Práctica 14 - Exoenzimas PDF

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Las exoenzimas son enzimas que secretan los microorganismos y actúan fuera de la célula; su principal función es disminuir el tamaño de las moléculas complejas que existen en el medio ambiente, lo que frecuentemente determina que éstas puedan difundirse al interior de los microorganismos, en donde f...

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MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL Grupo: 6

Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00)

Equipo: 2

Integrantes: Correa García, Víctor Josué Torres Santander, Fernando

Informe práctico 14: « Exoenzimas» Las exoenzimas son enzimas que secretan los microorganismos y actúan fuera de la célula; su principal función es disminuir el tamaño de las moléculas complejas que existen en el medio ambiente, lo que frecuentemente determina que éstas puedan difundirse al interior de los microorganismos, en donde fungen como sustratos de otras enzimas y son aprovechados por el microorganismo para su sobrevivencia. No todos los microorganismos poseen las mismas exoenzimas, algunas son características de algunas especies y eso determina los medios en los cuales puedan o no desarrollarse. (Keywords: Exoenzimas, sustratos) Resultados

Microorganismo

Se inocularon cuatro microorganismos distintos en cada uno de los medios específicos para evidenciar la presencia de las exoenzimas. Se incubaron y posteriormente se revelaron (las que fue necesario) y se interpretaron los resultados obtenidos que fueron los siguientes: Microorganismo Agar almidón (Resultado) P. aeruginosa + B. subtilis S. cerevisiae S. aureus Tabla 1. Resultados para la presencia de amilasa Microorganismo P. aeruginosa B. subtilis S. marcescens S. aureus

Agar leche descremada (Resultado) + + -

Tabla 2. Resultados para la presencia de caseinasa (proteasa) Microorganismo Agar gelatina (Resultado) + P. aeruginosa S. aureus Tabla 3. Resultados para la presencia de gelatinasa (proteasa)

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E. coli B. cereus S. aureus S. aureus

Agar BHI + yema de huevo (Resultado) + -

Tabla 4. Resultados para la presencia de lecitinasa (lipasa) Microorganismo Agar DNA (Resultado) E. coli + S. marcescens + S. aureus β-hem S. aureus + Tabla 5. Resultados para la presencia de DNAsa Microorganismo E. coli S. aureus β-hem S. oralis S. aureus

Agar Sangre (Resultado) + +

Tabla 5. Resultados para la presencia de hemolisinasa Análisis de resultados Con los resultados anteriores se ponen en evidencia las exoenzimas que poseen distintos microorganismos, de esta forma se clasifican por sus distintas actividades metabólicas y en caso de ser patógenos nos dan una idea del ambiente Química Farmacéutico Biológica

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en el cual pueden sobrevivir y por tanto causar una enfermedad en seres humanos.

Para el caso de la exoenzima amilasa fue requerido utilizar un revelador ya que su presencia no es evidente, se añadió lugol (Yodo yodurado) el cual tiene la capacidad de formar complejos con el almidón, este complejo tiene un color azul característico, si no se observaba presencia de este color había la existencia de la exoenzima, en caso contrario la enzima no es poseída por el microorganismo, para el estudio realizado el único microorganismo que presentó la amilasa fue Bacillus subtilis lo cual en contraste con la literatura (García, 2004) encontramos que el género Bacillus sp es característica de la posesión de esta enzima. Para la determinación de la existencia de la exoenzima caseinasa que en realidad es una proteasa no fue necesario utilizar un revelador ya que el medio nos proporciona el resultado por su color blanquecino, si se presenta un halo incoloro alrededor del crecimiento bacteriano el microorganismo contiene la enzima, en caso contrario no la posee; para el estudio realizado se encontró que tanto Bacillus subtilis y Serratia marcescens poseen la exoenzima lo cual confrontando la literatura encontramos que es correcto tanto para S. marcescens (Braun, 1980) como para B. subtilis (Alarcón, 2001). En la determinación de la presencia de la exoenzima gelatinasa la prueba es positiva si el medio es líquido ya que al hidrolizar la gelatina no se conserva la característica de gelificar y por tanto pierde su forma, en caso de que el medio no se mueva la prueba es negativa, se encontró que Pseudomonas aeruginosa posee la enzima, en la literatura es el microorganismo representativo de esta característica (Alarcón, 2001). La determinación de la lecitinasa que es una lipasa ya que degrada los lípidos se observa por la formación de un halo alrededor del crecimiento microbiano, el único microorganismo que contiene la enzima para nuestro estudio fue Bacillus cereus quien según la literatura es un organismo característico para esta exoenzima (Alais, 2003).

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Para el caso de la determinación de la exoenzima DNAsa fue requerido revelar ya que el resultado es imperceptible por sí mismo, se añadió ácido clorhídrico concentrado el cual al interaccionar con el DNA presente causa que precipite y por tanto se hace perceptible un precipitado blanco, si hay presencia de este precipitado la prueba es negativa ya que al existir DNA el microorganismo no puede degradarlo de manera extracelular, en caso contrario la prueba es positiva ya que el microorganismo es capaz de usar en su metabolismo el DNA y por tanto no hay presencia de él. En el estudio realizado se observó que tres de los cuatro microorganismos inoculados presentaban la exoenzima, estos fueron Serratia marcescens, Staphylococcus aureus β-hem y Staphylococcus aureus que de acuerdo con la literatura si tienen la capacidad de hidrolizar al DNA para la obtención de sustratos más pequeños (Jeffries, 1957). Finalmente se determinó la presencia de la exoenzima hemolisinasa, la característica de esta enzima es que causa la hemólisis de los glóbulos rojos entre otros componentes de la sangre, al causar esta ruptura desaparece el color rojo característico de la sangre por lo que la presencia de la coloración es una prueba negativa mientras que la observación de un halo incoloro es una prueba positiva, algunas ocasiones se observa un halo verdoso lo que se refiere que hay una hemolisis parcial. En el estudio realizado se encuentra que en general el organismo Staphylococcus aureus posee la exoenzima lo que confrontado en literatura resulta correcto (Allen, 2006), esto le brinda un gran factor de virulencia. Se analizó un microorganismo para todas las pruebas, este fue Staphylococcus aureus de acuerdo a los resultados obtenidos se puede predecir en que medios puede desarrollarse de manera efectiva y que ambientes puede afectar con su desarrollo, se observa que un medio con componentes sanguíneos y DNA no afectarán en su desarrollo ya que puede metabolizarlos y usar esos sustratos, mientras que si se llega a colocar en un medio con moléculas como almidón, caseína, lecitina y gelatina es posible que se desarrolle pero no de manera óptima ya que no Química Farmacéutico Biológica

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podría degradar las macromoléculas para obtener sustratos como glucosa entre otros para su desarrollo, sin embargo crecerá por la presencia de otros nutrientes en el medio de cultivo pero una vez que se terminen su crecimiento se verá detenido. Conclusiones El conocimiento de las exoenzimas que los microorganismos poseen es una herramienta útil tanto en laboratorio de microbiología como en la industria ya que en el primero se puede desarrollar un medio selectivo o diferencial para el crecimiento de un género de microorganismos y en algunas ocasiones diferenciar entre especies. En la industria es útil ya que así podemos saber que microorganismos pueden afectar de manera directa un producto como la leche entre otros.

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 Alarcon R., Manual de Practicas de Microbiologia y Microbiologia de Alimentos, 1ra ed.; Universidad Autónoma de Ciudad Juarez, 2004; pp. 37-38.  Alais, C. Ciencia de la leche, 4ª ed.; Reverté: Francia, 2003; pp. 355.  Jeffries, C., Holtman, D., and Guse, D., Rapid method for determining the activity of microorganisms on nucleic acid. J. Bacteriol. 1957, 73: 590- 591.  Allen. Diagnóstico microbiológico, 6ª ed.; Panamericana: USA, 2006; pp. 601602.  Braun, V. Excretion of a protease by Serratia marcescens, PubMed, 1980, 124(1): 55-61.  García, M. Biotecnología alimentaria, 5ª ed.; Limusa: México, 2004; pp. 106.

Bibliografía  Ramírez, R., Luna, B., et. all. Manual de Prácticas de Microbiología General, 6ª ed.; Universidad Nacional Autónoma de México: México, 2013; pp. 189.

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Anexo 1. Resultados para presencia de distintas exoenzimas.

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Fecha: 18 / Noviembre / 2015. Muestra: 1. Pseudomonas aeruginosa, 2. Bacillus subtilis, 3. Saccharomyces cerevisiae y 4. Staphylococcus aureus. Medio: Agar almidón Descripción: Se observa un halo incoloro alrededor del crecimiento de Bacillus subtilis lo cual nos da una prueba positiva para amilasa para este microorganismo y negativa para el resto.

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Fecha: 18 / Noviembre / 2015. Muestra: 1. Pseudomonas aeruginosa, 2. Bacillus subtilis, 3. Serratia marcescens y 4. Staphylococcus aureus. Medio: Agar leche descremada Descripción: Se observa un halo incoloro alrededor del crecimiento de Bacillus subtilis y Serratia marcescens lo cual nos da una prueba positiva para caseinasa para estos microorganismos y negativa para el resto.

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Fecha: 18 / Noviembre / 2015. Muestra: 1. Escherichia coli, 2. Bacillus cereus, 3. Staphylococcus aureus y 4. Staphylococcus aureus. Medio: Agar BHI + yema de huevo Descripción: Se observa un halo blanquecino alrededor del crecimiento de Bacillus cereus lo cual nos da una prueba positiva para lecitinasa para este microorganismo y negativa para el resto.

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Fecha: 18 / Noviembre / 2015. Muestra: 1. Escherichia coli, 2. Serratia marcescens, 3. Staphylococcus aureus β-hem y 4. Staphylococcus aureus. Medio: Agar DNA Descripción: Se observa un halo blanquecino alrededor del crecimiento de Escherichia coli lo cual nos da una prueba negativa para DNAsa para este microorganismo y positiva para el resto.

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Fecha: 18 / Noviembre / 2015. Muestra: 1. Escherichia coli, 2. Staphylococcus aureus β-hem, 3. Streptococcus oralis y 4. Staphylococcus aureus. Medio: Agar sangre Descripción: Se observa un halo incoloro alrededor del crecimiento de Staphylococcus aureus β-hem y Staphylococcus aureus lo cual nos da una prueba positiva para hemolisinasa para estos microorganismos y negativa para el resto.

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