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TEMA 2. DIAGNOSTICO GENETICO INTEGRADO TECNICAS DIAGNOSTICAS Todo lo que lleve vivo (muestra fresca) puede ser cariotipado en el laboratorio, todo lo que llegue parafinado no. Sirve para ver que marcadores cromosómicos hay en determinados síndromes o en un tipo de cáncer. Tiene una limitación: todo lo que este por de bajo de 5 Mb no lo ve.   

TECNICAS DE CITOGENETICA CONVENCIONL (cariotipo de bandas) CITOGENETICA MOLECULAR FISH (convencional y derivados) BIOLOGIA MOLECULAR (PCR, secuenciación..)

Un laboratorio tiene que tener integradas las 3 técnicas para poder buscar el marcador correspondiente dependiendo de a enfermedad que sea. No todas se usan en la rutina. Técnicas de Análisis genético: EN CONTINUA EXPANSION DIAGNOSTICO CITOGENETICO CONVENCIONAL: CARIOTIPO DE BANDAS G Izq: metafase Dcha: cariotipo de bandas G ordenado

Realizar cariotipo con bandas en:  ENFERMEDADES CONSTITUCIONALES (PRENATAL, POSTNATAL)  ONCOHEMATOLÓGIA (LEUCEMIAS Y LINFOMAS)  TUMORES SÓLIDOS (COLON, MAMA, VEJIGA………) Esquema de trabajo en una laboratorio de citogenética convencional (cariotipos): constitucionales y adquiridas Desde que llega a una muestra hasta que redactamos el informe. 1. Recepción de muestra (dar de alta y valorar el tipo de muestra)

2. Criterio para realizar el cariotipo (tipo de técnica, medio de cultivo, tiempo) 3. Puesta en cultivo (preparación de medios, …) 4. Cosechado(obtención de metafases, extensiones) 5 Tinción de bandas (bandas G, otras) 6. Mirar a microscopio(recuento cromosomas, fotografiar metafases) 7. Recortar metafases. Preparar cariotipo 8. Diagnóstico citogenético (normal o anómalo) 9. Describir alteraciones con ISCN (fórmulas) 10.Redactar el informe citogenético EL CARIOTIPO Es la aproximación citológica a la genética, que consiste principalmente en el estudio de los cromosomas al microscopio. - En enfermedades constitucionales, la citogenética refleja la estructura cromosómica que ha sido heredada y que a su vez será transmitida a la descendencia (presente en todas las células o en mosaico). ALTERACIONES CONSTITUCIONALES - En el cáncer la citogenética refleja la constitución cromosómica de las células neoplásicas (presente en todas las células del órgano afectado o en clones ). ALTERACIONES ADQUIRIDAS - La fase más adecuada para este estudio es la metafase. CARIOTIPO HUMANO Es la disposición ordenada de los 22 pares de cromosomas metafásicos autosómicos y el par sexual de acuerdo a unos criterios de ordenación como son su longitud y la disposición del centrómero y patrón de bandas. (46,XX y 46XY). CROMOSOMAS HOMOLOGOS: los 22 pares uno paterno y uno materno. En un paciente con leucemia solo tiene una alteración heterocigótica, es decir solo en un cromosoma homologo. Cuando son alteraciones homocigoticas, aparecen en los dos cromosomas homólogos (poco frecuente). LOCUS; LOCI, ALELOS Si la delección afecta a los dos alelos, la proteína que producía ese gen ya no existe. ¿Que contiene un cromosoma? Aparte del núcleo tiene proteínas en un estructura llamadas cromatina. Cuando queremos hacer cromosoma queremos digerir las proteínas y que el cromosoma aparezca como un patrón de bandas. Los 22.000 genes están repartidos en todos nuestros cromosomas. El cromosoma que mas genes tiene es el 1, seguido del 2 y seguido del 19. Cualquier anomalía cromosómica que afecte al 19 tendrá mucho impacto clínico porque dañara muchos genes.

A pesar de que los cromosomas se ordenan por tamaño el numero de genes no coincide en absoluto. Las hebras que corresponden a los cromosomas con mas genes están en el centro y en la periferia están las zonas con menos contenido de genes. MORFOLOGIA DE LOS CROMOSOMAS Cada brazo tiene 2 cromatidas hermanas. No las vemos separadas sino que aparecen los dos brazos como uno solo. Las traslocaciones que afectan a zonas telomericas son peligrosas porque es una zona blanca, si se rompe o se trasloca con otra zona blanca de otro cromosoma es muy difícil. Lo que define a un cromosoma: • tamaño • posición del centrómero • posición de las constricciones secundarias • distribución de la heterocromatina constitutiva • distribución de las bandas GRUPOS DE CROMOSOMAS HUMANOS El cariotipo se divide en 7 grupos aparte de los sexuales: - pares METACÉNTRICOS: 1,3,19,20 tiene igual tamaño p y q - ACROCENTRICOS: sin brazo corto: 13,14,15,21,22 y el Ytranslocaciones robertsonianas - SUBMETACENTRICOS: 2, X, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,16,17,18 CROMOSOMAS ACROCENTRICOS Pueden aparecer con satélites o no. Hay 3 cromosomas muy importantes : 1, 9, 16 y el Y (cuando esta) tiene una zona grande de cromatina constitutiva normalmente debajo del centrómero en el brazo largo. Es muy normal que la zona debajo del centrómero varia en tama ño, pero es cromatina inactiva. Un cromosoma 9 tiene un tamaño mayor que el otro por tener esa zona mas grande no tiene nada que ver con una patología, es un polimorfismo cromosómico sin ninguna repercusión clínica. El hecho de que tenga un Y mayor o menor tampoco. SATELITE: constricciones secundarias y tallos que contienen copias de ADN ribosómico.

PATRON DE BANDAS G EN HUMANOS : IDIOGRAMA Es un patrón de bandas en un esquema. hay distintos niveles de resolución. RESOLUCION DE BANDAS: 350,400,550,700,850: Veremos distintos niveles de resolución de bandas. Resolución de las bandas: 350,400,550,700,850. El mismo cromosoma puede tener una banda susbdividida en dos etc… depende de la técnica que uses. Normalmente trabajamos con la resolución de 350 bandas en las adquiridas, aunque en las constitucionales subimos hasta 550 para que no se nos escape ninguna alteración pero podríamos subir a 650.

¿CÓMO SE CROMOSOMAS? -

ORDENAN

LOS

Tamaño del cromosoma y posición del centrómero Patrón de bandas G (establecido en la conferencia de Paris en 1971).

Imprimir: metafase de bandas G y definimos que cromosomas es. (PREGUNTA DE EXAMEN) SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS

1 . RECEPCI ÓNDEMUESTRA( DARDEAL T AYVAL ORARELTI PODEMUEST RA) ¿Quién TRAE LAS MUESTRAS? Tiene que llegar la muestra si es nacional por un servicio de mensajería que sepa que tiene que llevar las muestras en condiciones (en el día, desde la extracción). Si vienen de pamplona puede venir en bici o moto y el resto en un mensajero. Las muestras llevan a un tubo de poliespan ligeramente refrigerado pero no debe estar en contacto con el frasco. Ideal en el dia, si viene de internacional el método de refrigeración debe extremarse y no deben pasar mas de 48h. El mensajero debe saber que es material biológico bien etiquetado, alguno de los pacientes pueden tener SIDA, hepatitis… es un riesgo biológico Al lado del recipiente debe llevar una hoja de petición donde se expliquen los datos del paciente, el diagnostico probable para saber que hacer… Todo lo que necesitemos para identificar al paciente y su patología Las muestras que deben llegar: para hacer un cariotipo hace falta el tubo verde: es un tubo con heparina de litio o de sodio. LA heparina es un anticoagulante. Si quieren un cariotipo no pueden mandar tubo de EDTA (tubo lila) ya que este se usa para biología molecular. El EDTA inutiliza las células para crecer. (EXAMEN) El tipo de muestra: si pide análisis genético par una patología constitucional hace falta sangre.  Para diagnostico de enfermedades constitucionales: sangre periférica  Para diagnostico de leucemia y linfomas: aspirado medular (medula ósea) Para medulas, hematológicas, leucemia…hay que hacer un punción de la médula ósea. La médula la pasan al tubo verde si es para cariotipo. AMNIOCENTESIS (LIQUIDO AMNIOTICO) •La amniocentesis consiste en la extracción de líquido amniótico. •Se realiza generalmente alrededor de la semana 16. •Se extraen entre 10 y 20 mL de líquido, que son suficientes para la mayoría de los estudios. •El líquido amniótico contiene células fetales que pueden ser estudiadas. •Sin embargo, para el análisis de DNA, con la nueva tecnología de amplificación de DNA (PCR) pueden ser suficientes incluso cantidades inferiores a 1 mL. Se hace cariotipo prenatal y recibimos liquido amniótico que se pone tal cual en cultivo. Ahora en prenatal se hace no invasivo cogiendo una muestra de sangre periférica de la madre ara buscar el ADN fetal. BIOSIA DE CORIONNO BIOSPIA DE VELLOSIDADES CORIONICAS: procedimiento trancervical o transabdominal.

MUESTRAS BIOLOGICAS EN TUMORES SOLIDOS: Si llegan muestras de tumores solidos llegan frescos o parafinados. Si llega una biopsia fresca te meten antibiótico y suero fisiológico y pueden hacer cariotipo. Si pasa por patología y la meten por parafina la podemos cortar. TIPO DE MUESTRAS PARA CITOGENETICA CONVENCIONAL (CARIOTIPO) CELULAS VIVAS

ALTA AL PACIENTE Cuando la recepción de muestra está comprobada, se da de alta al paciente Cuando llega se usa un sistema de gestión llamado GESTLAB, damos de alta al paciente y se le asigna un numero. SE LE ASIGNA UN NÚMERO DE INDIVIDUO Y NUMERO DE CULTIVO. Se abre un sobre que contendrá su historia

2 . Cr i t e r i opa r ar e a l i z a re l c a r i ot i po( t i podet é c ni c a , me di odec ul t i v o, t i e mpo) Leemos la petición y dependiendo de eso se decide. Hay que poner la sangre en cultivo en un medio de cultivo concreto 5 ml de un medio concreto que simula las condiciones de cuando esta vivo y se va a incubar de 24 a 72 horas en una estufa para que haya rondas de mitosis (condiciones estériles en cámara de flujo laminar). Hay que ver si es tejido (medio de cultivo en suspensión), biopsia (tubos adheridos en monocapa) El numero de días de cultivo depende de si es tejido liquido (1 a 3 dias, para hacer cariotipo constitucional) o solido (7-10 días de cultivo). Lo dejamos en la estufa a 37ºC durante los días correspondientes.

Para hacer un cariotipo de constitucional o leucemias llegan 3 días de cultivo. Si el tejido es sólido se necesitan unos 10 días. Las biopsias se cultivan en tubos adheridos en monocapa. También hay cultivos en suspensión

3 . Pue s t ae nc ul t i v oENCONDI CI ONESESTÉRI LES( pr e pa r a c i óndeme di os , t i podec ul t i v o…)

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO Ver protocolo de preparación de medios (en ADI) - Medio para linfocitos (estimulado con Phitohemaglutinina) RPMI - Medio para linfocitos (alta resolución) CHROMOSOME SYNCHRO P: los cromosomas salen mas largos y podemos hacer bandas de alta resolución - Medio para médulas ( sin estimular) McCoy - Medio para médulas (estimulado con TPA)……..McCoy fotosensible - Medio para prenatal: RPMI u otros. En frascos de cultivo de fondo plano de 30mm de diámetro se vierten 5mL de medio de cultivo completo con una pipeta graduada. Cada tejido tiene un tipo de medio de cultivo Si pongo en cultivo una medula no hace falta que la estimule para que entre en mitosis, se dividen solas si son leucemias. El medio para medulas no se estimula con ningún antígeno (son cancerosas). En cambio, en los linfocitos, por sistema los linfocitos T (de los que hacemos el cariotipo) si no hacemos nada no se están diviendo al ritmo que necesitamos, se estimulan con un mitogeno concretamente citohemaglutinina. Hay excepciones en cáncer porque hay patologías crónicas y agudas. Es menos grave porque las células no tienen un ritmo de división tan elevado y en determinadas patologías crónicas debemos estimularlo para hacer el cariotipo. La única excepción es una patología y un mitogeno el TPA que es un mitogeno que estimula células B, en lugar de las T.

PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO (EN CONDICIONES ESTERILES) MEDIO DE CULTIVO ( RPMI, McCoy…..) 20% de SUERO FETAL BOVINO Glutamina ANTIBIOTICO (gentamicina). Depende de los laboratorios y los tejidos se puede usar uno u otro tipo. Una vez preparado, se aliquota (5 ml) en frascos de cultivo y se conserva a - 20ºC hasta su uso. En frascos de cultivo de fondo plano de 30mm de diámetro se vierten 5mL de medio de cultivo completo con una pipeta graduada. Hace falta alicuotar y conservar a -20ºC. 1)PUESTA EN CULTIVO DE MUESTRAS QUE CRECEN EN SUSPENSION Para hacer un cariotipo constitucional tienen que pasar 72 horas de cultivo (3 dias). Sin embargo, las medulas oscilan para tener mitosis entre 24 y 72. Las mas graves utilizo 24 horas y en las crónicas 72 horas (poca división).

2) PUESTA EN CULTIVO DE MUESTRAS QUE CRECEN EN MONOCAPA LA biopsia crece en monocapa.

4 .Cos e c ha do VER PROTOCOL OS EN ADI( obt e nc i ón d e me t a f a s e s , e x t e ns i one s ) CULTIVO COSECHADO Cogemos el tubo y detenemos la metafase (interfaseprofasemetafase y se detiene) El cosechado comienza añadiendo un agente mitótico (la colchicina). Primer tubo: células vivas deteniéndose en metafase. Coque hipotónico, se fijan las células. Obtenemos un porta que miramos al microscopio. 1. Añadimos colchicina , se rompe el huso mitótico y las células no entran en anafase sino que se detienen en metafase en el plano ecuatorial estando la célula intacta. Inhibe la formación del huso acromático. Las células se detienen en METAFASE 45 minutos en estufa* (tiempo variable). Añadimos unas gotas de colchicina, agitamos y vuelven a la estufa los frascos 45 min. Da tiempo a que las células que se están dividiendo se detengan en metafase (puede haber nucleos que no hayan entrado en mitosis). Sacamos las células de la estufa y las pasamos a un tubo de centrifuga, que tiene las células completas vivas pero detenidas en metafase. 2. añadimos choque hipotónico, una solución de cloruro potásico (Rompe la membrana de la célula: obtenemos núcleos) y lo dejamos 12 min en la estufa, durante los cuales las células se llena de agua explotan y se quedan solo los núcleos sin dividir y metafases. 3. Fijacion: ahora vamos a fijar esas células. Se añade un ronda de fijación: fijador de Carnoy metanol-acetico (3:1) para conservar el material (las células). Conservación del material Obtenido, Células fijadas No vivas. Se centrifuga y se vuelven a fijar. El proceso se repite 3 veces y se retira el sobrenadante (3 veces). En el pellet quedan las metafases y los núcleos que no se han dividido. El pellet seran los núcleos y se va limpiando y pasa de ser rojo a ser blanco. 4. Realización de las extensiones y Tinción convencional (ver calidad). Después tinción con bandas. Pasamos a hacer extensiones cogiendo un poco de fijador. Y lo añadimos a un porta donde están las metafases o núcleos no divididos. Con este porta hago bandas pero antes hacemos un tinción convencional rápida (giemsa) para ver si el paciente tiene metafase. Hacemos un tinción convencional de precaución para ver como ha ido el cosechado. Examinamos al microscopio (Se observa la calidad de las preparaciones (metafases, morfología de los cromosomas etc….) y queremos metafases bien hechas para poder contar. Vista la calidad adecuada de las preparaciones se realizan las extensiones de cada paciente.

5T i nc i ónd eba nda s( ba nda sG, o t r a s ) Teñir con bandas supone someter a los cromosomas mitóticos a una serie de tratamientos: • desnaturalización (tratamiento con calor) • digestión enzimática de la cromatina (tripsina) • incorporación de colorantes específicos de DNA (Giemsa)  bandas transversales claras y oscuras TECNICAS DE BANDAS DE LOS CROMOSOMAS   

  

Bandas G: digestión controlada con tripsina y tinción con Giemsa. Las bandas oscuras son las bandas G (GTG). LAS MAS UTILIZADAS Bandas Q: tinción con quinacrina y observación en un microscopio de fluorescencia. Las bandas fluorescentes son las bandas Q (iguales a las G) (QFQ) Bandas C: Desnaturalización con hidróxido bárico y tinción con Giemsa. Tiñen la heterocromatina constitutiva (CBG). LAS BANDAS C DE LOS CROMOSOMAS 1, 9, 16 e Y son morfológicamente variables (polimorfismos). Sin repercusión clínica Bandas R: Desnaturalización parcial por calor (regiones AT) BrdU y tinción con Giemsa. Patrón reverso a las G (RHG ó RBG) Bandas T: Son bandas R concentradas en los telómeros. Tratamiento de calor particularmente severo y Giemsa. (T Bandas NORs: Son bandas que tiñen las regiones de los organizadores nucleolares. Tinción con plata

Las que mas usamos son las G y a veces las C ( de centrómero, para los polimorfismos explicados anteriormente).

Una vez tienes las bandas hechas las tiñes con GIEMSA. PROTOCOLO BANDAS G (ADI)

6 . Mi r a rami c r o s c opi o( r e c u e nt oc r omos oma s , f ot ogr a fia rme t a f a s e s ) Para diagnosticar correctamente a un paciente: Con un microscopio con una cámara asociada se debe mirar un mínimo de 25-30 metases por paciente para hacer un informe citogenético correcto. No podemos hacer un cariotipo con 5. Mirar ejercicio para examen de la diapositiva.

7 . RECORT ARMET AF ASES:PREPARARCARI OTI PO De las 30 metafases miradas se fotografían de 8 a 10 y se recorta el cariotipo. De estas fotografías se hace el cariotipo. La cámara esta integrada en el microscopio y conectada a un software (En la especie humana: 46 cromosomas: 22 parejas de autosomas y 2 cromosomas sexuales.) TIPOS DE ALTERACIONES 1. NUMERICAS 2. ESTRCTURALES 3. CONGENITAS (CONSTITUCIONAL) 4. ADQUIRIDAS ALTERACIONES CROMOSOMICAS NUMERICAS 

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Aneuploidía: Pérdida o ganancia de uno o varios cromosomas (sin llegar al número haploide completo) con respecto al número diploide. Uno o varios cromosomas de más o de menos. Euploidía o Poliploidía: Alteraciones en el número de juegos haploides o guarniciones cromosómicas

ANEUPLOIDÍA  Nulisomía  2n-2 ( SE HAN PERDIDO 2 DEL MISMO, LE FALTAN LOS DOS CROMOSOMAS 8, TIENE 45 CROMOSOMAS)   Monosomía 2n-1  Trisomía  2n+1: 47 CROMOSOMAS, DEUN PAR HAY 3 EN VEZ DE DOS.  Tetrasomía : hay dos del mismo ( de uno hay 4) ÑJDNDJONDJEBDKJFBJRBFJFBJRBFJOFBFKQNBDJEBEJBJEBBD BGGF AHAHHAHA: HA:Y DOS DEL MISMON+2 EUPLOIDÍAS  Diploidía 2n  Poliploidías -  Triploidía 3n: 3 de cada - Tetraploidía 4n Un paciente 2N-1-1, ES UN DOBLE MONOSOMICO PIERDE UNO DE LA PAREJA DE DOS (pierdes dos cromosomas diferentes).

ALTERACIONES CROMOSOMICAS ESTRUCTURALES  Deleciones (las de menos de 5MB no se detectan)  Alteraciones cromosómicas estructurales  Duplicaciones  Inversiones:  Pericéntrica o Paracéntrica  Translocaciones  Isocromosomas  Cromosomas en anillo Un cromosoma puede perder material (delecion), duplicar material (duplicación) romperse en un punto , o en otro y darle la vuelta (inversión). Las pericentricas son que un punto es en el p y otro es en el q y al dar la vuelta afecta al centrómero y puede cambiar la forma. A las paracentricas se rompe dos trozos en p o en q y se da la vuelta, no afectan al centrómero y no se modifica la forma. Las traslocaciones son que se

rompen dos cromosomas y se intercambia el material. Si hay intercambio exacto del material el genoma tiene todo pero en otro sitio (translocación equilibrada) pero puede haber perdidas o ganancias (desequilibrado) Los isocromocomas, (ej: cromosoma 8), se rompe el centrómero, el brazo corte e pierde y el largo se duplica; da lugar a in isocromo de brazo largo, que es desequilibrado porque tiene 3 veces el cromosoma largo y una vez el corto (ej: cromosoma 17) ahora tenemos un isocromosoma de brazo corto. CAMBIOS ESTRUCTURALES: equilibrado y no equilibrados Perdida de material genetico; puede haber una deleccion terminal (en el examen) o intersticial. I. Pérdida de material genético: deleccion y monosomia II. Ganancia de material genético: duplicación y trisomía III. Relocalización de material genético: traslocaciones, inversión e inserción. Puede ser pericentrica o paracentrica (inversiones) y también hay traslocaciones (equilibradas o desequilibradas). También hay inserciones; un cromosoma inserta un trozo suyo en otro pero el no gana nada. La traslocacion es bidireccional y la inserción es de un lado a otro.

8 . DI AGNÓSTI COCI T OGENÉTI CO( NORMALOANÓMALO) Traslocacion robertsoniana: traslocacion reciproca, que afecta a dos cromosomas acrocentricos. El 21 esta insertado en un nuevo cromosoma que esta con el 15 SINDROME DE TURNER: 45,XOPURO O EN MOSAICO ( menos rasgos), dependiendo si la alteración esta en todas las metafases o no.

9 . DESCRI BI RAL TERACI ONESCONI SCN( FÓRMULAS) NOMENCLATURA CITOGENETICA: ISCN 2016 (An Internati...