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Responsable de l’UE : BIDAUD BONOD Christelle

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Chapitre 4 : Les microtubules

I.

Introduction

Le cytosquelette et les microtubules permettent de maintenir la structure d’une cellule dans son environnement. La cellule va pouvoir s’organiser, d’un point de vue structural, dans l’environnement et se positionner soit par rapport aux autres cellules, soit à son microenvironnement qu’est la matrice extracellulaire. Les organites à l’intérieur de la cellule vont pouvoir se positionner correctement grâce au cytosquelette. La seconde fonction du cytosquelette est une fonction de motricité. La cellule est capable de se déplacer dans son environnement. Ce mécanisme se réalise principalement par les microfilaments d’actine. Il peut y avoir un déplacement des organites dans la cellule, qui se réalise également grâce aux éléments du cytosquelette. Le cytosquelette a pour principale fonctions d’aider la cellule à se structurer et se déplacer. Si on marque les microtubules par la microscopie à épifluorescence, on observe le centrosome, qui est le centre organisateur des microtubules. C’est ce qui est marqué par un marquage beaucoup plus fluorescent, autour du noyau. A partir de ce centrosome, les microtubules vont se répartir de partout dans la cellule. Les microtubules, à contrario des microfilaments d’actine, ne vont pas jusqu’à la membrane plasmique parce qu’ils n’ont pas d’attache avec celle-ci.

II.

La tubuline

La protéine qui constitue les microtubules est la tubuline. Il va y avoir deux types de tubuline qui vont s’associer ensemble : la tubuline 𝛼 et la tubuline β. L’association de ces deux tubulines forme un hétérodimère. Chacune de ces sous-unités pèsent 50 kDa. Il y a seulement 5-10% des acides aminés qui sont différents entre 𝛼 et β, ce sont donc deux sous-unités très similaires.

L’association entre 𝛼 et β se réalise sous forme de liaison non covalente. Ce sont des liaisons relativement fortes parce que les doublets se dissocient rarement. Les hétérodimères vont s’associer les uns à la suite des autres pour former un protofilament. Les protofilaments vont s’associer par 13 de manière légèrement décalée. L’association de ces 13 protofilaments forme un microtubule. Le diamètre de ce microtubule sera de 25 nm et la longueur sera très variable. Le microtubule est creux, on a une disposition hélicoïdale avec une impression de vide à l’intérieur. Page 1 sur 19

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Le microtubule est orienté. A l’extrémité négative, on retrouve constamment une sous-unité 𝛼. A l’extrémité positive, on retrouve toujours une sous-unité 𝛽. On va avoir fixation, sur ces tubulines, des nucléotides GDP et GTP. On remarque qu’il y a toujours du GTP sur les sous-unités 𝛼. Ce GTP est non hydrolysable. Sur les sous-unités 𝛽, on peut avoir une fixation soit de GDP, soit de GTP. La fixation de GTP va constituer une coiffe qui va stabiliser le microtubule. On observe que la fixation du GTP sur la sous-unité 𝛽 se réalise sur les premiers dimères. Quand on avance dans le microtubule, la sous-unité 𝛽 sera liée au GDP. Ce GTP est hydrolysable. L’hydrolyse du GTP en GDP conduit à la stabilité du microtubule.

Comme dit précédemment, la longueur du microtubule est extrêmement variable. Cela signifie que le microtubule va, en permanence, subir des étapes de polymérisation et de dépolymérisation. L’assemblage est très dynamique, très rapide. Le microtubule va toujours être orienté par rapport à la cellule. L’extrémité négative sera plutôt au centre de la cellule et, pour certain microtubule, dans le centrosome. Il va y avoir un allongement très lent. En revanche, l’extrémité positive se trouve à la périphérie de la cellule, et l’allongement sera très rapide.

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III.

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La polymérisation

Lors de l’étape de nucléation, les sous-unités 𝛼 et 𝛽 vont s’associer grâce à un ensemble de cofacteurs (des protéines chaperonnes). Les protéines chaperonnes sont des protéines qui aident d’autres protéines à se structurer dans l’espace. Ces protéines vont permettre un rapprochement des deux sousunités. L’association de la sous-unité 𝛼 et de la sous-unité 𝛽 liée à du GDP crée ce qu’on appelle un « stock de dimères libres ». Dans la cellule, on a tout le temps des stocks de dimères disponibles pour faire de la polymérisation. Quand la cellule en a besoin, elle va faire appel aux stocks de dimères libres qui ne pourront s’intégrer que lorsqu’il y aura eu un échange nucléotidique entre le GDP et le GTP. Lorsque le dimère porte uniquement du GTP, c’est ce que l’on appelle la structure de base du microtubule. Ensuite, il peut y avoir polymérisation via l’association des hétérodimères. Au fur et à mesure qu’il va y avoir une polymérisation, le GTP des sous-unités 𝛽 va être hydrolysé en GDP. Cette hydrolysation se réalise grâce à une activité enzymatique, que l’on appelle GAP (GTPase activating protein), portée par la sous-unité 𝛼. La stabilisation, donc l’équilibre des microtubules, est atteinte lorsque la vitesse de polymérisation est égale à la vitesse de dépolymérisation.

La coiffe GTP au niveau de l’extrémité positive sert à maintenir le microtubule et le protofilament très droit, on a un angle de 5° entre les sous-unités 𝛼 et 𝛽. A un moment donné, il va y avoir une hydrolyse de ce GTP en GDP, et ce phénomène va changer la conformation des sous-unités les unes par rapport aux autres. D’un angle de 5°, on est passé à un angle de 12°. Cela suffit à courber le microtubule et induire une dépolymérisation du microtubule, c’est ce qui s’appelle la dépolymérisation « catastrophe ». La cellule va avoir besoin de récupérer ces microtubules pour une raison quelconque, le GTP va être échangé avec un GDP et on revient la polymérisation. C’est ce qui s’appelle le sauvetage. En fonction du temps, la longueur du microtubule passe son temps à alterner les augmentations et diminutions en fonction des besoins de la cellule.

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IV.

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Naissance des microtubules

1. Centrosome Le centrosome s’appelle également « centre organisateur des microtubules » (COMT). Si on le regarde en microscopie électronique à transmission avec un fort grossissement (x 150 000), on observe que le centrosome est deux centrioles organisés perpendiculairement l’un par rapport à l’autre. Le centrosome est le centre de nucléation des microtubules dont l’organisation est centrosomale. Si on représente une cellule en interphase, on remarque que les extrémités négatives des microtubules sont vers le centriole et les extrémités positives vers la périphérie de la cellule. Il est important de préciser que l’on se trouve en interphase parce que l’organisation des microtubules évoluent pendant la division cellulaire.

Si on regarde en microscope électronique à transmission, on observe un centriole coupé de façon longitudinale et un autre coupé de manière transversale. Tout ce qui a autour est assez clair, en revanche on observe une sphère un peu plus foncée, qui contient donc des protéines. Cette sphère s’appelle le PCM (matériel péri-centriolaire) qui est composée de 200 protéines qui aident à l’organisation des centrioles.

Il existe certains cas où les microtubules vont prendre naissance hors des centrosomes, les neurones par exemple. Dans l’axone, il y a des microtubules centrosomaux. En revanche, dans les dendrites, il peut y avoir stabilisation par des microtubules organisés du – vers le + ou du + vers le -. Les microtubules ne démarrent pas du tout du centrosome.

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2. La tubuline 𝛾 La tubuline 𝛾 est une protéine de 454 acides aminés. Elle est relativement proche des tubulines 𝛼 et 𝛽 avec 30% d’acides aminés identiques. Elle est très conservée entre différentes espèces, la protéine humaine a 98% d’identité avec la protéine du xénope. C’est une protéine essentielle à la viabilité, elle est donc très importante dans l’organisme. La tubuline 𝛾 est présente au niveau de l’extrémité négative, dans le centrosome. Son rôle est d’augmenter la nucléation, et donc d’augmenter le nombre de microtubules. La tubuline 𝛾 va s’associer à l’extrémité négative avec des protéines que l’on appelle les Dgrips (drosophile gamma ring proteins) 91 et 84. Cela forme un premier élément que l’on appelle le 𝛾-TuSC (𝛾-tubulin small complex). Il y a encore d’autres protéines qui vont se fixer qui s’appellent Dgrips 163, 128 et 75. Toute la structure protéique se nomme le 𝛾-TuRC (𝛾-tubulin ring complex). Cette structure protéique à l’extrémité négative joue un rôle de coiffe (protection des microtubules), mais également un rôle dans la nucléation pour la formation des microtubules.

D’un point de vue expérimental, il y a deux hypothèses qui s’affrontent, mais on ne sait pas encore quelle est la bonne parce que nous n’avons pas encore de certitude expérimentale. -

Le premier modèle est « le modèle du moulin ». Le 𝛾-TuRC s’organise en anneau, comme nous avons pu le voir sur les images de microscope auparavant. Cela forme une espèce de moule sur lequel va pouvoir polymériser le microtubule.

-

Le second modèle est « le modèle du protofilament ». On a du 𝛾-TuRC qui se met sur un seul protofilament, et c’est à partir de cela qu’il peut y avoir naissance du microtubule.

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3. Centrosome et centrioles Chaque centriole est composé de 9 triplets de microtubules. On observe que ces triplets sont légèrement inclinés par rapport à l’axe du centriole. Le microtubule le plus proche du centre est le A, celui du milieu est le B et celui de l’extrémité est le C. On dit que le A est un microtubule complet et les B et C sont des microtubules incomplets.

Il existe plein de protéines dans le matériel péricentriolaire. En effet, il y a des protéines qui sont en attente, qui sont des MAP (microtubule associated-protein). Ces MAP vont se fixer sur le microtubule en train de prendre naissance dans le centriole. Au centre, il y a plein de protéines qui s’organisent et qui ont été appelées « protéines qui font des liaisons en rayon de roue ». Il existe des liaisons entre microtubules pour les stabiliser. En effet, on observe une liaison entre le microtubule A et le microtubule C du triplet suivant.

V.

Les protéines associées aux microtubules : MAP

Les protéines seront soit des MAP qui interviennent dans la structure, soit des MAP qui interviennent dans la motricité. Les MAP structurales sont des protéines qui vont se fixer aux microtubules pour les stabiliser. On distingue deux types de MAP structurales : -

Les MAP de type I. Ce sont des protéines qui vont s’associer au microtubule grâce à un certain domaine. Elles vont également s’associer au microtubule voisin grâce à leur extrémité. Ce sont souvent des protéines qui permettent de maintenir une certaine distance entre les microtubules. •

MAP1A. Page 6 sur 19

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MAP1B. MAP1S.

Les MAP de type II. Elles se fixent sur un microtubule grâce à deux domaines. • • • •

MAP2A. MAP2B. MAP2C Tau.

Les MAP motrices vont jouer un rôle dans le déplacement de certaines choses dans le cytoplasme cellulaire. On retrouve principalement : -

La kinésine.

-

La dynéine.

Une troisième catégorie de protéines peut se fixer aux microtubules, ce sont les +TIPs. Ce sont des protéines que l’on appelle des « +end tracking proteins ». Ce sont donc des protéines qui ont la capacité de se fixer à l’extrémité positive du microtubule. Elles peuvent avoir un rôle stabilisateur ou déstabilisateur. 1. Les MAP structurales de type I Comme dit précédemment, elles vont permettre de lier les microtubules entre eux et de maintenir un espacement correct des microtubules les uns par rapport aux autres. Toutes ces MAP ont été historiquement mises en évidence dans le cerveau. Lorsque l’on regarde la structure globale des protéines, on s’aperçoit qu’elles vont devoir être clivées pour être sous forme active. Une fois clivée, elle libère une grande fraction protéique que l’on appelle la « chaîne lourde » et une plus petite que l’on nomme la « chaîne légère ». Ce sont des protéines qui sont très grosses avec un poids moléculaire de 350 kDa pour MAP1A, 300 kDa pour MAP1B et 120 pour MAP1S. Dans ces protéines, on observe différents domaines : -

Les MTBD (Microtubule binding domain). Ce sont les domaines qui permettent aux protéines MAP de se lier aux microtubules.

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Des domaines qui permettent une liaison à l’actine. On imagine donc que ces protéines MAP permettent l’interaction entre le microtubule et l’actine.

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2. Les MAP structurales de type II Ce sont des protéines qui ont des tailles différentes. Elles contiennent, à leur extrémité C-terminale, les MTBD. On constate que la protéine Tau peut être présente sous deux formes : soit avec trois domaines de liaison aux microtubules, soit avec quatre domaines de liaison aux microtubules. Tout dépend de la maturation de l’ADN. Ces protéines sont principalement exprimées dans les neurones. La protéine MAP2 va rester dans le corps cellulaire et les dendrites, la protéine Tau plutôt se localiser dans les axones. On imagine que les protéines se fixent à un endroit où il y a certains types de microtubules et vont avoir une action particulière.

L’ARN messager de la protéine Tau se localise au niveau du corps cellulaire. En revanche, la protéine Tau va se fixer sur les microtubules le long de l’axone. Cela aide au transport de certaines choses à travers l’axone. Cette protéine peut être soumise à des phosphorylations par des kinases. Si le nombre de phosphorylation est excessif, il y a un changement de conformation protéique qui détache la protéine du microtubule. La libération induit une déstabilisation du microtubule, donc sa dépolymérisation. En même temps, les protéines Tau s’associent entre elles. Ces agrégats s’appellent des plaques séniles qui conduisent à une mort neuronale. C’est principalement ce que l’on observe chez les personnes atteintes d’Alzheimer et de maladies neurodégénératives.

3. Les +TIPs CLIP-170 La protéine CLIP-170 (cytoplasmic linker protein) a un poids moléculaire de 170 kDa. Si on fait un marquage de cette protéine, on observe une colocalisation avec l’extrémité positive des microtubules. Comme les MAP structurales de type I et II vont stabiliser les microtubules et empêcher le phénomène de catastrophe. Il existe deux hypothèses vis-à-vis de l’action de la protéine CLIP-170 au niveau du microtubule : -

La première est que la protéine CLIP-170 se fixe progressivement à l’extrémité positive. Plus le microtubule augmente, plus la protéine va arriver et s’accumuler sur la première partie du microtubule. A un certain moment, elle sera éliminée. Page 8 sur 19

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La seconde est que l’entrée de CLIP-170 ne se fait pas à l’extrémité positive, mais un peu plus à l’intérieur du microtubule. La protéine sera, par la suite, déplacée vers l’extrémité positive pour jouer son rôle. Elle sera également éliminée.

D’autres marquages ont été réalisés. On aperçoit un rapprochement très étroit, à certains endroits de la cellule, de la protéine CLIP-170 avec la vinculine, qui est une adhésion focale qui interagit avec l’actine. Quand une cellule migre, elle va organiser son cytosquelette d’actine sous forme de fibres de stress. Il y a également de l’actine corticale, sous membranaire, c’est un stock d’actine, qui se trouve du côté où la cellule va se diriger, qui va permettre à la cellule d’agrandir ses fibres de stress. La protéine CLIP-170 fait la liaison entre le microtubule et les microfilaments d’actine.

Si on résume les rôles de la protéine CLIP-170 : -

Ancrage des microtubules en périphérie de la cellule.

-

Régulation de la dynamique des microtubules. En effet, lorsque la protéine est présente, le microtubule s’agrandit par polymérisation. A contrario, si la protéine n’est plus présente, le microtubule se dépolymérise et rétrécit.

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Régulation du mouvement d’organites impliquant le complexe dynéine/dynactine. Page 9 sur 19

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EB-1 Il existe une autre protéine capable de se fixer à l’extrémité positive des microtubules, qui est la protéine EB-1 (end binding protein). EB-1 permet l’interaction entre les microtubules et la 𝛾- actine.

La stathmine Un dernier exemple de protéine qui se fixe à l’extrémité positive est la stathmine. C’est une protéine qui va déstabiliser les microtubules. La stathmine va se lier le long de deux hétérodimères : 𝛼1-𝛽1 et 𝛼2𝛽2. La stathmine est principalement organisée en forme d’hélice et vient recouvrir la première sousunité 𝛼, c’est ce qui va permettre la déstabilisation. Elle conduit à une incurvation des sous-unités 𝛼 et 𝛽. On a une déstabilisation et donc une catastrophe.

En résumé :

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4. Les MAP motrices : kinésine et dynéine Les MAP motrices permettent le transport à travers la cellule, on les appelle également des « moteurs moléculaires ». Les protéines ont besoin d’énergie pour se déplacer dans la cellule. Cette énergie est issue de l’hydrolyse de l’ATP. La kinésine et la dynéine vont se fixer sur les microtubules. La kinésine va permettre un déplacement vers l’extrémité positive, c’est ce que l’on appelle un mouvement antérograde. La dynéine va permettre un mouvement vers l’extrémité négative, ce sera appelé un mouvement rétrograde. Le mouvement concerné est celui d’un cargo, ça peut être un organite membrané, une vésicule, une mitochondrie, des particules virales, des ARN messagers… Chaque protéine est constituée de deux chaînes lourdes et de chaînes légères. Si on prend l’exemple de la kinésine, les chaînes lourdes sont les structures enroulées l’une avec l’autre, c’est un domaine coiled coil. Cet enroulement permet la formation d’une structure stable, que l’on appelle la tige. Les chaînes légères sont bleues. Une partie de la protéine a le rôle de fixation sur le microtubule et l’autre partie prend en charge le cargo. On observe la même organisation sur la dynéine.

La kinésine Il existe une centaine de types de kinésines issues de 14 familles (KIFs). La kinésine-1 est la kinésine conventionnelle.

Les pieds sont toujours fixés sur les sous-unités 𝛽. On part du principe que le pied avant (rouge) est déjà fixé sur une sous-unité 𝛽. Sur ce pied, il y a de l’ADP, donc rien ne peut se produire. La première étape est donc un échange de l’ADP en ATP sur le pied avant. Ce pied va subir un changement de conformation qui va permettre au pied arrière (jaune) de réaliser un basculement pour passer de la gauche vers la droite. Ce pied arrière est également fixé à un ADP. Maintenant l’ATP du pied arrière (rouge) est hydrolysé en ADP. On se retrouve au début du cycle, décrit précédemment.

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La dynéine

Via la réalisation d’une structure c...