Samenvatting 7 PDF

Preview

Summary

samenvatting 7...

Description

Samenvatting 7: inleiding tot de genetica van bacteriën en virussen 1.genetische analyse van bacteriën genetisch materiaal kan overgedragen worden tussen bacteriën door: -

Conjugatie Transformatie Transductie

de overdracht van het genetisch materiaal gebeurt altijd in 1 richting en er wordt nooit een volledige diploïde set gevormd E. coli wordt gebruikt voor genetische analyse: -

Het kan groeien op een simpele, bepaalde bodem Kan behandeld worden met simpele microbiologische technieken Cilinder vormig organisme van 1-3 μm lang en 0,5 μm in diameter Heeft een enkelvoudig circulair DNA chromosoom Kan groeien op een vloeibaar medium en vaste voedingsbodem Komt veel voor Hoog delingsratio Zijn haploïd  hierdoor heeft een mutatie vaak een direct waarneembaar effect op het fenotype Het is makkelijk om mutanten te identificeren en te isoleren uit een populatie van wilt-type bacteriën door gebruik te maken van een verandering in de omgevingsfactoren (=selectiedruk)

- selectiedruk = een verandering in de omgevingsfactoren en welke bacteriën er dan zullen overleven. De bacteriën die het beste zijn aangepast door mutaties zullen overleven al de andere of andere mutaties zullen het niet overleven Vb. antibiotica toevoegen  alle bacteriën die niet resistent zijn gaan de dood, dit zijn het wild-type de rest blijft leven, de gemuteerd - genetische analyse gebeurd door een bacterie op een voedingsbodem te plaatsen  er ontstaat een kolonie = Een kolonie bestaat uit gekloneerde cellen, elk van hen is genetisch identiek aan de ouderlijke cel dat de start was van de kolonie. - een kolonie verdunnen is nodig zodat de kolonies apart gaan kunnen groeien en mutaties van aparte kolonies waargenomen kunnen worden - elke bacteriële soort heeft zijn eigen karakteristieke minimale medium waarop het nog kan groeien = de minimale set van chemische stoffen die nodig zijn voor het organismen om te kunnen groeien en overleven Bv. E. coli heeft suiker, zout en bio elementen nodig -

Van het minimale medium kan het organisme de andere componenten die hij nodig heeft maken vb. aminozuren, vitamines en precursoren voor DNA en RNA

het complete medium bevat vitaminen, aminozuren en alle andere bestanddelen die een organisme nodig heeft  de biosynthese zou door mutaties kapot gemaakt kunnen worden auxotrophs = gemuteerde soorten die hun essentiële voedingsstoffen niet zelf kunnen maken

1

prototroph = wild-type soorten die hun essentiële voedingsstoffen wel zelf kunnen maken  hebben geen voedingsstoffen nodig op hun groeibodem  kan groeien op een minimaal medium lac+  kan lactose maken Lac  kan lactose niet maken ( is gemuteerd) in genetische experimenten worden er kruisingen gemaakt tussen soorten met een verschillende genotype (dus ook een ander fenotype)  de nakomeling worden dan geanalyseerd replica platting (=stempeltechniek) = de bacteriën van een kolonie worden gezet op een steriele, fluwelen doek op een schotel  als ze op een minimale bodem worden gezet zijn het prototrophische kolonies die zullen overleven  als we ze vergelijken met de eerst kolonie kunnen autotropische ontdekt worden omdat deze op de oude plaat wel aanwezig zijn en op de nieuwe plaat niet meer Op deze manier kunnen de genotypes van alle auxotrophische kolonies onderzocht worden

2

2.transfer van genetisch materiaal tussen bacteriën er zijn 3 mogelijke processen waardoor genetische informatie horizontaal kan overgedragen worden: conjugatie, transformatie en transductie -

2.1

Sommige van deze processen worden gebruikt bij de genetische manipulatie of voor het opstellen van de genetische kaart van bacteriën

conjugatie en transformatie

2.1.1 conjugatie = een 1 richtingsverkeer van het overdragen van genetische informatie door direct cellulair contact tussen een donor en een recipiënt bacteriële cel  



Het contact wordt gemaakt door een fysische brug tussen de cellen Een segment van het donor chromosoom kan overgedragen worden naar de recipiënt cel en kan daar genetische recombinante met een homoloog chromosoom segment van die cel ondergaan Transconjuganten = recipiënte cellen die een deel van het DNA van een donor cel in hun chromosomen hebben opgenomen

ontdekking 1?  2 E.coli bacterie soorten met een verschillende voedingsbenodigdheden bestuderen -

A  kan groeien als er methionine en biotin aanwezig zijn B kan groeien als er threoinie, leucine en thiamine aanwezig zijn

-

Een mengels van A en B en zette het op een minimale bodem  Er ontstonden prototrophe in een frequentie van 1/10 miljoen cellen  Er zijn recombinanten ontstaan van A en B om te kunnen overleven

- ontdikking 2? -

Een mengsel van A en B in een vloeibaar medium in een U-vormig buis en de beide soorten worden gescheiden door een filter met te kleine poriën voor de bacteriën  De kolonies werden op een minimaal medium gezet  er waren geen prototrophe kolonies

er is cel-cel contact nodig om genetische informatie uit te wisselen ( E.coli doet aan conjugatie)

3

A.de geslachtsfactor F de overdracht van genetische informatie gebeurd via een geslachtsfactor (sex factor) = F factor -

Donor cel = F+ Recipiënt cel = F-

bij de E.coli is de F factor een plasmide dat circulair is en aan zelf-replicatie doet -

Bevat een origin = de plaats waar de DNA overdracht naar de recipiënt begint Bevat genen voor een F-pili = maakt het fysieke contact tussen de cellen

als F+ en F- cellen gemixt worden kunnen ze aan conjugatie doen -

Geen conjugatie mogelijk tussen 2 dezelfde paringstypes Er is enkel overdracht van het plasmide niet van het genoom zelf

-

Een F+ cel maakt contact via een F-pilus met een F - cel De 2 cellen komen dichter bij elkaar en er wordt een cytoplastische brug gevormd Rolling circle DNA replicatie begint Als de enkelstrenige DNA plasmide in de F- cel komt zorgt DNA polymerase voor de andere streng Er ontstaan 2 F+ cellen

-

4

B.hoge frequentie van recombinatie bij soorten van de E.coli speciale vorm van de F+ soorten  Hfr (=hoge frequentie recombinatie) een cel die een deel van het plasmide in het bacteriële genoom heeft opgenomen -

Ontstaan door een cross-over tussen de F factor en het bacteriële genoom F factor in het genoom = episoom en kopieert zich niet meer onafhankelijk van het genoom

-

Overdracht tussen een Hfr x F- geeft bijna nooit een F+ cel omdat de F factor niet helemaal wordt overgedragen omdat het kopiëren veel te lang duurt en bijna nooit zal afgemaakt worden µ

C.

F’ factoren

- het uitsnijden van de F factor uit een Hfr cel is niet altijd juist  F factor bevat dan een aangrenzend deel van het bacteriële genoom -

De F factor kan op verschillende plaatsen in het bacteriële genoom inkomen  er kunnen verschillende delen van het bacteriële genoom zo mee worden opgenomen

vb. bij de F factor zit het gen lac+ mee in de loop en door crossing over komt dit gen bij de F’ factor (F prime) -

Bij F+ x F- overdracht wordt het lac+ gen dus mee overgedragen en de F- cel wordt dus ook een F’ en heeft dat geen 2 keer (=diploïd) Deze typische conjugatie = F-productie ( F-duction) 5

2.1.2 transformatie = een 1 richtingsverkeer van het overdragen van genetische informatie dat resulteert in een verandering van het fenotype in de recipiënt

wordt gebruikt om genen te ‘mappen’ als conjugatie en transductie niet werken -

DNA van een donor cel wordt onttrokken, gezuiverd en gebroken in kleine fragmenten Deze fragmenten worden in een recipiënt cel met een ander genotype gebracht  een recombinant chromosoom kan ontstaan door recombinatie met homologe delen Als het fenotype bij Recipiënt cellen is veranderd worden ze transformanten genoemd

niet elke bacteriële soort heeft de eigenschap om DNA te kunnen opnemen -

Om dit te verbeteren worden de cellen chemische behandeld of blootgesteld aan een elektrisch veld (=elektroporatie) om het membraan meer permeabel te maken voor DNA Competente/bevoegde cellen = cellen die voorbereid werden om DNA op te nemen

er zijn 2 vormen van transformatie: -

-

2.2

Natuurlijke transformatie (=natural transformation)  bacteriën kunnen van nature uit DNA opnemen en worden daardoor genetische getransformeerd Vb. bacillus subtilis Ontworpen transformatie (=engineered transformation)  bacteriën worden gewijzigd om DNA te kunnen opnemen en worden dan genetische getransformeerd door het DNA Vb. E.coli

transductie

= proces waarbij bacteriofagen genen overdragen van de donor naar de recipiënt - deze bacteriofagen worden fagen vectoren genoemd - slechts 1% van het bacteriële chromosoom kan overgedragen worden - traductans = recombinante recipiëten

2.2.1 bacteriofagen Een faag bestaat uit een enkel chromosoom met DNA of RNA en wordt omgeven door een mantel van proteïne kwaadaardige (virulent) fagen volgen de lytische cyclus veel bacteriën worden met minder fagen op een petrischaal gebracht  plaques ontstaan waar de fagen de bacteriën infecteren

6

- lytische cyclus: -

Een λ virus infecteert een gast cel met zijn DNA en neemt de functie van de cel over Het geïnfecteerde DNA kopieert zich onafhankelijk voort Hieruit wordt er dan mRNA gemaakt die gaat coderen voor de proteïnen om de mantel van het virus te maken De circulaire plasmiden worden nu lineair Als de cel dan openbreekt (=lysed) komen de nieuw gevormde virussen vrij

lysogenische cyclus: -

Een λ virus infecteert een gast cel met zijn DNA Het DNA fragmentje versmelt met het chromosoom van de gast cel en gaat zo telkens mee gekopieerd worden = profaag ( zo wordt het chromosoom van de faag genoemd) Het geïnfecteerde DNA fragment kan er ook terug uitgeknipt (=excisie) worden en dan verder gekopieerd worden via de lytische cyclus

lysogenisch voor de fagen = bacterie die een profaag bevat lysogeny = fenomeen waarbij het chromosoom van de fagen geïnsereerd word in de bacterie matige fagen (=temperate phage) = fagen die de keuze heeft tussen de lytische en de lysogensiche cyclus als de profage stage wordt vernietigd door omgevingsfactoren bv. UV, bestraling dan gaat de fagen over van de lytisch naar de lysogensiche cyclus 7

2.2.2 transductie mapping van bacteriële chromosomen transductie kan gebruikt worden om bacteriële genen te mappen 2 vormen van transductie: -

Veralgemeende transductie (=generalized transduction) elk gen kan overgedragen worden Gespecialiseerde transductie (= specialized transduction)  enkel specifieke genen kunnen overgedragen worden

A.veralgemeende transductie - ontdekking ? -

2 verschillende auxotrophe rassen worden samen gebracht  er werden prototrophe recombinante in een lage frequentie aangetroffen Ook al gebruikte ze de U-vormige buis er werden prototrophe aangetroffen  er is dus geen cel-cel contract nodig voor transductie  een filtreerbaar middel zorgt voor de transductie ( kan door de filter in de U-vormige buis  bij het experiment was het filtreerbaar middel  temperate fage P22 - proces =

-

-

de lysogenische cylus gaat niet door  de fagen gaat door de lytische cyclus een deel van het bacteriële DNA wordt verpakt in een fagen = transductie fagen  = ‘voertuigen waarbij genetische informatie van de bacterie wordt overgedragen naar een andere bacterie de cel barst open en de fagen kunnen andere cellen gaan infecteren als de donor en de recipiënt cel een verschilt gen bevat bv. a en a+  er gebeurd prototrophe transductantie  a+ = gekozen marker (selected marker)  omdat de cel dan kan groeien op een minimale bodem omdat deze a nu zelf kan maken

de DNA fragmenten worden willekeurig in de fagen gebracht 8

B.

gespecialiseerde transductie

- de bacteriofaag kan slecht een beperkt aantal genen van bacteriële chromosoom meenemen als het genoom van de bacteriofaag er terug wordt uitgeknipt - vb. faag λ  infecteert een E.coli - tijdens de lysogenische celcyclus, integreert het genoom van λ zich in het bacteriële genoom op een

specifieke plaats tussen het gal gen en het bio gen  produceert een lysogen de plaats waar λ integreert noemt aatλ op het E.coli genoom is homoloog aan de aat bij het λ DNA  gebeurd door een enkele crossing-over  faag = nu profaag als de crossing over gebeurd op een niet-homologe plaats  abnormaal circulair DNA product

3.genetische recombinatie als een stukje DNA in een bacterie terechtkomt door transformatie, conjugatie of transductie kunnen er verschillende dingen gebeuren: -

binnenkomend DNA = plasmide (bv. F-factor) dan kan het zich onafhankelijk repliceren en wordt het aan de nakomelingen doorgegeven als de bacteriecel deelt binnenkomend DNA kan niet delen ( heeft geen ‘origin of replication’)  kan alleen worden doorgegeven aan de nakomelingen als het een deel wordt van het bacterieel genoom, anders zal het verloren gaan in de populatie

9

DNA wordt geïncorporeerd in het bacterieel genoom door homologe recombinatie  dubbele crossing-over tussen homologe sequenties in het bacterieel DNA en in het DNA dat binnen kwam -

is belangrijk voor genetische variatie te creëren binnen een populatie ( bij eukaryoten en prokaryoten) genetische variatie is voor een soort van essentieel belang omdat die de soort in staat stelt zich aan te passen aan veranderingen in het milieu bij eukaryoten is het een essentieel onderdeel van de meiose (profase 1) uitzonderlijk treed het ook op tijdens de mitose bij eukaryoten  breuk als gevolg van DNA- beschadiging (vb. door X-stralen)

soms komt ook niet-homologe recombinatie voor -

sequenties waar deze recombinatie optreedt worden herkend door enzymen vb. insertie van transposons in het genoom met behulp van het enzym transposase

4.extra informatie uit de studieleidraad er bestaan ook R-plasmiden  zijn drager van 1 of meerdere genen voor resistentie tegen een bepaald antibioticum -

kunnen ook worden overgedragen door conjugatie  hierdoor kan de resistentie snel verspreid worden over grote populaties, zeker als de bacteriepopulatie bloot staat aan een selectiedruk ( vb. overmatig gebruik van antibiotica in de geneeskunde en de veeteelt)

types van bacteriële mutanten: -

antibiotica-resistentie voedinsstoffen (kunnen niet meer groeien op een minimale bodem) koolstof bron ( kan het niet meer gebruiken) auxotrophe prototrophe...