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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUIMICOFARMACOBIOLOGO

Práctica 6 HIDROLISIS ENZIMáTICA DE LOS LípIDOS Alumna: Evelyn Fernández Hernández 201872282

1. Investigar la función biológica de las lipasas Las lipasas están entre las enzimas más ampliamente usadas en biocatálisis, debido a que son capaces de llevar a cabo reacciones de biotransforamción con una alta selectividad y especificidad, y pueden ser usadas en diferentes medios de reacción La aplicación de lipasas en procesos de biotransformación en diversos campos industriales, se ha debido esencialmente a la gran actividad que exhibe en medios acuosos y alta especificidad y selectividad hacia el sustrato sobre el cual actúan. Desde el punto de vista funcional, las lipasas (triacil glicerol acil-hidrolasas EC 3.1.1.3) constituyen un grupo de enzimas pertenecientes a la familia de las serinahidrolasas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y catalizan la hidrólisis de triglicéridos para la formación de ácidos grasos y glicerol, como se observa en la figura 1.

Figura 1 : Función biológica de las lipasas. Hidrólisis de triglicéridos in vivo. Se ejemplifica la reacción de hidrólisis de tri-octil-glicerol

Las lipasas son consideradas las enzimas con mayor aplicación en síntesis orgánica debido a que exhiben

alta

especificidad,

regio

y

enantioselectividad. Además, catalizan una gran variedad de reacciones químicas, entre las que se incluyen: reacciones de hidrólisis; reacciones de esterificación selectiva entre ácidos y alcoholes reacciones de trans-esterificación catalizando el

Figura 2 Reacciones catalizadas por lipasas in vitro.

intercambio de grupos acilo, ya sea entre un éster y un ácido carboxílico (acidólisis) un éster y otro éster (inter-esterificación), o un éster y un alcohol (alcohólisis). Además, las lipasas catalizan reacciones de aminólisis para síntesis de amidas, tanto racémicas como ópticamente activas y la hidrazinólisis selectiva de ésteres para la formación de hidracinas.

2. Estructura tridimensional de la lipasa y localización celular La lipasa pancreática es una enzima (EC 3.1.1.3) que se produce en el páncreas y se secreta en el intestino delgado donde ayuda a descomponer las grasas (lípidos) que comemos para convertirlas en ácidos grasos y glicerol. Existe una lipasa de lipoproteínas (Lipoproteína Lipasa, LPL) que se sintetiza en el interior de las células de los tejidos y después de madurar, es exportada a la luz de los capilares sanguíneos, atravesando el endotelio capilar. En los años 90, se determinó la estructura 3D de diferentes lipasas mediante técnicas cristalográficas, identificándose en general una configuración de tipo α/β hidrolasa. Además, se encontró que el centro activo de las lipasas estaba conformado por una triada catalítica constituida por residuos de serina (Ser), histidina (His) y otro aminoácido que suele ser ácido aspártico (Asp) o ácido glutámico (Glu), localizado en una cavidad conocida como hueco hidrofóbico de la enzima. De igual forma, se determinó que en la mayoría de las lipasas existe un elemento móvil, el cual es conocido como “lid” o tapadera, conformado por una o dos estructuras alfa-hélice cortas, unidas al cuerpo de la lipasa mediante elementos flexibles. La información acerca de la conformación estructural de las lipasas permitió establecer que en presencia de medios acuosos homogéneos, la lipasa cristaliza con el centro activo totalmente aislado del medio de reacción por la tapadera (flat o lid), haciendo inaccesible la entrada de los sustratos (conformación cerrada) hacia el sitio activo. Esta cadena polipeptídica presenta en su cara interna una

serie de residuos hidrofóbicos que interaccionan con las zonas hidrofóbicas que rodean al sitio activo de las lipasas. Por el contrario, cuando la enzima se cristaliza

en

presencia

de

interfases

hidrofóbicas se obtiene una conformación totalmente distinta, en la cual la tapadera se desplaza del centro activo producto de la interacción entre puentes salinos y puentes de hidrógeno con otra zona de la superficie de la lipasa, dejando libre el centro activo de la enzima (conformación abierta). Como se puede observar en la figura 3 las distintas

Figura 3 Conformaciones estructurales de la lipasa B de Candida

conformaciones de las lipasas. Las singulares características estructurales de las lipasas sugieren que la presencia del lid es un determinante estructural y funcional de la actividad y selectividad de esta enzima en la catálisis de diferentes reacciones de biotransformación.

3. ¿Cómo actúa la lipasa pancreática sobre los triglicéridos en la luz intestinal? La digestión de lípidos ocurre en el intestino. Cuando los lípidos y las proteínas llegan al intestino, estimulan las células endocrinas en el duodeno distal y en el yeyuno para liberar la hormona peptídica colecistocinina (CCK). LA CCK estimula el páncreas para que se secrete enzimas digestivas.

Figura 4 . Visión general de la digestión, absorción, almacenamiento y movilización de la grasa en el ser humano.

La mayor parte de la digestión se produce por la acción de la lipasa

aceite-agua. A pesar de sus propiedades pancreática,

una

enzima

poco

común, que requiere calcio, y que cataliza

una

reacción

en

una

interfase aceite-agua. El sustrato que se degrada está en una fase apolar y, naturalmente, el otro sustrato es el agua. Los estudios estructurales

sobre

la

lipasa

pancreática indican que el centro catalítico

de

la

misma

queda

expuesto como resultado de un cambio de conformación que se produce tan sólo en una interfase físicas poco habituales, la lipasa pancreática actúa a través de un lugar activo con serina y un intermediario acilenzima, igual que la serina proteasas como la quimotripsina. Los productos de la digestión de las grasas comprenden una mezcla de glicerol, ácidos grasos libres, monoacilgliceroles y diacilgliceroles. Menos del 10% de los triacilgliceroles originales permanece sin hidrolizar. Durante la absorción a través de las células de la mucosa intestinal, se produce una abundante resíntesis de triacilgliceroles a partir de los productos de hidrólisis. 4. Explica la razón por la cual la lipasa pancreática requiere que las grasas sean emulsificadas por los lípidos La mayor parte de la digestión de lípidos es provocada por la lipasa pancreática que actúa en la parte Figura 5: Emulsificación de las grasas

superior del lumen intestinal. La lipasa pancreática actúa en la interfaz que existe entre las fases oleosa y acuosa, razón por la cual les necesaria la emulsificacíon de los lípidos (figura 5). La lipasa pancreática cataliza la hidrólisis de los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3, generando 2-monoacilglicéridos. Los fosfolípidos son hidrolizados por la fosfolipasa A2, y los principales productos son lisofosfolípidos y ácidos grasos libres. Los ésteres del colesterol son hidrolizados por la hidrolasa de ésteres de colesterol pancreática. Los ácidos grasos libres y los monoglicéridos son absorbidos por los enterocitos de la pared intestinal. En general, los ácidos grasos con longitudes de cadena inferiores a 14 átomos de carbono entran directamente en el sistema de la vena porta y son transportados hacia el hígado. Los ácidos grasos con 14 o más átomos de carbono se vuelven a esterificar dentro del enterocito y entran en circulación a través de la ruta linfática en forma de quilomicrones.

5. Incluir figura de Digestión de lípidos en vertebrados (Lehningher), y explicarla.

Figura 6 : Proceso de lipolisis de la dieta en los vertebrados.

Los

lípidos

de

la

dieta,

principalmente los triglicéridos y, en el

menor colesterol,

proporción, son

digeridos

inicialmente y de forma parcial en el tracto gastrointestinal por la acción de las enzimas lipasas, bucal y gástrica. A continuación, las sales biliares emulsionan los

lípidos facilitando la acción de la lipasa pancreática y su posterior absorción en forma de micelas mixtas en el intestino delgado. El intestino absorbe el 100% de los triglicéridos, mientras que el colesterol que proveniente de la dieta se absorbe en un 40%, aproximadamente. En la mucosa intestinal del duodeno, los triglicéridos y el colesterol de la dieta, se ensamblan con las apoproteínas apo-A y apo-B48 constituyendo los quilomicrones que pasan a la circulación linfática y son las lipoproteínas responsables de transportar en sangre los triglicéridos de origen exógeno. En este tejido la enzima lipoproteína lipasa, hidroxila los triglicéridos en ácidos grasos y glicerol, estos son captados por las células de los tejidos diana. En tejidos musculares los ácidos grasos de oxidan para obtener energía, en las células adiposas se reesterifican para su almacenamiento en forma de triacilgliceroles y el resto de los quilomicrones es llegan al hígado a través de la sangre y son captados por endocitosis para ser oxidados y obtener energía o precursores en la formación de cuerpos cetónicos. 6.- Del experimento, explica la utilidad de los testigos Un testigo es el tratamiento de comparación adicional, que no debe faltar en un experimento. Se trata de un tratamiento de referencia y sirve para comparar los tratamientos propios del experimento. En este experimento se utilizan dos testigos: el que no posee bilis ni extracto neutro de pancreatina al 1%; y el que posee bilis, pero no extracto neutro de pancreatina al 1%. Ambos testigos contienen leche y extracto de pancreatina caliente. Los otros matraces contienen cantidades específicas de los reactivos antes mencionados, pero no incluyen extracto de pancreatina caliente a ebullición por 3 minutos. En estos matraces, se llevará a cabo la emulsificación de las grasas, favoreciendo la acción de la lipasa (pancreatina) la cual consiste en hidrolizar los lípidos y obtener así los ácidos grasos, los cuales serán titulados con KOH. El testigo 1 ayudará a demostrar que, al no tener bilis, no habrá emulsificación de las grasas, por lo que el ataque de la enzima lipasa (pancreatina) no se favorecerá no solo por esta razón, sino también porque se encuentra en un estado inactivo por su desnaturalización por calor; de esta manera, no se conseguirá la hidrólisis

de los lípidos en la leche. Por su parte, el testigo 2, que sí tiene bilis, obtendrá la emulsificación de las grasas, lo cual permitiría una mejor área de acción para la acción de la lipasa (pancreatina), sin embargo, esta se encuentra inactiva (o desnaturalizada) tras someterse a ebullición, por lo que tampoco hidrolizará los lípidos de la leche. En ambas pruebas testigo, la concentración de ácidos grasos será menor porque no se llevará acabo la hidrólisis de los lípidos y, por ende, los ácidos grasos no se obtendrán como productos de esta reacción. Por lo que, al titular los ácidos grasos, los que se encuentren formarán parte de la composición natural de la leche, pero no habrán sido obtenidos por la acción de la lipasa (pancreatina). 7.- Incluye una copia de pantalla y la liga del video relacionado con hidrolisis enzimática (lipasa pancrática)

https://www.youtube.com/watch?v=3GEy1H7vfXM Referencias  

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Campoy, L.., & Read, M. (2015, 12 diciembre). Lipid Emulsion - an overview | ScienceDirect Topics. Recuperado de https://www.sciencedirect.com/topics/agriculturaland-biological-sciences/lipid-emulsio Valenzuela B, Alfonso, Sanhueza C, Julio, & Nieto K, Susana. (2002). EL USO DE LÍPIDOS ESTRUCTURADOS EN LA NUTRICIÓN: UNA TECNOLOGÍA QUE ABRE NUEVAS PERSPECTIVAS EN EL DESARROLLO DE PRODUCTOS INNOVADORES. Revista chilena de nutrición, 29(2), 106115. https://dx.doi.org/10.4067/S0717-75182002000200005 Azar, D. (2011). Diseño de Experimentos al Completo Azar. Retrieved 20 October 2020, from http://reyesestadistica.blogspot.com/2011/07/diseno-de-experimentos-al-completoazar.html

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