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Laboratorios Virtuales Bioquímica para Bioquímica 251.402 – II Semestre

INFORME DE LABORATORIO N°4 Inducción de la expresión y purificación de proteínas

Nombre estudiantes: Felipe Gálvez y Alex Díaz Nombre Profesor: Andrea Beyer Fecha de entrega: lunes 14 de diciembre

Introducción (10 puntos) La purificación de proteínas y las técnicas de separación son de gran importancia en los avances del área de las ciencias biológicas y biotecnologías, puesto que nos entregan información de la función que estas proteínas poseen en las células, ya sea estructurales, enzimáticas, de transporte, entre otras. La purificación de proteínas consiste en el aislamiento de una proteína dada, libre de todas las demás biomoléculas que conforman una mezcla de componentes. (Walls D., et al. 2011) [1] Los métodos de purificación varían de una proteína a otra, lo que hace imposible diseñar una estrategia de purificación general válida para todas las proteínas, es así como existen diferentes métodos de purificación. Las técnicas de purificación se basan en las propiedades físicas y químicas de estas moléculas e implican la separación de una proteína de una mezcla de moléculas con características similares donde la proteína de interés constituye una mínima fracción. Estas metodologías aprovechan las múltiples características que diferencian a una proteína de otras uniéndolas de forma específica o separándolas de los demás componentes de una mezcla, estas características pueden ser como su tamaño, forma, masa molar, carga neta, punto isoeléctrico, hidrofobicidad, su interacción con iones metálicos, solubilidad, termorresistencia entre otras. Las técnicas que se utilizan para separar y purificar proteínas pueden ser de precipitación, adsorción, electroforéticas y cromatográficas, cada una de ellas se elige de acuerdo con las características y propiedades que posee la proteína que se desee purificar. (Janson, et al. 2011) [2] La cromatografía que utilizaremos será la cromatografía de afinidad, la cual se basa en las propiedades entre las proteínas y los ligandos. La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad específica de enlace hacia las moléculas blanco que en nuestro caso será la proteína de interés a purificar, y después de lavar el material no unido, la unión entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean removidas en forma activa, es decir desplazando la proteína de la columna permitiendo así su recuperación. (Romero, et al. 2002) [3] Actualmente se cuentan con un gran número de técnicas de separación y purificación de proteínas, pero el problema real y limitante es conocer que técnica utilizar en base a la proteína de interés a purificar. Es por eso que es necesario conocer y tener controladas las condiciones de extracción de la proteína del medio donde se encuentra (intracelular o extracelular) y una vez que se extrajo la proteína mantener las condiciones adecuadas para conservar su funcionalidad, purificación y rendimiento final. Objetivos (5 puntos) ❖ Comprender los fundamentos de variados métodos de purificación de proteínas. ❖ Conocer y aprender el procedimiento de purificación de proteínas con epítope His-Tag ❖ Aislar y purificar una proteína problema mediante el software ProtLab. ❖ Utilizar las características físicas y químicas de una proteína para su purificación

Materiales y Métodos (10 puntos) ❖ Purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad Para realizar esta actividad se debió ingresar a un video educativo creado por el departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Concepción, disponible en https://vimeo.com/483690684/c1b3b832b4. Se requiere un cultivo de células transformantes con un plásmido que exprese la proteína fluorescente con epitope 6- His. Se realizó un tratamiento de inducción de la expresión de la proteína de interés con IPTG. Para lisar las bacterias, se centrifugaron a baja velocidad y el pellet bacteriano se resuspendió en buffer de lisis. Se incubó con lisozima en hielo durante 20 minutos. Posteriormente se sonicó la muestra con 4 pulsos de 10 segundos y descansos intermedios. Luego se centrifugó y recuperó el sobrenadante soluble, almacenada a 4°C. Para cargar la columna cromatográfica, se agrega a la muestra Ni-NTA y se incuba a 4°C con rotación. Posteriormente se recupera la resina unida a la proteína por centrifugación, se elimina el sobrenadante y se lava con buffer de lavado. Luego, para recuperar la resina, se centrifuga separando el sobrenadante sin descartarlo. Para eluir nuestra proteína de interés, se agrega buffer de elución incubando unos minutos con rotación. Finalmente, se centrifugó el tubo, recuperando el sobrenadante con nuestra proteína purificada. Para evaluar la pureza de nuestra proteína se debió utilizar PAGE y Western Blot. ❖ Purificación de la proteína 20 mediante el software ProtLab Para realizar esta actividad se utilizó el software Protein Purification desarrollado por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Leeds el cual se encuentra disponible en http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=es. Se seleccionó la proteína 20 de una mezcla por defecto, estable a temperaturas de 60°C y pH entre 4 y 11.5. En primer lugar, se aplicó un tratamiento con calor a una temperatura de 60°C durante un tiempo de 60 minutos. Posteriormente, se realizó una separación en una columna de intercambio iónico con medio DEAE-Celulosa utilizando como método de elución un gradiente de sal (0.0-5.0 M) en presencia de un buffer de pH 6.6. Se combinaron las fracciones entre 40-53 obtenidas a partir de la cromatografía, confirmando la presencia de la proteína 20 mediante un ensayo enzimático. Finalmente, se obtuvo una proteína purificada con un rendimiento del 99.9%.

Resultados (15 puntos) Actividad 1: Inducción de la expresión proteica en bacterias E. coli. 1.1. Realice un esquema mostrando el mecanismo de acción del IPTG sobre la inducción de la expresión de la proteína de interés.

Esquema 1: A) Bloqueo de la transcripción. B) Mecanismo del IPTG como inductor de la transcripción. 1.2. Caso: Usted necesita purificar la enzima Poi1 para hacer ensayos in vitro y poder caracterizarla. Al revisar la base de datos de plásmidos encuentra dos vectores de expresión de Poi1 en fusión con un epítope His-Tag: pQE-80L/Poi1 y pBADHisC/Poi1. Usted toma el plásmido pBAD-HisC/Poi1, transforma bacterias E. coli BL-21 con este plásmido e induce la expresión de Poi1 tratando el cultivo con 5mM IPTG por 3 horas. Tras realizar el protocolo de purificación por cromatografía de afinidad utilizando una resina Ni-NTA se percata de que no obtuvo su proteína. Explique por qué no obtuvo la proteína Poi1. Fundamente su respuesta y explique qué haría para solucionar este problema. No se obtuvo la proteína a purificar porque no se unieron correctamente los residuos de histidina a la resina NI-NTA, esto pudo ser a causa de no utilizar un PH adecuado de acuerdo a las características de nuestra proteína a purificar, porque los residuos de histidinas funcionan a un pH óptimo que permite la union a la resina. Otra posible causa puede ser no haber utilizado la concentración salina adecuada, lo que nos pudo modificar la carga lo que no nos sirve para unir los residuos de histidina a la resina. Las soluciones serias trabajar con un pH y concentración salina adecuados de acuerdo a las características de nuestra proteína para asegurarnos que la proteína tenga la carga y conformación que nos sirve para poder purificarla

Actividad 2: Purificación de una proteína por cromatografía de afinidad 2.1. A continuación, se presenta la composición de los buffers usados en el protocolo mostrado. Revise la composición de cada buffer y a partir de ello justifique porqué se usan en cada una de las etapas del procedimiento. Buffer de lisis: 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1 mM PMSF

Buffer de lavado: 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM Imidazol 1 mM PMSF

Buffer de elución: 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 250 mM Imidazol 1 mM PMSF

Buffer de lisis: es para que las proteínas se mantengan intactas cuando se rompe la membrana de la célula y se liberen estas Buffer de lavado: es para lavar la resina eliminando los componentes unidos inespecíficamente a la resina. Tambien es para estabilizar la columna obteniendo un medio adecuado para que la proteina especifica con los residuos de histidina se una a la resina Buffer de elución: este buffer contiene mayor concentración de Imidazol, porque este se une a la resina con la función de desplazar a la proteína; es asi que este buffer sirve para romper la interacción de la proteína especifica con la resina al actuar el imidazol como inhibidor competitivo Indique la función del PMSF: es un inhibidor de serín-proteasas, es decir, preserva a las proteínas celulares de una digestión con proteasas como por ejemplo en una preparación de lisados celulares 2.2. Describa cómo se llevó a cabo el proceso de lisis bacteriana. Indique los reactivos y/o técnicas utilizadas y mencione el mecanismo de acción de cada uno de ellos. Para comenzar con la lisis las bacterias se centrifugan a baja velocidad y el pellet bacteriano se resuspendió en buffer de lisis (este buffer no debe contener detergentes ni agentes caotrópicos) y luego incubado por 20 min en hielo con lisozimas para romper la pared celular. Posteriormente se lisan las bacterias utilizando un sonicador donde se usan ondas sónicas de alta frecuencia para romper la célula manteniendo las proteínas en su estado nativo. Para utilizar el sonicador se debe acomodar el tubo que contiene las bacterias en hielo e introducir el vástago del sonicador en la suspensión sin tocar ninguna pared del tubo, así evitaremos la generación de burbujas que pueden causar la desnaturalización de las proteínas, luego se dan 4 pulsos de 10 segundos descansando entre ellos para evitar el sobrecalentamiento de la muestra. Para finalizar la lisis bacteriana la muestra es centrifugada y se recupera la fase soluble que debe ser almacenada siempre a 4° C.

2.3. A continuación, se presentan en desorden los pasos del protocolo “purificación de proteínas usando una resina Ni-NTA”. Indique el orden correcto en que estos pasos deben ser llevados a cabo. 1. Inducir la expresión de la proteína de interés, agregando 100uL de una solución de IPTG 100 mM a un cultivo bacteriano transformado con el plásmido de interés 2. Colectar las bacterias centrifugando a 5000 rpm por 10 minutos. 3. Resuspender el pellet bacteriano en 1mL de Buffer de lisis y transferir la suspensión a un tubo eppendorf de 2mL. 4. Agregar 15uL de Lisozima (100 mg/mL), mezclar por agitación e incubar en hielo por 20 minutos. 5. Sonicar cuatro veces con pulsos de 10 segundos, con intervalos de 30 segundos de descanso, manteniendo la suspensión en hielo durante todo el procedimiento. 6. Centrifugar a 13000 rpm a 4°C por 10 minutos y recuperar el sobrenadante, traspasándolo a un tubo eppendorf nuevo de 1,6mL. 7. Agregar al sobrenadante 100uL de la suspensión de resina Ni-NTA equilibrada previamente con buffer de lavado. Incubar con rotación a 4°C por al menos 20 minutos. 8. Centrifugar a 13000 rpm por 30 segundos y descartar el sobrenadante, cuidando no eliminar resina, ya que la proteína de interés se encuentra unida a ésta (puede guardar el sobrenadante para su posterior análisis ya que éste corresponde a la fracción no unida). 9. Lavar la resina agregando 1mL de buffer de lavado y mezclando por agitación suave. 10. Centrifugar a 13000 rpm por 30 segundos, descartar el sobrenadante y recuperar la resina para proceder con la elución. y crecido a una OD600 de 0,6. Incubar con agitación a 37°C por 4 horas. 11. Agregar a la resina 100uL de Buffer de elución y mezclar suavemente por rotación a 4°C por 5 minutos. 12. Centrifugar por 30 segundos a 13000 rpm, recuperar el sobrenadante y almacenar la proteína purificada a -80°C. 2.4. Caso: Se realiza el procedimiento anteriormente descrito para purificar la proteína Poi1. Al finalizar la purificación usted mide la absorbancia a 280nm de la fracción no unida, el eluato y la resina, para determinar la efectividad del procedimiento. A280 F. No unida 0.131 Eluato 0.025 Resina 3.428 Explique qué significan los resultados obtenidos y explique las posibles causas. Según los resultados obtenidos observamos que la proteína se encuentra más concentrada en la resina no logrando soltarse con el buffer de elusión de la resina. Las posibles causas podrían deberse principalmente a la composición del buffer de elusión, el cual puede estar mal preparado con respecto a las concentraciones o puede estar fuera de la fecha de caducidad. Otra importante posible causa puede ser la concentración del eluyente que en este caso utilizamos imidazol, como solución podríamos aumentar su concentración.

Actividad 3: Purificación de una proteína problema Resuelva la actividad usando el simulador (http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=es)

“Purificación

de

proteína”

Proteína seleccionada: 20 Termoestabilidad: hasta 60°C durante varias horas. pH: estable a valores entre 4 y 11.5 Imagen de los procedimientos realizados:

Figura 1: Izquierda: PAGE en una dimensión en distintas etapas de la purificación. A) Mezcla por defecto inicial de la proteína 20. B) Posterior al tratamiento por calor a 60°C durante 60 minutos. C) Resultado posterior a la elución por cromatografía de intercambio iónico – DEAE-Celulosa. Derecha: Western Blot con uso de anticuerpo anti-proteina 20, indicando un peso molecular de aproximadamente 60.000Da de nuestra proteína de interés.

Figura 2: Cuantificación espectrofotométrica a 280 nm, posterior a la cromatografía de intercambio iónico – DEAE-Celulosa. En base a la actividad enzimática, se evidencia la presencia de la proteína 20 entre las fracciones 40-55 aproximadamente.

Figura 3: PAGE en una dimensión en donde se evidencia que la proteína 20 se encuentra entre las fracciones 40-53. Se combinan las fracciones para finalizar con la cuantificación.

Figura 4: Etapas del procedimiento de purificación: 1) Tratamiento por calor a 60°C durante 60 minutos. 2) Cromatografía de intercambio iónico en matriz DEAE-Celulosa con gradiente de sal (0.0 - 0.25) M y buffer a pH 6.5. Los resultados finales de la purificación de la proteína 20 indican un rendimiento del 99.9%. Se obtuvieron 18.5 mg de proteína total, con una cantidad de 5394U de enzima con un enriquecimiento de 27.7. Imagen del PAGE en dos dimensiones obtenido:

Figura 5: PAGE en dos dimensiones de las fracciones 40-53. Se observa una proteína de 60.000 Da aproximadamente, aislada con un punto isoeléctrico aproximado a pH 5.3.

Imagen del Western blot del PAGE en dos dimensiones obtenido:

Figura 6: Western blot del PAGE en dos dimensiones donde se confirma que la proteína purificada y aislada corresponde a la proteína 20.

Discusión y conclusión (10 puntos) ❖ Purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad. La purificación por afinidad con resina NI-NTA de proteínas marcadas con His es un procedimiento de unión-lavado-elución que se puede desarrollar en condiciones nativas o desnaturalizantes. La elección de purificar la proteína de interés en condiciones nativas o desnaturalizantes depende de la ubicación y solubilidad de la proteína, la accesibilidad de la etiqueta His y la aplicación que se quiere dar a la proteína purificada. Aquí se utilizará protocolos para la purificación de proteínas marcadas con His en condiciones nativas. como necesitamos que nuestra proteína este en su conformación nativa no utilizaremos agentes caotrópicos ni detergentes en nuestro buffer de lisis, porque si utilizamos agentes caotrópicos eliminaríamos la capa de solvatación de la proteína lo que nos provocaría la desnaturalización de la proteína, así mismo si usáramos detergentes en nuestro buffer de lisis obtendríamos el mismo resultado. (Spriestersbach,et al. 2015) [4] Con respecto al protocolo en si para obtener una eficiente purificación de proteínas es importante seguir las indicaciones de manera correcta, para así unir a la resina los residuos de histidina de las proteínas a purificar y al momento de lavar y eliminar todas las impurezas podamos obtener y soltar nuestra proteína de la resina. Para ello es sumamente importante tener la concentración suficiente de imidazol del buffer de elusión, puesto que si no alcanzamos la concentración adecuada puede que no podamos soltar la proteína de nuestra resina, ya que no podría actuar como inhibidor competitivo con respecto a los anillos de imidazol de los residuos de histidina que compiten por la unión a la resina y así no podríamos desplazar la proteína de la resina. Para obtener una purificación eficiente, aunque le echemos la cantidad adecuada de imidazol debemos tener en consideración tanto las características físicas como químicas de nuestra proteína ya que si no lo tenemos en cuenta no tendremos una correcta unión de nuestra proteína a la resina para su posterior obtención. (Torrejón, et al. 2020) [5] En fin, los protocolos de purificación de proteínas nos resultaron procedimientos bastantes sencillos de realizar y extremadamente robustos.

❖ Purificación de la proteína 20 mediante el software ProtLab. Se seleccionó como primer paso de purificación, un tratamiento con calor. Inicialmente sabíamos que la proteína de interés era estable a una temperatura de hasta 60°C durante varias horas sin perder la actividad enzimática. Por lo tanto, se aplicó la temperatura máxima permitida por la proteína durante 60 minutos. Este método de separación permite la denaturalización de las proteínas termolábiles interferentes en la mezcla. En la Figura 1B, podemos observar mediante PAGE la gran cantidad de proteínas interferentes separadas de nuestra proteína de interés posterior al tratamiento con calor, por lo que es un método de separación efectivo y económico. Como segunda técnica de separación, se utilizó cromatografía de intercambio iónico. Nuestra proteína de interés genera interacciones electrostáticas con los grupos cargados positivamente de la columna de dietilaminetilen-celulosa (DEAE-Celulosa), la cual contiene una amina terciara como grupo ionizable intercambiador de aniones. (Seehan, et al. 2001) [6]

Sabemos que nuestra proteína es estable a valor de pH entre 4 y 11.5, lo que indica que su punto isoeléctrico se encuentra dentro de este rango. Se estimó un pH de 6.6 utilizado en el buffer que permita que la carga neta de la proteína sea negativa y permita su unión a los grupos intercambiadores de aniones de la columna DEAE-Celulosa, prefiriendo como método de elusión un gradiente de sal (0.0 – 0.5)M (Seehan, et al. 2001). [6] Posteriormente a la electroforesis, se evaluó espectrofotométricamente a una absorbancia de 280 nm las fracciones obtenidas de la cromatografía. Mediante un ensayo de actividad enzimática es posible conocer en que rango de fracciones especifica se encuentra nuestra proteína de interés, encontrándose la proteína 20 efectivamente entre las fracciones 40-53. Se combinaron estas fracciones y se estudiaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en una dimensión. En la Figura 1C, podemos observar una única proteína separada en base a su peso molecular; y comparando con los marcadores de peso molecular conocido, se estima que es de aproximadamente 60.000 Da. Además, la presencia de la proteína 20 pudo ser confirmada mediante Western Blot utilizando anticuerpos anti-proteina 20. Como PAGE de una dimensión, solo permite la separación de proteínas en base a su peso molecular, utilizamos PAGE en dos dimensiones para utilizar el pH como segunda variable de separación. La mezcla se somete a una electroforesis a través de un gel en un gradiente de pH estable que aumente desde el ánodo al cátodo, y cada proteína migrará donde el pH coincida con su punto isoeléctrico. (Voet, 2007). [7] Mediante dos pasos de separación: tratamiento por calor y cromatografía de intercambio iónico, s...