Practica 8 \"Hongos\" PDF

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Practica en la cual se desarrollo la caracterización de diferentes hongos ...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO.

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

PRACTICA 8 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

GRUPO 2BM1 EQUIPO 6 PRESENTAN García Martínez Jairo Jossimar González Rangel Damián Ledezma Torres Pedro Luis Nuño Álvarez Andrea Pablo Hernández Alejandra Lucero Ramírez Rizo Miguel Ángel

NOMBRE DE LOS PROFESORES CESAR AZA GONZÁLEZ, KARLA LIZBETH MACÍAS SÁNCHEZ, JUAN FRANCISCO SÁNCHEZ LÓPEZ

SILAO DE LA VICTORIA, GTO. 28 DE NOVIEMBRE DE 2018.

OBJETIVOS El alumno podrá: •

Aislar hongos y levaduras para analizar su metabolismo mediante la producción de a-amilasa.

•

Identificar hongos y levaduras mediante su morfología colonial y microscópica.

•

Realizar la técnica de tinción en fresco.

•

Empelar la técnica de microcultivo para el aislamiento de hongos.

INTRODUCCIÓN MOHOS Y LEVADURAS Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo, también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto, pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (mico toxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos

(FIg.1) Conjunto de mohos y levaduras en un medio de crecimiento

MOHOS: El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y microscópicas.

(Fig.1.2) Crecimiento de un moho en una fresa alimentado por los nutrientes de la fresa. -Características: Hifas y micelio: El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados órganos ayudan a identificar a los mohos.

(Fig. 1.3) Esquematización de los tipos de hongos.

Órganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungí Imperfecto, los cuales sólo poseen esporas asexuales. Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningún receptáculo (2) artrosporas u oidios. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas en cada una de las distintas especies de mohos. (3) esporangiosporas. se encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa fértil, el esporangióforo.

(Fig. 1.4) Proceso de formación esporangiosporas.

Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie

de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. LEVADURAS Y HONGOS LEVADURIFORMES. El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados.

(Fig. 1.5) Esquematización de la reproducción de levaduras por gemación.

Morfología. Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación multicelular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por fisión. En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos.

(Fig. 1.6) Organización de las levaduras y su morfología.

Propiedades. La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo, carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo, la mayoría de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C.

AISLAMIENTO DE LOS HONGOS Y ESTUDIO. Para poder trabajar con una especie determinada, ya sea para investigación, identificación, aplicación o control del microorganismo, es necesario contar con un “cultivo puro”, es decir aquél en el cual solo existe un tipo de microorganismos, descendientes de un solo individuo y por lo tanto, de características idénticas. En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos y actividad fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro.

(Fig. 1.7) Cultivo de una colonia pura de levaduras. De manera general los métodos de aislamiento incluyen: 1. Separación física de los microorganismos mediante: a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa. b) Siembra por agotamiento. 2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales.

3. Aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales como la formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc. Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se emplean combinaciones de las técnicas anteriores. Por otro lado, la estructura microscópica es decisiva para la clasificación. Las características visibles son muy importantes debido a que, a simple vista, el aspecto de las colonias es a veces tan característico que le permite identificar enseguida el tipo de hongo. Sin embargo, es indispensable para la clasificación final determinar las peculiaridades del hongo al nivel microscópico que presentan estos microorganismos. Generalmente por medio de una aguja de disección o un asa bacteriológica con un pequeño ganchito en la punta es posible desprender pequeñas porciones de la colonia para su estudio microscópico. Sin embargo, quizá el mejor método para el estudio microscópico es el MICROCULTIVO que permite observar cuidadosamente y a intervalos las estructuras microscópicas intactas, mientras que en la técnica de desprender una porción del cultivo se altera muy seriamente la arquitectura microscópica tanto que a veces es imposible reconocer el hongo.

(Fig. 1.8) Crecimiento de colonias separadas de hongos y levaduras en un medio de cultivo.

MICROCULTIVO. El microcultivo es el procedimiento idóneo para la identificación de estructuras fúngicas, pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su conjunto no solo una parte del mismo, como ocurre con el método de disociación. pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su conjunto no solo una parte del mismo, como ocurre con el método de disociación. El hongo crece sobre un cubreobjetos que luego se coloca sobre un portaobjetos al que añadimos un transparentador con colorante (Lacto fenol de Aman y Azul Algodón). De este modo se observan las hifas intactas facilitando su correcta identificación.

(Fig. 1.9) Organización de la caja Petri para la realización del microcultivó.

(Fig. 1.10) Micro agar colocado sobre un portaobjetos listo para inocular.

RESULTADOS Se realizo el análisis de distintas muestras de hongos estas siendo Aspergillus niger, Penicillium canescens, hongo de fresas con crema y hongo de pan, estas siendo sometidas a distintas pruebas para la identificación y clasificación de hongos, se comenzó con la inoculación de las distintas muestras en agar PDA (agar papa dextrosa) esté siendo divido en tres secciones en cada caja Petri en la caja 1 se dividido en A. niger, muestra de hongo de fresas con crema y negativo (Figura 2), en la caja 2 se dividido en P. canescens, muestra de hongo de pan y negativo (Figura 2.1). FCC

P.canescens

Neg.

Pan Neg.

A.niger Figura 2: Inoculación de las muestras de fresas con crema (FCC) y A. niger en medio PDA.

Figura 2.1:Inoculacion de las muestras de pan y P.canescens en medio PDA

Para la hidrolisis de almidón se realizó la resiembra de las muestras previamente inoculadas en agar almidón, incubándose durante 72 hrs. A 28°C. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se realizó la adición de yodo Lugol al 10% de esta manera, resultado para la muestra de P. canescens hidrolisis de almidón, la muestra de hongo de pan hidrolisis de almidón, la muestra de A. niger hidrolisis de almidón, mientras que para la muestra de hongo de fresas con crema no produjo hidrolisis de almidón. P.canescens A.niger Pan

Neg. Figura 2.2: Prueba de hidrolisis de almidón en medio agar almidón de muestras P.canescens y hongo de pan.

Neg.

FCC

Figura 2.3: Prueba de hidrolisis de almidón en medio agar almidón de muestras A.niger y hongo de fresas con crema (FCC).

Por consiguiente, se realizó la preparación del microcultivo esté siendo desarrolló en una caja Petri de vidrio en el cual se coloco un papel filtro impregnado con glicerol al 10% sobre este colocando una varilla de vidrio doblada en forma de “v”, sobre ella un portaobjetos en el cual fue colocado una porción del medio PDA (Agar papa dextrosa), sobre este se realizo una inoculación por punción de las muestras P. canescens y hongo de pan en una caja Petri (Figura 2.4), así mismo con las muestras A.niger y hongo de fresas con crema en otra caja (Figura 2.5), y colocando un cubreobjetos sobre el medio estos dejándose incubando a 28°C durante 72 hrs. para su posterior utilización. A.niger

P.canescen

Pan

Figura 2.4: Microcultivó de la muestra de P. canescens y hongo de pan con papel filtro impregnado con glicerol al 10%.

FCC Figura 2.5: Microcultivó de las muestras A. niger y hongo de fresas con crema (FCC) con papel filtro impregnado de glicerol al 10%.

Posteriormente se realizó la observación de las distintas muestras al estereoscopio comenzando con la muestra A. niger obteniendo una morfología algodonosa y coloración amarilla (Figura 2.6). Una vez terminado el tiempo de incubación de los microcultivos se procedió a realizar una tinción del cultivo con azul de lactofenol el cual se colocó entre el cubreobjetos y el medio, después observándose al microscopio en objetivo seco débil (Figura 2.7) y seco fuerte (Figura 2.8) en donde puede ser observado con claridad las conidiósporas del hongo.

Figura 2.6: A. niger observado al estereoscopio para la determinación de su morfología.

Figura 2.7: A. niger observado al microscopio con un objetivo seco débil (X10).

Figura 2.8: A. niger observado al microscopio con un objetivo seco fuerte (X40).

La muestra P. canescens obteniendo una morfología algodonosa y coloración amarilla con blanco (Figura 2.9). Una vez terminado el tiempo de incubación de los microcultivos se procedió a realizar una tinción del cultivo con azul de lactofenol el cual se colocó entre el cubreobjetos y el medio, después observándose al microscopio en objetivo seco débil (Figura 2.10) y seco fuerte (Figura 2.11) en donde puede ser observado con claridad las conidiósporas del hongo.

Figura 2.9: P. canescens observada al estereoscopio para la determinación de su morfología.

Figura 2.10: P.canescens observado al microscopio con un objetivo seco débil (X10).

Figura 2.11: P. canescens observado al microscopio con un objetivo seco fuerte (X40).

La muestra de hongo de fresas con crema obteniendo una morfología algodonosa y coloración gris-blanco (Figura 2.12). Una vez terminado el tiempo de incubación de los microcultivos se procedió a realizar una tinción del cultivo con azul de lactofenol el cual se colocó entre el cubreobjetos y el medio, después observándose al microscopio en objetivo seco débil (Figura 2.13) y seco fuerte (Figura 2.14) no se pudieron observar las esporas debido a que se le adiciono glicerol al microcultivo.

Figura 2.12: Hongo de fresas con crema observadas al estereoscopio para la determinación de su morfología.

Figura 2.13: Hongo de fresas con crema observado al microscopio con un objetivo seco débil (X10).

Figura 2.14: Hongo de fresas con crema observado al microscopio con un objetivo seco fuerte (X40).

La muestra de hongo de pan obteniendo una morfología algodonosa y coloración blanca-café (Figura 2.15). Una vez terminado el tiempo de incubación de los microcultivos se procedió a realizar una tinción del cultivo con azul de lactofenol el cual se colocó entre el cubreobjetos y el medio, después observándose al microscopio en objetivo seco débil (Figura 2.16) y seco fuerte (Figura 2.17) en donde puede ser observado con claridad las conidiósporas.

Figura 2.15: Hongo de pan observado al estereoscopio para la determinación de su morfología.

Figura 2.16: Hongo de pan observado al microscopio con un objetivo seco débil (X10).

Figura 2.17: Hongo de pan observado al microscopio con un objetivo seco fuerte (X40).

La muestra S. cerevisae obteniendo una morfología colonia forma circular, elevación umbonada y borde entero (Figura 2.18). Una vez terminado el tiempo de incubación de los microcultivos se procedió a realizar una tinción del cultivo con azul de lactofenol el cual se colocó entre el cubreobjetos y el medio, después observándose al microscopio en objetivo seco débil (Figura 2.19) y seco fuerte (Figura 2.20).

Figura 2.18: S. cerevisiae observada al estereoscopio para la determinación de su morfología.

Figura 2.19: S. cerevisae observado al microscopio con un objetivo seco débil (X10).

Figura 2.20: S. cerevisae observado al microscopio con un objetivo seco fuerte (X40).

DISCUSIÓN DE RESULTADOS •

El Agar Papa Dextrosa (Potato Dextrose Agar, PDA, por sus siglas en inglés), es utilizado para el cultivo de hongos , es un medio de propósito general para levaduras y mohos que puede ser suplementado con ácidos o antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano (Alcalá,2012).

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El crecimiento del hongo Aspergillus niger, presenta las cabezas conidiales de un tono obscuro, se considera que el tono del hongo se da por el azul de lactofenol, este hongo produce un moho negro en vegetales(Alcalá,2012).

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Las diferentes especies se diferencian en tamaño, tasa de crecimiento, textura (aterciopelada, granular, algodonosa) y color de la colonia: verde-amarillento (A. flavus), negro (A. niger), marrón (A. terreus). La coloración aparece casi siempre en todas las estructuras aéreas, tanto en el micelio como en las cabezas conidiales(Alcalá,2012).

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Según Apergillus niger, célula viva responsable de la transformación bioquímica, que asimila diversas sustancias, reproduce y produce enzimas que degradan el almidón (Balanta, 2010).

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El color de las colonias al principio es blanco a amarillo, luego es negro.

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Los conidióforos son de pared lisa, hialina o pigmentada y miden de 1,5 a 3 mm de largo y de 15 a 20 mm de diámetro (Balanta, 2010).

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Las colonias de Penicillium son de crecimiento rápido, filamentosas y vellosas, lanosas o de textura algodonosa (Carillo, 2016).

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La serie Monoverticillata (Bridge et al. 1992) o subgénero Aspergilloides (Pitt & Hocking 1997), comprenden a todos los penicilios monoverticilados. En ellos el estípite suele tener mayor diámetro en la zona donde se implantan las fiálides, sin llegar a ser una vesícula como en el género Aspergillus (Carillo, 2016).

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Una de las principales enfermedades en las fresas es el moho gris causado por Botrytis cinerea, que aparece como una mancha marrón claro o amarillenta hacia el final del cáliz y a los pocos día...