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Cours de biologie cellulaires S5 de Bonod sur les microtubules...

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BIOLOGIE CELLULAIRE – BONOD CHA CHAPIT PIT PITRE RE 2 : LES MICROTUBULES

CHA CHAPI PI PITR TR TRE E 2 : LES MICROTUBULES 3 éléments composent le cytosquelette : microt • Les microt crotub ub ubule ule uless = dimères de tubuline – 25 nm, • Les fila filam ments in inter ter terméd méd médiai iai iaires res = monomères divers – 10 nm, • Les mi microf crof crofila ila ilame me ments nts = monomères d’actine – 8 nm. Le cytosquelette joue plusieurs rôles primordiales au sein d’une cellule : - Assure la forme et la structure de la cellule = charpente de la cellule : › Maintien de la cellule dans son environnement, › Maintien le positionnement des organites intracellulaires. - Assure la motricité : › De la cellule dans son environnement, › Des organites à l’intérieur de la cellule.

1. LES MIC MICROT ROT ROTUB UB UBULE ULE ULESS Les microtubules sont observables en microscopie à épifluorescence après à un marqu arquaage à im immu mu munof nof nofluor luor luores es escen cen cence ce : - Org Organi ani anisati sati sation on ra radial dial diale e → les microtubules partent tous d’un même point proche du noyau, le centro centroso so some me et rayonnent dans tous le cytoplasme de la cellule jusqu’à la membrane plasmique (point d’ancrage à la membrane plasmique) RQ : la forme de la cellule est moins visible avec les microtubules qu’avec les microfilaments d’actine. Les microtubules sont également observables en microscopie électronique à transmission : - Les microtubules sont creux à l’intérieur → ils forment des tubes de longueur variable (longueur suivant les besoins cellulaires), - Les microtubules sont associés à de nombreuses pro protéin téin téines es sstru tru tructu ctu ctural ral rales es et motr motrice ice icess. RQ : tout ce qui apparait clair en MET est de nature lipidique, et ce qui est foncée de nature protéique.

a. La tu tubu bu buline line Les microtubules sont des hétéro étérodim dim dimère ère èress formés par la polymérisation de deux protéines globulaires, la tubuli tubuline ne α et la tubu ubulin lin line e β, de poids moléculaire de 50 kDa chacune. Les deux sous-unités α et β diffèrent de quelques acides aminés (5 à 10%). Les deux sous-unités α et β présentent une structure secondaire formée d’hélice α et de feuillets β. Elles s’associent entre elles pour former une structure tertiaire puis une structure quaternaire qui correspond à la structure fonctionnelle. ①

Deux types de tubuline : α et β,

②

α et β s’associent en dimère par des liaisons non covalentes formation d’un hé hétéro téro térodi di dimè mè mère re re,

③

Association des hétérodimères pour former un pro protofi tofi tofilam lam lamen en entt,

④

Formation d’un microt icrotub ub ubule ule par l’association de 13 pro protofila tofila tofilame me ments nts ave avecc d déc éc écalag alag alage e→ dis dispos pos positio itio ition n héli hélicoï coï coïdal dal dale e.

Le diamètre d’un microtubule est invariable (25 nm), par contre la longueur s’adapte aux besoins de la cellule.

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BIOLOGIE CELLULAIRE – BONOD CHA CHAPIT PIT PITRE RE 2 : LES MICROTUBULES Les dimères de tubuline sont polar olarisé isé iséss : › Extrémité positi ositive ve = sous-unité β › Extrémité néga égativ tiv tive e = sous-unité α. La tubu tubulin lin line e peu peutt fix fixer er du GTP GTP/G /G /GDP DP DP. Le GTP se fixe au niveau d’une « poche » formée par la conformation de l’hétérodimère. › La sous-unité α fixe toujours du GTP, › La sous-unité β peut fixer du GTP ou du GDP. L’hydrolyse du GTP en GDP influence la stabilité du microtubule : GTP = stable / GDP = instable.

b. Poly Polymér mér mérisa isa isation tion – D Dép ép épolym olym olyméris éris érisati ati ation on Le microtubule est un assemblage très d dynam ynam ynamiqu iqu ique e et qui en plus d’être polar olarisé isé est ori orienté enté : › Extr Extrém ém émité ité ((– –) est poche du noyau et polymérise lentement, › Extr Extrém ém émité ité (+) est en périphérie de la cellule et polymérise rapidement.  Généralement le microtubule s’allonge de l’extrémité (+) vers l’extrémité (-). Etapes de la polymérisation : ① Nu Nucl cl cléati éati éation on : formation de l’hétérodimère (α + β) ② El Elon on ongatio gatio gation n (phase très rapide) : formation des microtubules ③ Eq Equili uili uilibr br bre e (phase très très rapide) L’assemblage des sous-unités α et β nécessite au moins 5 cof cofact act acteurs eurs (A à E) et pro protéin téin téines es chap chapero ero eronn nn nnes es. Chaque sousunité est prise en charge par un cofacteur différent → forme un complexe qui permet la synthèse de l’hétérodimère. L’hydrolyse du GTP en GDP sur β fournit l’énergie nécessaire à la formation de l’hétérodimère : formation d’un stock de dim dimère ère èress lilibres bres bres. Quand la concentration intracellulaire en GTP le permet, le GDP est remplacé par le GTP et les hétérodimères peuvent s’associer entre eux : la sous-unité α d’un dimère se lie à la sous-unité β du dimère précédent → induit l’hydrolyse du GTP porté par la sous-unité β du dimère précédent en GDP = activi activité té GAP (GTP (GTPas as ase e activa activatin tin tingg prote protein) in) de la soussous-u uni nité té α. L’hydrolyse du GTP est plus lente que la fixation d’un nouveau dimère → formation d’une coiffe de GTP GTP. Quand β est lié à du GTP, l’angle entre α et β est de 5° 5°. L’hydrolyse du GTP entraine un changement de conformation de l’hétérodimère : angle de 12 12°° → l’inclinaison des protofilaments conduit à une dépo dépoly ly lymér mér mérisat isat isation ion = CAT CATAS AS ASTR TR TROPH OPH OPHE E. La coiffe de GTP est très importante elle permet un allongement de la structure mais également de la stabilité. C’est la perte de la coiffe qui conduit au phénomène de catastrophe. Comme structure très dynamique, on a en permanence un échange GDP/GTP → succession de phases d’assemblage et de désassemblage. Catastrophe

Elongation = assemblage d’hétérodimères Raccourcissement = désassemblage

Sauvetage

Phénomène de ta tapi pi piss ro roula ula ulant nt : - Pol Polymé ymé yméris ris risatio atio ation n à l’l’extr extr extrém ém émité ité pos positiv itiv itive e, - Dép Dépoly oly olymé mé méris ris risatio atio ation n à l’e l’extr xtr xtrém ém émité ité nég négat at ative ive ive. Lorsque la concentration en tubuline est supérieure à la concentration critique, l’addition de dimère en (+) est plus rapide que la dépolymérisation en (-). On peut déstabiliser les microtubules et induire une dépolymérisation « artificielle » par la dilution, le froid ou par des drogues (col col colch ch chicin icin icine e et vinb inblas las lastine tine) qui bloquent la division cellulaire.

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c. Naiss Naissanc anc ancee ddes es micr microtu otu otubul bul bules es : cen centros tros trosom om omee Le cen centro tro troso so some me est le cen centre tre or organ gan ganisa isa isateu teu teurr d des es micr microtu otu otubu bu bules les les. C’est le site d’an d’ancr cr crage age et d de en nucl ucl ucléa éa éation tion des m micro icro icrotu tu tubu bu bules les les. Il est constitué de deux ce centri ntri ntriole ole oless positionnés perpendiculairement l’un à l’autre et situé à proximité du noyau. Les centrioles ont un diamètre = 2 µm et une longueur = 0,5 µm. Les microtubules se dispersent dans toute la cellule à partir du centrosome : extrémité (-) vers le noyau, extrémité (+) à la périphérie. Les centrioles sont entourés par du matériel amorphe : le maté matériel riel péric péricen en entriol triol triolai ai aire re PC PCM M → permet la formation de complexes protéiques (+ de 200 protéines) nécessaire à la polymérisation des microtubules. Parmi ces protéines, la γtubu tubulin lin line e, qui intervient dans la stabilisation de l’extrémité négative des microtubules. Cas particulier de microtubules non centrosomique : Exemple dans le neurone : - Dans les axones, les microtubules s’organisent autour de l’axone, - Dans les dendrites, les microtubules ne partent pas du centrosome et sont orientés dans les deux sens permettent uniquement de stabiliser les dendrites (n’interviennent pas dans la mobilité).

Exemple dans les microvillosités épithéliales : - Les cils sont stabilisés par les microtubules. - Le centrosome est décalé dans les cellules épithéliales pour permettre la formation des cils.

Tous les microtu microtubules bules non cen centro tro troso so somau mau mauxx pe peuve uve uvent nt su subir bir une pol polymé ymé yméris ris risatio atio ation n au auxx de deux ux extr extrém ém émités ités ités, contrairement au microtubules centrosomaux (uniquement extrémité (+)).

d. La γ-tu -tubu bu buline line La tub tubulin ulin uline e γ est extrêmement conservée entre les différentes espèces : tubuline γ humaine à 78% d’identité en acides aminés avec celle de la drosophile et 98% avec celle du xénope. C’est une protéine de 454 acides aminés. Elle est très différente des sous-unités α et β : 30% d’identité. Elle est indispensable pour la survie de l’individu. Elle joue un rôle dans la nuclé nucléati ati ation on en stabi stabilis lis lisant ant l’e l’extr xtr xtrém ém émité ité (-) : plus on rajoute de la tubuline γ, plus l’élon l’élongati gati gation on est rapi rapide de → elle augmente le nombre de microtubule et légèrement leur longueur. La tubuline γ s’associe avec d’autres protéines : Dgrip gripss 91, 884 4 (drosophila gamma ring protein) pour former le co comp mp mplex lex lexe e γ-Tu -TuSC SC (γ-tubulin small complex). γ-TuSC s’associe avec d’autres protéines Dgrips (163, 128, 75 et 71WD) pour former le complexe γ-Tu -TuR RC (γ-tubulin ring complex). γ-TuRC joue un rôle dans la nucléation pour permettre la formation des microtubules et un rôle de co coiffe iffe pour (-) protéger l’extr extr extrém ém émité ité des microtubules. Cette coiffe explique pourquoi il n’y a pas de polymérisation à l’extrémité (-) des microtubules centrosomaux.

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e. Mo Modèles dèles de ppoly oly olymér mér mérisa isa isation tion 2 modèles de polymérisation : • MO MODE DE DELE LE DU M MOU OU OULE LE : la polymérisation se fait sur le microtubule à partir d’une base, • MO MODE DE DELE LE DU PR PROT OT OTOFI OFI OFILA LA LAME ME MENT NT : la polymérisation se fait sur le protofilament.

f. Naissa aissanc nc ncee ddes es micro microtu tu tubul bul bules es : ccentr entr entriol iol ioles es Le centrosome comprend deux centrioles disposés perpendiculairement l’un à l’autre. Les centrioles sont composés chacun de 9 m micro icro icrotub tub tubule ule uless organisés en tripl triplets ets du centre (A) vers l’extérieur (microtubules B puis C). Le microtubules le incliné plus interne (A) et complet, les autres (B et C) non. Tous les triplets sont incliné inéss par rapport à l’axe du centriole. Pour maintenir les triplets entre eux, présence d’une liaison transversale entre le microtubule A et le microtubule C. Présence également de liaisons en rayon de roue à l’intérieur qui stabilisent le centriole.

Un centriole est plus jeune que l’autre : centriole père qui est immobile et un centriole fils qui est mobile.

2. LES PRO PROTEIN TEIN TEINES ES AS ASSOC SOC SOCIEE IEE IEESS AU AUX X MICR MICROT OT OTUB UB UBULES ULES : LLES ES MAP • • •

MA MAP P SSTR TR TRUCT UCT UCTUR UR URALE ALE ALESS : MAP de type I (1A, 1B, 1S) et de type II MA MAP PM MOTRICE OTRICE OTRICESS : Kinésine et dynéine +TIP +TIPss (+end tracking proteins) : MAP qui se fixent sur l’extrémité (+) des microtubules.

a. MAP sstructu tructu tructura ra rales les › ›

Les MAP de type I régulent la distance entre les microtubules. Les MAP de type II ou tau stabilisent les microtubules.

Les MA MAP Pd de e ttype ype I permettent de respecter un espacement correct entre les microtubules : - Domaine de liliaiso aiso aison n des mi micro cro crotub tub tubule ule uless = dom omain ain aine eM MTBD TBD, - Domaine (petit) d’inte inte intera ra ractio ctio ction n aavec vec l’a l’actin ctin ctine e. Ces MAP peuvent être clivées en une chaine lourde et une chaine légère. Elles ont été historiquement mises en évidence dans le cerveau. Les MA MAP Pd de e ttype ype II (MAP2, MAP4 et Tau) possèdent à leur extrémité C-term un domaine de liaiso iaison n aux mi microt crot crotub ub ubule ule uless. L’ARNm de MAP2 ainsi que la protéine MAP2 sont présent dans les dendrites et le corps cellulaire d es neurones, alors que les ARNm de Tau et de la tubuline sont uniquement présent dans le corps cellulaire, et que leur protéines s’expriment respectivement dans l’axone et dans tout le neurone. La proté protéin in ine e tau se fixe sur le côté du microtubule. Elle peut être phos phospho pho phorylé rylé rylée e : sa phosphorylation entraine son détachement du microtubule → le microtubule n’est plus stabilisé → dépolymérisation du microtubule → plus de transport axonal. La dég dégéné éné énéres res rescen cen cence ce des ne neuro uro urone ne ness + la formation de plaque sénile due à une trop forte agrégation de la protéine tau phosphorylée conduit à une mort neuronale, la maladie d’A Alzh lzheim eim eime er. 4

BIOLOGIE CELLULAIRE – BONOD CHA CHAPIT PIT PITRE RE 2 : LES MICROTUBULES Les MAP structurales sont là pour régu réguler ler la dép dépoly oly olymé mé méris ris risatio atio ation/ n/ n/stab stab stabili ili ilité té des micro microtub tub tubul ul ules es mais sans les figer. Elles permettent d’évit ’éviter er le p phé hé héno no nomè mè mène ne cata catastr str strop op ophe he he.

b. Les ++Tip Tip Tipss A l’extrémité (+) : protéine CLI CLIP-1 P-1 P-170 70 (cytoplasmic linker protein) de poids moléculaire de 170 kDa. CLIP-170 est observable en microscopie à fluorescence : - En augmentant la concentration de CLIP-70 on observe la formation d’un globule à l’extrémité (+) → montre que CLIP-70 se fixe bien à l’extrémité (+). CLIP-170 stab tabilis ilis ilise e le less m micro icro icrotu tu tubule bule buless et emp empêch êch êche e la ca catas tas tastr tr troph oph ophe e. Deux hypothèses de fixation : › Se fixe au bout et se déplace sur le microtubule, › Se fixe un peu plus loin de l’extrémité. CLIP-170 à un rôle dans les cellul cellules es en migr migratio atio ation n (lorsqu’une cellule se déplace elle prend une forme particulière en cône). La cellule se déplace grâce à l’actine (→ besoin d’un stock d’actine = actine corticale). CLIP-170 interagit à la fois avec les microtubules et l’actine pour permettre le déplacement des cellules. CLIP-170 à 3 grands rôles : • Ancr Ancrage age d des es micr microtu otu otub bules een np périp érip ériphér hér hérie ie d de e cellu cellule, le, • Rég Régul ul ulation ation de la dy dynam nam namiqu iqu ique e des mi microt crot crotub ub ubule ule ules, s, • Rég Régul ul ulation ation du mo mou uvem vemen en entt d d’org ’org ’organi ani anites tes imp impliq liq liqua ua uant nt lle e co complex mplex mplexe ed dyn yn ynéin éin éine/d e/d e/dyn yn ynactin actin actine. e. La stath tathmin min mine e est une protéine qui dés déstab tab tabilis ilis ilise e les m micro icro icrotu tu tubule bule buless. Elle se fixe le long des microtubules à l’extrémité (+). Elle augmente l’angle des protofilaments : elle a le même rôle que l’hydrolyse du GTP.

c. MAP mo motric tric trices es Les MAP motrices per permette mette mettent nt le tr transpo anspo ansport rt d’o d’org rg rganit anit anites es es. Elles sont également appelées mot oteurs eurs m mol ol olécul écul éculair air aires es es. 2 familles : les kinés kinésine ine iness et les dynéin dynéines es. Ces protéines tra transfo nsfo nsform rm rment ent l’éne l’énergi rgi rgie e issu issue e de l’hyd l’hydro ro rolyse lyse de l’AT l’ATP P en mouv mouvem em ement ent pour assu assure re rerr un dé dépla pla place ce cemen men mentt o orie rie rienté nté ntéss. Elles se composent de 2 chaines lourdes qui s’enroulent ensemble et de 2 chaines légères qui restent libres. Ces molécules sont orientées : - Les ch chain ain aines es lo lourd urd urdes es se ffixen ixen ixentt au m micro icro icrotubul tubul tubule e, ch lé se f au car - Les chain ain aines es légè gè gères res fixe ixe ixent nt cargo go (= élément à déplacer). La kin kinési ési ésine ne per permet met les dép déplace lace laceme me ments nts antéro antérograd grad grade e = de l’l’extr extr extrém ém émité ité (-) à l’e l’extré xtré xtrémi mi mité té (+) et la dyné dynéine ine les dépl déplace ace acements ments rétr rétrogr ogr ograde ade = de l’l’ex ex extré tré trémi mi mité té (+) à l’e l’extr xtr xtrémi émi émité té ((-) -) -). La kin kinésin ésin ésine e : 100 types issus de 14 familles, la kinésine-1 est la plus conventionnelle. 3 parties : Stal Stalkk ou dom domain ain aine e co coile ile iled-c d-c d-coil oil = zone d’enroulement des chaines lourdes, Dom Domaine aine m moteur oteur ou têt tête e gl glob ob obulai ulai ulaire re = extrémités séparées des chaines lourdes, Qu Queue eue = chaines légères. Selon la famille, les kinésines ont toutes la même structure (tête, stalk, queue) mais de longueur différente. C’est la sous-unité β qui est concernée par le déplacement. En absence d’ATP, une des deux tête globulaire est liée à la sous-unité β d’un microtubules. La fixation d’ATP induit un changement de conformation au niveau des linker à l’origine d’un mouvement de semi-rotation vers l’avant de la seconde extrémité de la chaine lourde qui se lie à la prochaine sous-unité β. On est alors dans un état de transition où les deux extrémités lourdes sont fixées au microtubule. L’hydrolyse de l’ATP de l’extrémité arrière lui confère l’énergie suffisante pour repasser à l’avant par un changement de conformation. 5

BIOLOGIE CELLULAIRE – BONOD CHA CHAPIT PIT PITRE RE 2 : LES MICROTUBULES

La dynéin dynéine e est un complexe multiprotéique : 2 chaines lourdes + 2 chaines intermédiaires + 8 chaines légères, organisée en 3 parties : tête + stalk (court) + queue. C’est une protéine qui est difficile à manipuler.

Différents domaines de la dynéine : - Domaine de fi fixati xati xation on au mi micro cro crotubu tubu tubule le - Domaine catalytique : site d d’hyd ’hyd ’hydrol rol rolyse yse d de e l’A l’ATP TP - Con Contre tre trefor for fortt et tige (stalk) : connecte le domaine de fixation au microtubule au ring - Link Linker er (élément mécanique) Le domaine de fixation au microtubule est situé à l’opposé du domaine catalytique → la transmission de l’information passer par un chan changem gem gement ent de co conf nf nform orm ormat at ation ion d du u link linker er er. À la suite de l’hydrolyse de l’ATP, le linker change sa position sur le ring ce qui entraine un changement de conformation du contrefort et de la tige à l’origine du déplacement de la dynéine sur le microtubule.

Pour pouvoir fixer un cargo la dynéine doit se lier avec une autre protéine, la dyn dynact act actine ine ine. La dynéine interagit via ses glued d cha chaine ine iness in inter ter terméd méd médiaires iaires avec la sous-unit -unit -unité é PP15 15 150 0glue de la dynactine. 3. LE LESS DI DIFFE FFE FFEREN REN RENTS TS ROLE ROLESS DE DESS MI MICRO CRO CROTUBULE TUBULE TUBULESS

a. Le tra transpor nspor nsportt nneuron euron euronal al La communication entre cellules se fait grâce à l’expulsion et l’intégration de vésicules synaptiques. Selon leur contenu, ces vésicules auront : › Un déplacement ant antéro éro érograde grade (-) → (+) : déplacement grâce à la kinés kinésin in ine e (pour les orga organit nit nites es et les neu neuro ro rotran tran transm sm smette ette etteur ur urss), › Un déplacement rétro rétrogr gr grade ade (+) → (-) : déplacement grâce à la dynéi dynéine ne (pour les hormo hormones nes de croiss croissan an ance ce ce, les viru viruss, les mol olécu écu écules les me membran mbran mbranair air aires es es, les toxi toxine ne ness cho cholé lé lériq riq rique ue eett ttétan étan étaniq iq ique ue ue). Le déplacement antérog...