleo dentro del ciclo celular aumentó exponencialmente (7). Esto, a razón de su rol indispensable para el crecimiento de organismos multicelulares, la reparación de celular mediante la generación constante de células que reemplazan a otras, y estabilidad genómica, en donde mediante la mitosis una célula logra distribuir equitativamente el material genético duplicado entre las células hijas, manteniendo la integridad del genoma en este proceso de propagación, pues se asegura que el ADN esté replicado solo una vez sin ningún error, y que los cromosomas replicados sean repartidos de manera precisa en el procedimiento de división celular (8) (9). Para cumplir tales funciones, la mitosis cuenta con una serie de fases que fueron evidenciadas en los resultados, las cuales representan el desarrollo de la división nuclear. En primer lugar, se retoma la profase, que como bien se observó en la figura 3. se caracteriza por el inicio de la condensación del material cromosómico, que conlleva a la formación de estructuras en forma de varilla. Por otro lado, se da la construcción del huso mitótico y en la finalización de la fase, microtúbulos altamente dinámicos se organizan alrededor de los cromosomas, para dirigir la migración de los centrosomas a lados opuestos de la célula, anclando tales centrosomas a la membrana plasmática e iniciando el proceso de captura de cromosomas. Adicionalmente, al finalizar la profase, al ser vista debajo de un microscopio, no se observa aparato de Golgi, retículo endoplasmático, nucléolo o membrana nuclear visible (9) (14).

Así pues, con la desintegración de la membrana nuclear inicia la siguiente etapa, la metafase, en donde al estar completa la condensación de los cromosomas, estos pueden ser observados claramente desde el microscopio compuestos de dos cromátidas unidas por el centrómero. Asimismo, en el centrómero se encuentran estructuras proteicas en forma de disco llamadas cinetocoros, que sirven como sitios de unión de las fibras del huso y los cromosomas que son movidos al centro de la célula. Por lo tanto, visualmente como se pudo observar en la figura 4. la metafase se caracteriza por la posición de los cromosomas en la placa metafásica o línea ecuatorial, con una cromátida de cada cromosoma conectada por su cinetocoro a las fibras del huso de polos opuestos (14). En tercer lugar, dentro de anafase cada cromosoma en la placa metafásica se divide simultáneamente, y las dos cromátidas hermanas se convierten en los cromosomas de la futura célula hija. Así pues, se observa como en la figura 5. cada cromosoma se aleja de la línea ecuatorial, ya que el centrómero de cada cromosoma es atraído hacia los polos en cada extremo, donde los brazos del cromosoma son arrastrados. En cuarto lugar, en la última etapa de la mitosis, la telofase, los cromosomas que ya han alcanzado sus respectivos polos, se descondensan perdiendo su individualidad, por ende, se observa en la figura 6. que ya no se evidencian cromosomas individuales, ya que el material cromático se recolecta en una masa en cada uno de los dos polos. De esta manera, la membrana nuclear se vuelve a ensamblar alrededor del cúmulo de cromosomas, y se reforman organelos como el nucleolo, el aparato de golgi y el retículo endoplasmático. Seguido a esto se da el proceso de separación física de la célula o la citocinesis, con la formación de una nueva pared celular en las plantas, y la distribución equitativa de organelas como mitocondrias y plastidios (9) (14). Ahora bien, en la mitosis pueden presentarse una serie de alteraciones, ya sea por fallos en la célula o por la administración artificial de sustancias externas. Respecto a alteraciones naturales, la más común es la endorreduplicación, que consiste en dos o más rondas de síntesis de ADN sin pasar por un periodo mitótico intermedio, un caso extremo es la politenia, que da lugar a cromosomas gigantes o politénicos, a causa de una modificación en el comportamiento cromosómico en relación a un proceso de citodiferenciación (10). Por otro lado, dentro de las alteraciones por implementación de sustancias externas, se refiere a la cafeína y la colchicina, la primera es un alcaloide del grupo de las xantinas que con una concentración del 0,1% por una hora, inhibe la formación del fragmoplasto o tabique de separación celular, por lo que no se produce la citocinesis y los dos núcleos permanecen separados pero dentro del mismo citoplasma, generando una célula binucleada, que en la siguiente división entra en proceso denominado Bi-mitosis (11). En este proceso, los dos núcleos entran de nuevo en mitosis y se pueden ver las biprofases, bimetafases, bianafases y bitelofases (Fig 9.). De esta manera, esta sustancia se utiliza para estudiar controles del ciclo celular y para determinaciones de la duración del ciclo (12).

Figura 9. (3) Fases de la Bi-Mitosis En relación a la colchicina, es un alcaloide que se encuentra en plantas, el cual fue estudiado por Taylor (13), donde descubrió que una célula expuesta a una concentración de 10-7 M de esta sustancia por un margen de tiempo de 6 a 8 horas, provocaría la inhibición en la formación del huso acromático. Por lo tanto, al llegar a metafase los cromosomas están muy condensados y con los cromatidios separados y en forma de "X", ya que las cromátidas sólo aparecen unidas por la región del centrómero. Así pues, los cromosomas aparecen perfectamente individualizados y se puede apreciar perfectamente su forma, y número, por lo que representa un uso en investigación al resaltar la forma cromosómica y facilitar el conteo del número cromosómico de una célula (12).

Figura 10. (3) Efecto de la Colchicina Por último, cabe resaltar que una técnica relevante para la identificación de fases mitóticas, fue el tipo de tinción usado. En este caso, se usó la tinción de Feulgen, la cual es reconocida por permitir la visualización de ADN en el núcleo de las células, con una coloración de los núcleos de color magenta. De esta manera, se tiñen o visualizan los núcleos de las células en interfase y tiñe los cromosomas de las células en división, mediante una reacción, en la que se somete el tejido a una hidrólisis suave con ácido clorhídrico (HCl) que extrae los ARN y las bases púricas del ADN. El HCl produce la apertura de los anillos de las desoxirribosas y, al reaccionar con éstas, origina grupos aldehído. Luego se incuba el tejido con el reactivo de Schiff (fucsina básica decolorada) y éste adquiere el típico color magenta en presencia de los grupos aldehído que se formaron a partir de las desoxirribosas del ADN (15).

LISTA DE REFERENCIAS (1) Alberts, B. (2015). Molecular biology of the cell. 5 ed. New York, NY: Garland Science, pp.964-966. (2) Karp, G. (2008). Cell and molecular biology. 5 ed. Chichester: Javier León, p.570. (3) Gallori, E. (s.f.). Atlante Illustrato di genetica. Florencia: Giunti Editores, p.58 (4) Cooper, G. y Hausman, R. (2017). La célula. 7 ed. Madrid: Marbán, p.592. (5) Freeman, S. (2009). Biología (3 ed.). Madrid: Pearson Educación, S.A, p.225 (6) Khan Academy.(2019). Fases de la mitosis. [internet] Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/mitosis/a/phases-ofmitosis [citado 04 Nov. 2019]. (7) Omelyanchuk LV, Trunova SA, Lebedeva LI, Fedorova SA. Mitosis: Regulation and organization of cell division. Russian Journal of Genetics. 2004; 40(3): 1313-1330. 10.1007/s11177-005-0050-8. (8) Novák B, Heldt FS, Tyson JJ. Genome stability during cell proliferation: A systems analysis of the molecular mechanisms controlling progression through the eukaryotic cell cycle. Current Opinion in Systems Biology. 2018; 9: 22-31. (9) Ferrari S, Gentili C. Maintaining Genome Stability in Defiance of Mitotic DNA Damage. Front Genet. 2016;7:128. doi:10.3389/fgene.2016.00128. (10) Lacadena JR. Citogenética. 1ra ed. Madrid: Editorial Complutense S.A; 1996 (11) Mirela C. Study of plant mitosis from radicular meristematic cells in normal and experimental conditions. Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies; 2008, 65: 1-2. (12) UCM. La mitosis [Internet]. [Consultado 3 nov 2019]. Disponible en: https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/05-La%20Mitosis.pdf (13) Taylor EW. The mechanism of colchicine inhibition of mitosis. The Journal of Cell Biology; 1965, 25: 145- 160. (14) NCERT. Cell cycle and cell division [Internet]. [Citado 02 nov 2019]. Disponible en: http://www.ncert.nic.in/html/learning_basket/biology/cc&cd.pdf (15) Brusco HA, López JJ, Loidl CF. Histología médico-práctica. 1ra ed. España: Editorial Elsevier; 2014....