Tema 5. Producción de polímeros microbianos PDF

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Apuntes con los que obtuve una calificación de 9 (Sobresaliente) con el profesor Eduardo Santero....

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Tema 5: Producción de polímeros microbianos BIOPLÁSTICOS MICROBIANOS: Poliésteres -Polilactato -Polihidroxialcanoatos POLISACÁRIDOS -Múltiples exopolisacáridos con múltiples aplicaciones -Goma de xantano BIOSURFACTANTES -Polisacáridos: Rhamnolípidos y trehalosas -Polipéptidos: Surfactina



Los biosurfactantes son realmente oligómeros, no son muy grandes, pero los incluimos aquí.



De estos, los bioplásticos son los más importantes

1. Plásticos Los plásticos son el principal problema medioambiental por su uso indiscriminado. La solución a este problema sería usar plásticos que se puedan reciclar e incluso mejor, biodegradar. 1.1.

No degradables

Los plásticos que no se degradan acaban entrando en el océano, se han visto cosas espeluznantes. Auténticas islas de plásticos que se aglomeran. Muchos animales mueren comiendo plásticos

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1.2.

Degradables

1.2.1. Fotodegradables:  Se degradan conforme la luz incide sobre ellos, como las sillas de plástico tipo Pepsi.  Típicas sillas blancas de jardín. 1.2.2. Semi-biodegradables:  Tienen polímeros de polietileno, intercalados con secciones de polímeros de azúcares, que al contrario que las secciones de polietileno, si son degradables. 

Estos plásticos suponen también un problema, aunque menor, porque una parte de ellos si es degradable. Al final consiguen en pequeños pedazos de polietileno.

1.2.3. Biodegradables:  Esta es la solución ideal. Están empezando a emerger. Son de origen biológico 1.2.3.1 y 1.2.3.2 Plásticos derivados de productos vegetales como el almidón (bolsa de fécula de patata) y de la celulosa.  El problema que tienen es que no son tan resistentes ni flexibles, son más quebradizos de lo que deberían ser. Los químicos los están mejorando. 1.2.3.3 y 1.2.3.4 Plásticos producidos por bacterias: bioplásticos.  Son los polilactatos y los polihidroxialcanoato. Los dos son poliésteres. El polilactato se puede fabricar hoy en día biológicamente con enzimas parecidas a la síntesis de polihidroxialcanoato, pero están modificadas. El polilactato es un poli-alfa-hidroxi. Los polihidroxialcanoato pueden ser poli-alfa/beta-hidroxi. El polihidroxialcanoato es lo que más se está trabajando actualmente. Encontramos: Polihudroxibutirato, polímero biopol polihidroxibutirato-valerato (vasos, tarjetas de crédito hechas por Greenpeace). Se usan para productos de alto valor, donde el coste del envase no es muy caro con respecto al producto en sí.

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2. Polihidroxialcanoatos phas •

Son poliésteres lineales

•

Monómeros son hidroxiácidos: ácido carboxílico con un grupo hidroxilo y un hidrocarburo como sustituyente.

•

Unidos por enlace éster entre el grupo hidroxilo y el grupo carboxilo.

•

Completamente biodegradables, liberan CO2 y H2O

Tenemos una reacción de condensación típica:

En la foto se ve como el PHA es un poli-ß-hidroxialcanoato. El grupo hidroxi (-OH) está unido al segundo carbono después del carbono del grupo COOH. Si estuviese unido al carbono que está unido directamente al carbono del grupo COOH, sería un poli-α-hidroxibutirato. Si los monómero son de ácido butírico se da lugar a los polihidroxibutiratos, que son los más comunes. Estos biopolímeros son completamente biodegradables, en su degradación solo generan CO2 y H2O, ningún otro compuesto nitrogenado o azufrado.

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2.1.

Tipos de Polihidroxialcanoatos

En función de donde este el grupo alcohol y la longitud del monómero, tenemos distintos tipos de polihidroxialcanoato tras juntar los monómeros.

n es el número de unidades CH2 que encontramos entre el grupo COOH y el sustituyente. -Si n es 1: tenemos los poli-3-hidroxi(lo que sea). Ya que el carbono del CH2 sería el carbono número 3. -Si n es 2: tenemos los poli-4-hidroxi(lo que sea) -Y así va siguiendo. Esto no es más que la estructura del polímero. Además, es lógico que la posición –OH determine el número n, así: Si –OH está en el carbono 3, n=1 (alfa) Si –OH está en el carbono 4, n=2 (beta) Los distintos tipos de Polihidroxialcanoatos tienen distintas características, tenemos que intentar conseguir el que más nos interese. El resultado de estas diferencias serán las variaciones en la distancia entre el grupo carboxilo y el grupo hidroxilo. Debido a esto, cada polímero tendrá una textura y propiedades específicas.

2.2.

Microorganismos productores de polihidroxibutirato PHB

El PHB es el que más abundantemente se producen en la naturaleza de todos los PHA, se produce fácilmente a partir de 2 moléculas de acetil-Coa que se junta en una de Acetoacetil-Coa y a partir de ahí construimos el polímero. Lo hacen muchas bacterias en muchos ambientes. Es una especie de despensa. Los granulos de PHB.

 Ralstonia eutropha: 96% del peso seco de la bacteria es polihidroxibutirato.

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2.3.

Metabolismo de la síntesis de PHB

Síntesis de PHB: la fuente de carbono es acetil-coa para el anabolismo del PHB. Cuando tienen exceso de C, condensan 2 en acetoacetil-coa, y el grupo ceto lo reducen a hidroxilo. Después una enzima coge los monómeros de polihidroxialcanoil (alcanoil es el genérico, se cambia por butiril o lo que sea) y se genera el polímero. Si la bacteria está haciendo esto, no se puede dejar que la bacteria lo utilice como fuente de C. Para ello se mete un chorro de C para que no degrade el polímero y lo guarde. Además, se le tiene que poner una fuente de nitrógeno pequeña para que lo utilice sólo para sus necesidad vitales, si añadiésemos más cantidad de nitrógeno, la bacteria lo utilizaría para metabolismo secundario, y también requeriría carbono, por lo tanto bajaría la producción de polihidroxialcanoatos, o en el caso del esquema, de PHB. Esta es la síntesis de Novo a partir de AcetilCoA. Pero hay compuestos que podrían venir de la síntesis de aa.gg, de la ruta de aa.gg, podrían incorporase aquí y formar polímeros tales como el PHB Esos aa.gg se cortan generando AcetilCoA, y pueden generar tanto AcetilCoA como otros compuestos que entran en esta ruta y permiten la síntesis de PHB

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2.4.

Copolímeros de hidroxialcanoatos

Biopol: formado por polihidroxivalerato y polihidroxibutirato. El valerato tiene 2 carbonos en la rama lateral, el butirato solo 1. Se le llama Biopol. Vemos los dos monómeros que lo componen. Este Biopol se está utilizando, pero hoy día cuesta como 10 veces más que los plásticos convencionales. Si pones a un microorganismo a crecer con glucosa u otro azúcar de 6 carbonos, te da finalmente acetil-coa que se incluirá en la ruta de formación de PHB. Pero ¿qué pasa si metemos otra fuente de C? Por ejemplo el propionil mezclado con glucosa. La bacteria lo pasa a propionil-coa, la sintasa lo condensa con acetil-coa: dando el monómero cetovaleril-Coa y finalmente se unen entre ellos dando el polímero. Caba saliendo un polimero largo, al final ocurre que se intercalan un poco al azar. Va pillando lo que le aprece en el centro activo. Es un copolimero que no es uniforme.

En definitiva: jugar con el metabolismo de la bacteria, para que sea capaz de generar los compuestos que yo quiera dándole fuentes de carbono variadas generando copolímeros distintos.

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3. Principales exopolisacaridos microbianos de interés industrial -

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Son los que forman parte de su cápsula A la tabla que viene en la hoja siguiente sólo echarle un ojo. Homopolisacáridos y heteropolisacáridos. Los pueden producir hongos, pero la mayor parte de ellos los producen bacterias. Vamos a ver el Xantano (heteropolímero de glucosa, manosa y glucurónico)

Los EPS de interés industrial pueden obtenerse de diferentes organismos. La mayor parte de los EPS conocidos en la actualidad son de origen procariótico, además pueden obtenerse de hongos. Muchos de los EPS son polianiónicos, debido a que la mayoría presenta ácidos urónicos. Este es el caso de xantano, alginato y gelano, que presentan D-glucurónico. Xantano y Gelano son utilizados en la industria EEUU y UE, el curdlano en la japonesa Pueden tener origen fúngico o origen bacteriano Alginatos: se usaban antiguamente porque salían de algas pardas

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3.1.

Aplicaciones de los exopolisacaridos

La tabla muestra en qué tipos de industrias se pueden utilizar y para qué. El Xantano se lleva la palma, se utiliza mucho para recuperar petróleo y es donde más se gasta. Aunque también se usa en industria alimentaria.

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Las aplicaciones de los EPS son muchas, y gran parte de los productos que utilizamos día a día poseen algún tipo de EPS. Zooglea es el principal formación de flocus en estaciones de aguas residuales Las principales aplicaciones se realizan a nivel de la industria alimentaria, donde son utilizados por sus propiedades gelificantes y estabilizadores, entre otras. En la industria farmacéutica y petroquímica también son muy importantes. Hay que destacar la importancia en los últimos años de estos materiales en la industria para suplantar a los de origen vegetal, debido a las ventajas que supone: mejores propiedades organolépticas, mayor facilidad de crecimiento y menores costes de producción. Además de ser ecológicos.

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4. Xantano (Realmente es un tipo de exopolisacaridos, entraría en el 3) 4.1. •

Bacteria productora de Xantano Producido por Xanthomonas – g-proteobacteria (Gram negativa) – Patógenos de plantas – Interviene en infección y biofilms, por la producción de la goma de xantano – Gram negativa

•

4.2.

Cepa industrial: X. campestris

Características

•

Heteropolisacárido compuesto de D-glucosa, Dmanosa y ácido D-glucurónico

•

Estructura compleja con sustituyentes en algunos azúcares

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Sustituyentes: piruvato y acetato. Las manosas pueden ir sustituidas por ambos

•

Peso molecular: 2-50 · 106 Da

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4.3.

Genes implicados en la síntesis del xantano

Una docena de genes son necesarios para la síntesis del monómero y la posterior polimerización. Entre ellos se incluyen los de síntesis del bactoprenol. Es un lípido que se encarga de varios procesos de transporte y translocación de proteínas y/o estructuras complejas como polímeros a través de la membrana de las bacterias. La manosa está “adornada”. Importante entender que esto se va produciendo por condensación, luego tenemos oda una serie de enes implicados en el exporte hacia fuera

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Los genes implicados se conocen como genes gum. La segunda manosa puede llevar un piruvato ( se encarga el producto del gen gumL) o un acetato (que se encargaría el producto del gen gumG). Por otro lado, la primera manosa el acetato se lo mete el producto del gen gumF.

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4.4.

XANTANO-Biosíntesis

Verde: enzimas Gris oscuro: lípido transportador, el bactoprenol. Importante:  J transloca la subunidad hacia el periplasma.  E va polimerizando los monómeros.  B y C: Ayudan a polimerización y sacarlo

Es bastante complejo, pero además vamos a depender de la disponibilidad de los sustratos.

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4.5.

Producción de xantano

Sorprendentemente, pese a su importancia, se sabe muy poco de cómo se regulan los genes. Los avances logrados han sido por cambios en la composición del medio, del bicho en si no se ha modificado mucho Lo que ha encontrado con lógica son las condiciones del medio de cultivo: – Cultivo aerobio tipo fed-batch – Fuente de C: glucosa, fructosa o almidón – Medio limitado en nitrógeno (por las razones explicadas al principio del tema). Cuando una bacteria le falta nitrógeno es equivalente a tener mucho carbono. Si la limitamos en nitrógeno, cualquier cosa que haga la bacteria que neesite carbono va a producir mas, porque le sobra carbono. – pH: 7. A pH ≤ 5 no se produce xantano – Temperatura: 25-32ºC

La producción de la goma de xantano se inicia en fase exponencial tardía y durante la fase estacionaria. Por este motivo, se utilizan en cultivos discontinuos, donde echas nutrientes (sobre todo en este caso glucosa) cuando llegas a la fase estacionaria. No hay cepas muy mejoradas, la cepa que hay hoy día es muy efectiva, conseguir una productividad mayor que esto es muy muy complicado

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5. Biosurfactantes -

5.1.

Son moléculas anfipáticas, como los detergentes (una parte hidrosoluble y otro no). Hay bacterias que son capaces de producirlos, se pueden usar como detergentes pero son moléculas - completamente biodegradables. No como los detergentes de uso cotidiano, que realmente no lo son. Distintos tipos:

-Ramnolipido, del que vamos a hablar: moléculas de ramnosa con sustituciones hidrófobas de cadenas lineales no sustituidas, cadenas de hidrocarburos. El azúcar ramnosa sería la parte hidrófila -Otro ejemplo: las partes hidrofóbicos sustituye en sus partes correspondientes de la trealosa. Estructura compleja. -Otro ejemplo: la parte hidrosoluble no es un azúcar, sino que está basada en aminoácidos.

En rosa esta la región hidrófoba A partir de aquí vamos a hablar de un biosurfactante en concreto, de los ramnolípidos: 5.2.

Dos tipos de ramnolipidos

Diferencia: ramnosas

número

de

 Mono ramnolípidos  Di ramnolípidos

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5.3.

Principales productores

Principalmente Pseudomonas o parientes relacionados (burkholderia) •

Pseudomonas spp. - Pseudomonas putida. - Pseudomonas chlororaphis. - Pseudomonas aeruginosa. (Muy usada, pero es un patógeno)



5.4.

Burkholderia pseudomallei.

Ruta de biosíntesis de ramnolípidos

Se producen las partes hidrofóbicas e hidrofílicas por separado, y después se pegan. Ambas partes se producen de forma normal en la actividad de una bacteria. Lo que de verdad es importante e identificativo es la fase de condensación de las dos partes por separados para dar el surfactante. Rosa clarito: lo tienen muchas especies diferentes Verde: no lo tiene todo el mundo. RhlA y RhlB y RhlC (sirve para convertirlo en di) son más específicas -

La parte hidrofílica (rojo): se utiliza para LPS, lipopolisacaridos. La parte hidrófoba (azul): se utiliza para la síntesis de ácidos grasos. En una parte dela ruta se genera Hydroxyacyl-ACP de donde incluso se puede generar los PHA.

Lo que no es común, y lo que realmente permite la síntesis de los ramnolípidos es:  rhlA: coge los 3-hydroxyl-ACP y le mete lateralmente cadena hidrofóbica.  rhlB y rhlC. Introducen la cadena lateral hidrofóbica en la ramnosa, hasta obtener el surfactant, que puede ser mono o di ramnolipidos Página 14 de 16 Luis Pedro Gª-San Segundo Jiménez. Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide. [email protected]

5.5.

Regulación compleja de la producción de ramnolípidos

Como se ve en el siguiente esquema, la regulación de la síntesis de ramnolípidos es compleja.

Esta regulación esta diseña en respuesta a la planta, realmente esa bacteria es un patógeno de plantas, tiene que tener cierta cercanía a la planta y cierta cantidad de bacterias para que salte el sistema de Quorum sensing. La goma genera la formación de biofilms, etc., etc. La enorme complejidad en la regulación del operón rhlAB es muy importante, es lo que caracteriza a este tipo de bacterias. Tiene 3 sistemas de expresión que al final (tras una regulación compleja) acaban controlando la expresión del operón rhlAB. Es además una regulación de tipo Quorum sensing. En este tipo de regulación la propia bacteria fabrica la señal activadora. Si hay poco producto producido, no se activa la señal, si hay una cantidad mayor (cultivo crecido) se activa la señal, por eso también en este caso se produce sobre todo en la fase estacionaria.

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5.6. •

Condiciones de producción a nivel industrial de ramnolípidos Fuente de carbono - Fuentes de carbono solubles: glicerol, glucosa, manitol, etanol (rendimiento menor con etanol) - Algunos sustratos inmiscibles en agua: n-alcanos o aceite.

•

Fuente de nitrógeno: Debe ser la cantidad justa, por los motivos ya explicados. - NH4, glutamina, asparragina y arginina: inhiben. - NO3 promueve la mayor síntesis de ramnolípidos Mejor usar nitrato que con amonio, el amonio inhibe la producción normal.

•

Cationes divalentes: inhiben la síntesis (Fe2+).

•

pH: 6.2 – 6.4. Descenso en la producción a 7.0

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Temperatura: 32-34ºC. Temperaturas elevadas alteran la composición de los biosurfactantes.

•

Agitación: favorece un incremento en la producción de biosurfactantes.

•

[Sales]: Reducción al mínimo de sales de Mg2+, Ca2+, K+, Na+.

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