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Resumen de los temas que comprende el segundo parcial de biologia molecular...

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Expresión Génica: Transcripción – Traducción – Modificaciones postraduccionales Conceptos generales Transcripción: Proceso encargado de la síntesis de una molécula de RNA a partir de la información genética contenida en la región codificante de un DNA. Da lugar a una copia de RNA a partir de una secuencia molde de ADN El flujo de información genética es bidireccional debido al proceso de transcripción inversa, utilizan el propio RNA como molde para la síntesis de DNAc mediante una polimerasa de DNA dependiente de RNA Gen: Unidad elemental de la herencia, región física y funcional del genoma que contiene información necesaria para sintetizar una molécula de un polipéptido. // es el conjunto de secuencias de DNA de todo tipo, estructurales (intrones/ exones) y reguladoras, necesarias para codificar un producto génico, sea este un RNA maduro de cualquier tipo o proteína funcional. Región estructural: Determina la expresión real del gen. 2 secuencias -INTRONES; regiones no codificantes de ambos extremos del gen -EXONES incluye regiones codificantes como las no codificantes de ambos extremos del gen. *Se transcribe a RNA precursor o primario *Maduración postranscripcional en eucariotas: se pierden los intrones y los exones se unen linealmente para constituir un RNA maduro o funcional. Región reguladora: Sin función codificante, va corriente arriba (hacia 5´), tiene regiones promotoras encargadas de interaccionar con los factores de transcripción proteicos (para regular el inicio de la transcripción). -

Dos genes pueden ser solapantes, es decir compartir una misma región de DNA, porque cada uno esta codificado en una hebra distinta, o bien incluso a la misma hebra.

-

Productos de los genes: rRNAs se transcribe en RNA precursores que por maduración se fragmenta en rRNAs funcionales, también DNA mitocondrial, cuyos 3 transcritos primarios maduran para dar cada uno varios RNAs

Enzimología de la transcripción: mecanismo de la reacción RNA polimerasa

Terminología Hebra no molde: Extremo 5’-P a la izquierda la hebra superior Hebra molde: Extremo 5´P a la derecha inferior anti paralela, la hebra molde de DNA se transcribe en dirección 3’ --> 5’ Hebra codificante o no informativa (No transcrita): La secuencia de RNAs nuevo es idéntico a la DNA no-molde, salvo por la presencia de U en lugar de T. Hebra no codificante o no informativa, transcrita: hebra de AND molde. DIFENCIAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS: PROCARIOTAS -La molécula de ARNm resultante de la transcripción ya es funcional no necesita maduración postranscripcional, se utiliza inmediatamente como molde para la traducción

-En el mismo compartimiento subcelular, con asociación temporal y espacial entre transcripción y traducción -El ARNm puede comenzar a traducirse antes de acabar la transcripción EUCARIOTAS -El ARN resultante de la transcripción pasa a maduración o procesamiento postranscripcional. -ARNs maduros viajan al citosol para la traducción y hay separación espacial y temporal entre la transcripción y traducción -Necesita de ARNpol-II y promotores ARN POLIMERASAS -PROCARIOTAS Y ORGANULOS: se utiliza un solo tipo de ARN polimerasa para sintetizar los 3 tipos de RNA (ARNm, ARNt y ARNr) -EUCARIOTAS: Tres tipos (I, II, III) sus características diferenciales les confieren un mayor grado de especialización en cuanto a su labor de síntesis de RNA.

Especificidad ARNpoli-1: transcribe el gen del Pre-ARNr “grande” precursor único de 3 de loso 4 tipos de ARNrs r componentes del ribosoma citoplasmático. ARNpoli-II: transcribe todos los genes de proteínas, sintetizando los ARNs nucleares heterogéneos (hnARNs) precursores de los ARNm. es representativa de las polimerasas eucariotas ARNpoli-III transcribe los genes de todos los tARNs sintetizando sus pre-tARNs, y el gen del preARN pequeño que madura dando lugar al 4to tipo de ARNr y los de ARNs pequeños.

Localización: las RNApol se localizan en el nucleoplasma (Pol-II y III) o en el nucléolo (Pol-I), la cantidad de cada tipo es medida como fracción de la actividad enzimática total refleja la demanda de sus productos génicos respectivos: Pol-I es máxima, Pol-II intermedia y casi residual para Pol-III ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCION Para iniciar necesaria la presencia en la hebra molde de la unidad de transcripción, que incluyen la secuencia del ADN que se ha de transcribir y dos secuencias de consenso “promotor (Secuencia TATA) y terminador” En procariotas el termino operón para la unidad de transcripción en procariotas INICIACION -Separación de las dos hebras de ADN, cerca de la secuencia promotora -ARN polimerasa sintetiza un fragmento de ARN (10 nucleótidos) de la hebra molde. -Desenrollamiento del ADN y formación de la burbuja de transcripción (Burbuja de transcripción) -Unión al ADN de proteínas llamadas factores de inicio o de transcripción “Factores de transcripción (TF)” 

EN PROCARIOTAS Y MITOCONDRIAS

-El mismo promotor inicia la transcripción de varios genes continuos a la misma vez, cotranscripción. EN EUCARIOTAS SOLO UN GEN A LA VEZ. - La secuencia TATA es reconocida por la ARNpol indirectamente, previa interacción con los TF’s. Es importante resaltar que, tanto en procariotas como en eucariotas, la iniciación requiere la presencia de la ARNpol completa u holoenzima (ARN bacteriana) FORMACION DEL COMPLEJO DE INICIACION Unión de varios TFs a las regiones promotores del ADN y la enzima que participa en la formación del dominio CTD (parte de la subunidad mayor de la Poli –II) -Modelos de holoenzima: el ARNpol-II se une previamente a los TFs y luego al conjunto se une al promotor -El modelo escalonado, en el que los TFs se van asociando a la región promotora uno a continuación del otro y en un cierto orden. MAS ACEPTADO

DESNATURALIZACION DEL PROMOTOR Ya con el desenrrollamiento y separación de las dos hebras de ADN y el comienzo de la burbuja de replicación o complejo abierto, es el lugar donde va a tener lugar la síntesis de RNA Se requiere la actividad de una ADN-helicasa presente ahora en dos del factor de transcripción TFIIF y TFIIH que necesitan ATP. Y TFIIE que estabiliza la región desnaturalizada del promotor. LIBERACION DEL PROMOTOR: PROCARIOTAS: disociación de la subunidad σ de la holoenzima ARNpol quedando disponible para su interacción con una nueva ARNpol núcleo e iniciar la transcripción en un nuevo promotor. El resto de la polimerasa continúa actuando en la elongación.

EUCARIOTAS: La transición de iniciación a elongación marcada por la fosforilacion del dominio CTD de la ARNpol-II (en la iniciación participo no fosforilada) Esta fosforilacion se lleva a cabo en el Factor de transcripción TFIIH ELONGACION: Complejo de elongación; ADN abierto, ARNpol y el ARN reciente La ARN polimerasa continúa alargando la cadena de ARN y también avanza la burbuja de transcripción. -Delante de las polimerasas se separan las 2 hebras de ADN por ruptura de los puentes de hidrogeno. -La polimerasa alarga el ARN añadiendo nucleótidos al extremo 3´del ARN naciente, El último tramo permanece dentro de la burbuja, apareado transitoriamente como hibrido ARN-ADN. -Detrás de la polimerasa la cadena de ARN nuevo se va separando de la hebra molde de ADN, saliendo de la burbuja y quedando como ARN de hebra sencilla. En el DNA se vuelven a aparear y ocurre el re-enrollamiento o rebobinado de la doble hélice -Necesita factores de transcripción generales de la Elongación (PTE): son proteínas que se agrupan en varios tipos PTEFb y SII evitan la terminación prematura de la elongación, y ELL aumentan la velocidad de la elongación al suprimir las pausas transitorias.

TERMINACIÓN: Al alcanzar las secuencias de terminación, la ARN polimera interrumpe la síntesis de ARN y se separa del ADN. PROCARIOTAS: -Terminación independiente de ρ: ARN en formación, cerca de su extremo 3´”punto de terminación” definido por una secuencia palíndroma (secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) la cual es idéntica si se lee de 5' (5-prima) a 3' (3- prima) en una hebra o de 5' a 3' en la hebra complementaria de la doble hélice.) como consecuencia el ARN forma una horquilla y hace que la síntesis pare -Terminación dependiente de ρ: Presencia de otra secuencia en el ARN rica en C y pobre en G de 50-90nt. Interacciona con la proteína ρ(ro) hexamerica, ya unidas se desplazan en el ARN en sentido 3´hasta alcanzar al complejo de elongación. en este contacto ρ provoca la desnaturalización del hibrido liberando el ARN e interrumpiendo la transcripción TERMINACION EN EUCARIOTAS: Combinación de dos factores o mecanismos: la detención o pausa de la ARN Polimerasa y la desestabilización del Hibrido ARN/ADN. Resultado separación de los componentes del complejo de la transcripción y desfosforilación de la ARN Pol-II para que pueda ensamblarse en un nuevo complejo. En cada polimerasa en diferente ARNpol-I: Una proteína de pausa o terminadora se une al ADN y detiene al avance de la ARN Pol y una región rica en T facilita la separación del ARN, no hay región palindromica ARNpol-II: Se detiene dentro de una región de terminación, puede deberse a secuencias especificas en el ADN o una proteína de pausa en el ADN, es similar a la proteína ρ en procariotas e induce la separación. ARNpol-III: Se detiene en secuencias específicas de ADN, una facilita la separación del ARN

rica en T en la hebra no molde

TRANSCRIPCION DEL GENOMA MITOCONDRIAL Cromosoma circulas humano, se transcribe por una sola ARNpol. Para la iniciación requiere la presencia de un factor de transcripción TFAmt, se transcribe de 3 lugares de iniciación dos para la hebra pesada (H1 y H2) y uno para la ligera (L) Los promotores se encuentran situados en la región no codificante de control o bucle D, H1 y H2 dependen de un mismo promotor o dos independientes (principal y secundario) A partir del primer lugar de iniciación de la hebra pesada (H1) se transcribe ADN que codifica los ARNt, ARNr 12s, ARNt Val y ARN r 16 s. La transcripción se detiene tras este último por el factor de terminación (TERFm). El lugar de iniciación define qué tipo de ARNs, ribosómicos o mensajeros deben sintetizarse, la Estructurales 8% selección esta mediado por hormonas tiroideas. Señalización 12% Defensa 12% CONTROL DE LA EXPRESION GENICA: PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRIPCIONAL División celular 12% Vías metabólicas 17% Expresión génica 22%

La flexibilidad en la expresión génica es la aparición en cada tipo celular de proteínas, en diversas proporciones. Las proteínas condicionan las propiedades celulares, es variable la proporción de genes implicados en la formación de proteínas para una determinada tarea

-accesibilidad del ADN en la transcripción -Condensación de la cromatina -metilación del ADN -Frecuencia /velocidad de inicio de la transcripción *puntos de inicio accesible *factores de transcripción *eficacia de los promotores -velocidad de elongación del ARN (poco regulada) -eficacia de terminación de la transcripción -Velocidad de procesamiento * corte y empalme *modificaciones -maduración alternativa

-Selección de que ARN son transportados -Transporte activo a través de los poros

-estabilidad del ADN Maduro

El acceso al ADN necesario para la combinación de 3 mecanismos:

-frecuencia /velocidad de traducción *selección de que ARNm son traducidos *Eficacia de los complejos de iniciación transcripción es una -velocidad de elongación del polipéptido -eficacia de terminación de la traducción

a) Posición precisa del nucleosoma: posición especifica de los nucleosoma con las regiones de las secuencias promotoras -eficacia de modificaciones postraduccionales del ADN en la región internucleosomica (entre 2 nucleosoma) u orientadas hacia la superficie externa b) Retirada de los nucleosoma: las secuencias promotoras por los factores de transcripción como la unión y avance de ARN Pol necesitan la liberación de histonas o quitar nucleosomas c) Avance compatible con la presencia de nucleosomas: al acercase la ARN Pol, el nucleosoma se desensambla

parcialmente. Una vez que la enzima ha transcrito ese tramo de ADN se reconstruye el nucleosoma La especialización de las ARNpol eucariotas para transcribir solo determinados genes viene determinada por la regulación de estos genes por secuencias promotoras y factores de transcripción diferentes

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Los genes clase II máximo interés porque son los responsables de la síntesis ARNm y todas las proteínas, sus promotores se localizan típicamente en dirección 5´ (corriente arriba) del origen de la transcripción y hay mayor variación de secuencia que los promotores para ARNpol-i y III

ELEMENTOS BASALES DEL PROMOTOR Promotor basal: definen el punto de inicio de la transcripción y sin imprescindibles para que esta comience. En posición comúnmente corriente arriba hasta la posición – 30 esta caja TATA o caja de Hogness, situada en posición -15 a -25 (Caja TATA en procariotas o caja de Pribnow, con secuencia TATAAT en posición -10) Otra secuencia basal es “secuencia iniciadora Inr” situada entre -3 y +5 Caja TATA: TATANAA Secuencia Inr: NYYAN (T/A) YY  N: cualquier nucleótido y Y: piramidinico El promotor basal necesita un “promotor proximal” este cercano al basal pero más alejado corriente arriba del origen, en posición -30 y -200. Mas característicos caja o secuencia CAAT entre -60 y -80 y la caja GC en cualquier orientación a ambos lados de la caja CAAT

ELEMENTOS DISTALES Genes inducibles: no se expresan continuamente en la célula, si no cuya expresión sufre una regulación amplia y precisa como respuesta a diversas señales (con hormonas esteroides y tiroideas). Secuencias promotoras distales, porque están lejos del origen, 2 tipos: -potenciadores: Activadores, intensificadores, amplificadores o estimulador. Aumentan la velocidad de inicio de la transcripción (y por consiguiente el proceso completo) conseguida a partir de los promotores basales y proximales situados en la misma molécula de ADN.

-silenciadores o inhibidores (silencers): tienen el efecto opuesto, generalmente porque los factores de transcripción que se unen a ellos compiten con la acción de los específicos de los potenciadores y proximales. FACTORES DE TRANSCRIPCION GENERALES Los TFs reconocen los elementos basales de un promotor. Se puede decir que al reconocer el promotor basal actúan de mediadores para que se fije a la polimerasa, definiendo así el punto de inicio de la transcripción y activando la enzima para que comience a sintetizar el ARN. Factores de transcripción asociados a la ARNpol-ii: -molécula de TBP o proteína de unión a TATaA: Confiera a TFIID la capacidad de reconocimiento de la secuencia promotora. -TFIIH: doble actividad como helicasa y proteína quinasa, como helicasa separa las hebras del DNA en el sitio de inicio y como quinasa fosforila el dominio C-terminal de la sub unidad mayor de la ARNpol-II, que induce el comienzo de su desplazamiento por el ADN, la separación de algunos TF´s y la elongación de la transcripción FACTORES DE TRANSCRIPCION PROXIAMALES o FACTORES DE UNION CORRIENTE ARRIBA Proteínas que reconocen específicamente los elementos proximales del promotor, contribuyendo a la formación del complejo de inicio o favoreciendo su actividad polimerasa Ejemplo: el CFT (o NF1) interacciona con le caja CAAT siendo aparentemente el máximo responsable de la eficiencia del promotor, mientras que el factor de transcripción SP1 se une a las cajas GC.

*Los promotores que solo contienen elementos reconocidos por TFs generales y proximales controlan a los “genes constitutivos o Genes domésticos o caseros” aquellos que se expresan en todas las células del organismo, codifican los productos que aseguran las funciones indispensables para la vida de la célula.

FACTORES DE TRANSCRIPCION INDUCIBLES: Genes inducibles, regulables o de expresión diferencial: Reconocen los elementos distales del promotor, facilita la formación y actividad del complejo de inicio de la transcripción o dificultándola. Estos factores no están presentes en las células de forma continua, si no que se sintetizan o se activan en momentos específicos en particulares, en algunas ocasiones el del no se expresa nunca. REGULACION EPIGENETICA Este tipo de regulación de la expresión génica, que contribuye a explicar la diversidad morfológica y funcional de celuar con un mismo genoma, depende del llamado componente Epigenética de la estructura del DNA propio de las bacterias Procesamiento postranscripcional o maduración del RNA La transcripción del DNA es un proceso que no difiere, en esencia, entre procariotas y eucariotas: RNA polimerasas se unen a secuencias promotoras específicas, y realiza la síntesis de dirección 5 – 3 a lo largo del gen Transcrito primario – Precursor del RNA: molécula de RNA que resulta directamente del proceso de transcripción. Todos los transcritos primarios tienen la misma secuencia que el fragmento correspondiente de la hebra no-molde (no transcrita) de DNA, salvo por la presencia de U en lugar de T. Existen transcritos primarios para los tres tipos de RNAs en eucariota y tARNs y rRNAs en procariotas. Los precursores de los tres tipos de RNA formados en el núcleo eucariótico no pueden desempeñar directamente su función (RNAm puede utilizarse como molde para traducción), antes han de convertirse en RNA maduro, funcional en un proceso llamado modificación o proceso postranscripcional o maduración del RNA, se da en el núcleo y solo cuando se ha completado pueden las moléculas de RNA transportarse al citoplasma para ejercer su función El proceso postranscripcional consiste en:     

Modificación covalente de nucleótidos Adición de nucleótidos a los extremos Escisión de nucleótidos de los extremos División de la molécula en varios fragmentos Proceso de ayuste, eliminación de intrones, o corte de intrones y empalme de exones

Gen: la maduración postranscripcional es un proceso que da lugar a situaciones en la que la definición de gen debe matizarse o forzarse: Un gen se transcribe dando un pre-RNA, que es procesado por escisión generando varias moléculas de RNA. El transcrito primario obtenido de una región de DNA puede sufrir maduración por dos rutas o variantes distintas dando lugar por ello a dos productos génicos diferentes Características diferenciales de la maduración Gen procariotico: Todo el DNA es codificante (excluyendo la región reguladora) de modo que al transcribirse origina un transcrito primario que y el RNAm de procariotas es el único RNA que no requiere maduración Gen eucariótico: Genera pre RNAm que debe madurar para transformarse en una molécula funcional, el conjunto de los pre-RNAm se llama RNA nuclear heterogéneo debido a que constituye una población de moléculas de tamaño muy variado. Grandes segmentos internos del gen desaparecen durante la maduración (intrones) Intrones: Regiones no codificantes situadas en el interior de un gen (secuencias intercaladas) Exones: Regiones que flanquean a los intrones y conservan en el RNA maduro, parte codificante del gen, pero el primer exón y el ultimo también incluyen las regiones 5 y 3 no traducidas Procesamiento de RNAm: Tres modificaciones que transcurren de forma sucesiva o simultánea en el núcleo Modificación del extremo 5’: El extremo libre 5’ comienza a modificarse poco después iniciada la transcripción. Se trata de una modificación covalente implica tres enzimas (fosfatasa, guanililtransferasa y metilasas) y que conduce a la incorporación singular de un nucleótido sobre NTP en posición 5’ terminal Formación de caperuza o casquete 5’: desfosforilación y guanililacion a costa de GTP La incorporación al RNAm de tan solo un residuo de guanosina (guanosilacion) se dice que el RNAm ha sido guanilado en 5’ dando como resultado caperuza de guanina, caperuza 5’ o casquete 5’, esta ejerce un efecto protector de la molécula frente a las exonucleasas, marca el pre-RNAm para su posterior empleo como sustrato en otra reacción sirve como punto de unión del RNAm a los ribosomas al iniciar síntesis Metilación de la caperuza 5’: los tres primeros nucleótidos de la estructura son modificados por metiltransferasas la metilación sucede sobre varias posiciones: -N-7 de...