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Tema 5. Métodos automatizados de análisis

1. Visión general de los equipos automáticos e instrumentación Un sistema automatizado es un sistema que incorpora uno o varios sistemas de realimentación que controlan el curso del análisis. Tienen varias ventajas importantes: - Ahorran costes laborales siempre que se tenga un volumen de trabajo suficiente y se pueda superar la inversión inicial de capital. - La velocidad es mayor que en los dispositivos manuales. - Los resultados son más reproducibles gracias a que la secuencia de operaciones garantiza que las muestras y los patrones se procesen exactamente igual y en el mismo periodo de tiempo. Todos los métodos analíticos se pueden dividir en ocho etapas u operaciones unitarias, que se pueden automatizar y que se resumen en la tabla siguiente:

Los sistemas analíticos automáticos pueden ser de dos tipos: - Analizadores discontinuos: Cada una de las muestras se mantiene como una entidad independiente colocándose en recipientes separados. Tienen la ventaja que se elimina la contaminación entre muestra y muestra - Analizadores de flujo continuo: Son mecánicamente más sencillos y más baratos. La muestra se va transportando desde el punto de inyección hasta el detector y de aquí al desecho de manera que la muestra forma parte de la corriente en la que va fluyendo y ahí transcurren las distintas operaciones unitarias. Sin embargo, algunas operaciones no son factibles en sistemas de flujo continuo (aquellos que no tienen la C en la tabla anterior).

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2. Análisis por inyección en flujo (FIA) Es un método derivado de los métodos de flujo segmentado en el que las muestras eran transportadas hasta el detector por medio de una disolución acuosa que contenía una serie de burbujas muy próximas entre sí. Las burbujas servían para evitar la dispersión excesiva de la muestra y limpiar las paredes del conducto, evitando la contaminación entre muestras sucesivas. Sin embargo, en ausencia de burbujas de aire el método ganaba porque los análisis eran más rápidos, había mejores tiempos de respuesta, un menor tiempo entre la aparición de la señal y el retorno a la línea base y el equipo era más sencillo y versátil. De esta forma los equipos de FIA sustituyeron a los métodos de flujo segmentado. 2.1. Instrumentación: El esquema más simple es el sistema para detección de iones cloruro. Consiste en una bomba peristáltica que impulsa un reactivo colorimétrico hasta una válvula que permite la inyección de la muestra. A continuación, se pasa por un reactor en forma de serpentín donde se origina un compuesto coloreado que atraviesa un fotómetro. - Sistema de transporte de muestras y reactivos: Habitualmente la disolución circula a través del sistema por medio de una bomba peristáltica que es un dispositivo que comprime por medio de unos rodillos un fluido que se encuentra en el interior de un tubo logrando una corriente permanente de fluido a través del tubo. Este diseño produce un flujo relativamente libre de impulsos - Inyectores de muestra y detectores: Son similares a los de HPLC. Es vital que la inyección de la muestra sea rápida, en bolus, y que no alteren el flujo de la corriente portadora. La forma más normal de introducir la muestra es por una válvula de inyección que se gira permitiendo el paso de fluido o de la muestra alternativamente. - Separaciones en FIA: En las separaciones FIA no se consigue la separación completa, pero como los patrones y las muestras se tratan por igual, no importa. Solo es importante controlar que la temperatura y los caudales de las muestras y de los patrones se mantengan. Se pueden realizar tres tipos de separaciones: o Diálisis: Sirve para separar iones inorgánicos como cloruro y sodio o pequeñas moléculas orgánicas como la glucosa (proceso que suele preceder a la determinación de estas moléculas en sangre o en suero) ya que estas difunden rápidamente a través de 2

membranas hidrofílicas de acetato o nitrato de celulosa. Las moléculas difunden hacia una corriente aceptora que tiene un reactivo que reacciona con el analito formando un compuesto colorimétrico que se detecta fotométricamente. o Difusión de gases: Es una técnica muy selectiva para analitos gaseosos. Es parecida a la diálisis, pero la membrana es de un material hidrofóbico microporoso como el teflón. Un ejemplo es la determinación de carbonato total en una disolución. La muestra se inyecta en una corriente de ácido sulfúrico y el dióxido de carbono liberado difunde hasta la corriente aceptora que tiene un indicador ácido/base que se detecta colorimétricamente. o Extracción: Sirve para separar cationes. Se mezcla la muestra con un líquido orgánico que contiene un agente complejante que se mezclan en un serpentín. A continuación, se separan los dos líquidos inmiscibles. La fase orgánica va al detector y la acuosa se desecha. 2.2. Fundamento del análisis por inyección de flujo: Inmediatamente después de inyectar la muestra, la zona de muestra tiene un perfil de concentración rectangular, pero al ir circulando en el interior del tubo tiene lugar la dispersión o ensanchamiento de la zona. El perfil resultante depende de dos fenómenos: - La convección asociada al flujo laminar ya que el centro del fluido avanza más rápidamente que el líquido de las paredes. - La difusión. Puede ser de dos tipos: radial o perpendicular a la dirección del flujo y longitudinal o paralela al flujo (que no es importante en los tubos estrechos). Debido a la difusión, la muestra termina adquiriendo una distribución simétrica.

La dispersión se define como: c D= 0 c donde c0 es la concentración inyectada y c es la concentración que llega al detector. La dispersión se mide fácilmente inyectando un patrón y calibrando mediante la ley de LamerBeer. En la dispersión influyen tres variables: El volumen de muestra (para volúmenes grandes la dispersión es la unidad porque no se mezclan suficientemente la muestra y el portador), la longitud del tubo y la velocidad de bombeo.

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2.3. Aplicaciones del análisis por inyección en flujo: Hay métodos basados en los tres tipos de dispersión: - Aplicaciones de la dispersión limitada: Se refieren a dispersiones de 1 a 3. Han tenido aplicación como sistemas de introducción de la muestra a alta velocidad en sistemas que usan como sistemas de detección la absorción y la emisión atómicas y el plasma de acoplamiento inductivo. En estas técnicas se aspiran directamente las alícuotas y se mide la señal en el estado estacionario. La inyección con dispersión limitada también se usa con detectores electroquímicos como los selectivos a iones y los microelectrodos voltamperométricos. En general, las condiciones de dispersión limitada se consiguen reduciendo al máximo la distancia entre el inyector y el detector, disminuyendo la velocidad y amentando el volumen de muestra. - Aplicaciones de la dispersión media: Se refieren a dispersiones de 3 a 10. Un ejemplo es un sistema de dispersión para la determinación colorimétrica de calcio. El tampón de bórax y el reactivo de color se mezclan antes de la inyección en A en un serpentín:

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Métodos de flujo detenido: La dispersión es casi nula cuando el flujo se detiene. Esto se aprovecha para aumentar la sensibilidad de las medidas, al dejar un tiempo para que las reacciones sean completas. Se necesita un dispositivo de control del tiempo que sea capaz de detener la bomba a tiempos muy exactos e intervalos regulares. También se usan para medidas cinéticas. En este caso el flujo se detiene cuando la mezcla de reacción está en la cubeta de flujo. Variaciones por inyección en flujo: En este caso la mezcla inyectada se mezcla con el portador en un cámara de mezcla que da lugar a una gran dispersión. A continuación, se mezcla con el reactivo que contiene un indicador.

3. Sistemas automáticos discontinuos Algunos sirven para realizar alguna de las operaciones unitarias que se han citado al principio del tema. Otros hacen automáticamente un análisis completo. 3.1. Muestreo automático y definición de la muestra en líquidos y en gases: Los muestradores de bomba reversible constan de una sonda móvil que, a intervalos, puede levantar el extremo de la aguja o del tubo desde el recipiente de la muestra y la coloca sobre un segundo recipiente en el que se realiza el análisis. Este movimiento está sincronizado con el funcionamiento de una bomba peristáltica reversible.

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También puede ser un muestreador y diluidor de jeringa. De nuevo aquí se usa una sonda móvil para la muestra. Cuando la sonda está en el recipiente de la muestra, el émbolo de la jeringa movido por un motor retira un determinado volumen de muestra. Simultáneamente, la jeringa extrae un volumen determinado de diluyente. Los dos procesos son independientes gracias a una válvula. Cuando la sonda se coloca en el recipiente, ambas jeringas se vacían, dispensando los dos líquidos en el recipiente analítico.

3.2. Robótica: Para realizar las operaciones unitarias con materiales sólidos se han diseñado equipos basados en pequeños robots. Un ejemplo es un sistema automatizado de laboratorio que dispone en el centro de un robot con un brazo horizontal montado sobre dos pilares y con movimiento en los cuatro grados de libertad. El dispositivo tiene una mano tipo pinza con movimiento de 360º. El sistema se controla por un microprocesador programable. 3.3. El analizador centrífugo: Se basa en una centrífuga para mezclar las muestras con un reactivo que luego se transfieren a cubetas para medidas fotométricas. En la imagen hay una vista de la sección transversal del rotor circular de plástico de una centrífuga. Las muestras y los reactivos se pipetean en unos compartimentos que al girar se mezclan y se empujan hacia unas cubetas individuales colocadas en la parte exterior del rotor. Estas cubetas tienen unas ventanas de cuarzo a través de la que pasa la luz de un espectrofotómetro. Una de las aplicaciones es la determinación de enzimas basada en el efecto catalítico del analito sobre una reacción en la que se forma o se consume una especie absorbente. 3.4. Analizadores elementales orgánicos automáticos: Se basan en la oxidación a elevadas temperaturas de los compuestos orgánicos, que convierten a los elementos de interés en moléculas gaseosas. Un equipo automático comercial para la determinación de C, H y N se muestra en la figura adjunta. Las muestras se oxidan a 900 ºC con oxígeno produciendo dióxido de carbono, monóxido de carbono, agua, nitrógeno elemental y óxidos de nitrógeno. A continuación una corriente de helio arrastra los productos hasta un horno tubular donde el cobre caliente reduce los 5

óxidos de nitrógeno a nitrógeno elemental y el oxígeno se elimina como óxidos de cobre. También el monóxido de carbono se transforma en dióxido de carbono. Los compuestos pasan a una cámara de mezcla donde se analizan pasándola a través de una serie de tres detectores de conductividad térmica de precisión, detectando primero el H, luego el C y finalmente el N. Este instrumento puede estar totalmente automatizado colocando en una bandeja hasta 60 muestras en pequeñas cápsulas. 4. Análisis con tiras multicapas Es un método para realizar las distintas etapas de un análisis cuantitativo de forma automática en tiras individuales formadas por varias capas de reactivos colocadas sobre unas placas transparentes desechables. Se coloca una gota de la muestra en la parte superior de la tira haciendo que difundan los componentes y el analito interacciona con los reactivos dando productos coloreados que se cuantifican por fotometría de reflectancia. Se usa en la determinación de distintos metabolitos de la sangre. 4.1. Estructura de las tiras: Constan de un soporte transparente, una o varias capas de reacción, una capa reflectora y una capa difusora o medidora. Un esquema es la tira para la determinación de glucosa en suero. La tira tiene tres capas: - La capa difusora o medidora: Sobre ella se coloca la muestra. Tiene tres funciones: Reflejar la radiación procedente de una fuente, esparcir la muestra formando una capa uniforme y retener células, cristales y partículas. - La capa de reactivo: Contiene un indicador redox, la enzima glucosa oxidasa, peroxidasa y un tampón a pH = 5. Las reacciones que tienen lugar son:

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El colorante oxidado absorbe a 495 nm. Soporte transparente: Es una placa rígida de plástico transparente 6

4.2. Instrumentación: La medida se basa en la fotometría de reflectancia, la potenciometría selectiva de iones y la fluorescencia. - Fotómetro de reflectancia: Mide la reflectancia difusa de una tira reactiva. La muestra se ilumina por una radiación de una longitud de onda que absorba el analito formando un ángulo de 45º con la tira (para minimizar la reflexión frontal de la superficie). Se presentan dos tipos de reflexión: especular (como un espejo con ángulos de reflexión y de refracción iguales) y difusa (como consecuencia de interacciones como la dispersión, transmisión y absorción de la radiación, siendo esta la que sirve como base de la espectroscopía de reflectancia). Los datos se expresan como porcentaje de reflectancia (%R): I s (muestra) %R= · 100 I r ( patrón) -

Potenciometría: Son sistemas desechables, para la realización de un único ensayo, que contienen membranas selectivas a iones y que sirven para la determinación de iones. La concentración se obtiene mediante la diferencia de potencial entre la celda de la muestra y la celda del patrón que se encuentran conectadas mediante un puente salino.

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Cuestiones teóricas del tema 5 (Se ha respetado la numeración del libro de texto)

33.1. Enumerar secuencialmente una serie de operaciones unitarias de laboratorio que puedan utilizarse para: a- Asegurar la presencia o ausencia de plomo en desconchados de pintura seca: b- Determinar el contenido de hierro en pastillas con múltiples vitaminas/minerales: 33.2. Representar un sistema de inyección en flujo que pudiese servir para determinar Na+ y K+ en sangre basado en medidas de fotometría de llama. 33.3. Representar un sistema de inyección en flujo que se pueda utilizar para determinar plomo en los vertidos de una planta industrial mediante la extracción de los iones plomo con una disolución de ditizona en tetracloruro de carbono, la cual reacciona con dicho ion para originar un producto intensamente coloreado. 33.4. Representar un equipo de inyección en flujo para la determinación de sulfito de sodio en muestras acuosas. 33.5. Representar la vista superior de la configuración del dedo de un robot, equipado con “visión” fotoeléctrica, que pudiera pinchar un vial cerrado de 2 mL. 33.6. Realizar un esquema de un sistema de flujo (indicando columnas, detectores y válvulas conmutadoras) diseñado para cumplir los siguientes requisitos: Primero: El pico del disolvente debe separarse rápidamente de dos analitos que presentan mucha menos volatilidad que el disolvente. Segundo: El pico del disolvente no debería pasar por la columna analítica. Tercero: Hay que separar los dos analitos, cuya polaridad es muy diferente. Cuarto: Hay que determinarlos cuantitativamente.

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