Ćwiczenia - Notatki z wykładu 1-8 PDF

Preview

Summary

Notatki z ćwiczeń prowadzonych przez dr hab. Dorotę Kuczyńska Wiśnik...

Description

Zastosowanie technik chromatograficznych • Poznawanie białek. # • Przemysł (np. koenzymy). # • Szczepionki. # • Insulina —> leki. # Koszty • Np. 1 g insuliny kosztuje ok. 60$. # • Niektóre białka kosztują nawet kilka milionów za gram. # Sposoby pozyskiwania białek • E. coli —> insulina. # • Linie komórkowe CHO —> najdroższy możliwy sposób, np. erytropoetyna. # • Drożdże. # Czynności przed oczyszczaniem • Zebranie dostępnych informacji o białku (lub o białkach homologicznych) —> punkt izoelektryczny, masa cząsteczkowa, skład aminokwasów, obecność podjednostek, zawartość komponenty cukrowej lub lipidowej, specyficzne właściwości biochemiczne. # • Określanie skali preparatyki —> ile białka potrzeba. # • Określenie czy zależy nam na aktywności biologicznej białka. # • Określenie czy czystość białka jest konieczna do badań, które zamierzamy wykonać. # Stopień oczyszczenia

Zastosowania

Bardzo wysoki > 95%

Badania in vivo, zastosowanie terapeutyczne

Wysoki 95-99%

Krystalografia i badania fizykochemiczne

Umiarkowany < 95%

Sekwencjonowanie białka, uzyskiwanie przeciwciał

Zagrożenie dla białek • Na wszystkich etapach oczyszczania należy chronić białka przed utratą aktywności oraz degradacją. # • Zagrożeniem dla białek są proteazy, które zazwyczaj kontrolują komórkę. # • Kiedy otwieramy komórkę proteazy „spuszczane są ze smyczy”. # • Dlatego białka są oczyszczane w temperaturze ok. 4OC.# Etapy oczyszczania białek • Wyodrębnianie z materiału biologicznego:# - Rozdrobnienie materiału. # - Rozbicie komórek i tkanek (homogenizacja, rozbicie ultradźwiękami). # - Ekstrakcja białka do roztworu wodnego. # - Usunięcie pozostałego materiału genetycznego przez odwirowanie lub sączenie. # • Wstępne oczyszczanie:# - Stosuje się je opcjonalnie. # - Wytrącanie białka z roztworu w wyniku frakcjonowania wzrastającymi ilościami rozpuszczalników lub wysalanie siarczanem amonu. # - Usunięcie czynnika wytrącającego białko przy pomocy dializy. # • Oczyszczanie właściwe —> chromatografia (minimum jedna technika, najczęściej 3). # • Analiza czystości preparatu. # Aktywność właściwa białek • Zwiększa się podczas ich oczyszczania.# Źródła białka • Naturalne —> rośliny, tkanki zwierzęce. # • Komórki rekombinowane. #

Techniki lizy komórkowej (pękanie komórki) • Homogenizacja (blendowanie). # • Prasa French’a (rozprężanie - zmiany ciśnienia). # • Sonikacja (ultradźwięki). # • Zamrażanie/rozmrażanie. # • Degradacja enzymatyczna lub chemiczna (lizozym degraduje ściany). # Kontrola w procesie oczyszczania białek • Zachowywanie próby z każdego etapu oczyszczania. # • Pomiar aktywności —> jeśli białko, które oczyszczamy jest enzymem porównujemy aktywność z aktywnością właściwą. # • Pomiar stężenia całkowitego białka w kolejnych próbach. # • Analiza próby metodą elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących. # Kontrola ilości • Metody ilościowe oznaczania białek i peptydów. # • Pomiar absorpcji w ultrafiolecie. # • Metody immunologiczne. # • Metody kolorowe:# - Metoda Lowry’ego. # - Metoda Broadford’a. # - Metoda BCA. # Kontrola czystości • Metody elektroforetyczne PAGE-SDS lub 2D. # • Wysoko rozdzielcza chromatografia jonowymienna w systemie FPLC. # • Spektrometria mas. #

Ruch cząsteczek w polu elektrycznym • W polu elektrycznym cząsteczki obdarzone ładunkiem, poruszają się w kierunku elektrody o znaku przeciwnym do swojego ładunku. # V = Ez / f# V - szybkość wędrówki cząsteczki w polu elektrycznym. # E - natężenie pola. # z - wypadkowa ładunku. # f - siła tarcia.# Rozdział elektroforetyczny białek i kwasów nukleinowych • Prowadzi się najczęściej w żelach agarozowych lub poliakryloamidowych (ograniczenie dyfuzji i konwencji, łatwiejsze barwienie po zakończeniu rozdziału). # Ruchliwość elektroforetyczna • Kwasów nukleinowych zależy od długości ładunku —> ładunek „-”, kształt pałeczek. # • Białek jest trudna do przewidzenia —> białka różnią się kształtem, wielkością i ładunkiem. # Zastosowanie technik elektroforetycznych w diagnostyce • Elektroforeza w żelach agarozowych, detektor kapilarny:# - Analiza białek surowicy. # - Analiza lipoprotein. # - Analiza moczu. # - Analiza płynu mózgowo-rdzeniowego. # • Elektroforeza w żelach agarozowych i na octanie celulozy, detektor kapilarny:# - Diagnoza hemoglobinopatii. # • Ogniskowanie elektryczne:# - Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c. # - Wykrywanie izoform enzymów. # Proteinogram • Rozdział białek w surowicy. # • Służy do oceny ilościowej i jakościowej białek surowicy krwi. # • Dla pacjentów z podwyższonym stężeniem białek (powyżej 8,6 g/l).# • Materiał —> surowica krwi (nie stosuje się raczej osocza ze względu na trudność interpretacji, związaną z obecnością fibrynogenu). # • Nośnik —> żel agarozowy (0,5-1%), rozdział na postawie stosunku ładunku do masy (wielkość cząsteczek nie ma znaczenia).# • Próba rozdzielna —> surowica krwi (przechowywana do 7 dni, w temperaturze od 4 do 8OC).# • Bufor elektrodowy —> pH zasadowe. # Działania po rozdziale białek w surowicy • Barwienie czernią amidową lub błękitem Coomasie. # • Pomiar densytometryczny wybarwionych prążków. # • Przeliczanie poszczególnych frakcji na stężenia procentowe i wartości bezwzględne w odniesieniu do całkowitej ilości białka w badanej próbie. # Frakcje (od - do +) • Zwykle wyróżnia się 5 głównych frakcji:# - γ-globuliny# - β-globuliny# - α2-globuliny# - α1-globuliny# - Albuminy.# • Czasami wyróżnia się 6 frakcji (β1 i β2-globuliny).#

Sprzęt potrzebny do przeprowadzenia elektroforezy • Zasilacz. # • Aparat do elektroforezy. # • Aplikator. # • Zbiornik do barwienia. # Zaburzenia w obrazie proteinogramu • Frakcje podwójne. # • Frakcje dodatkowe. # • Brak frakcji. # • Zmiany rzędowości białek spowodowane np. modyfikacjami. #

Zaburzenia w obrazie albumin • Obniżony poziom: niedobory pokarmowe, zespół nerczycowy, oparzenia. # • Bisalbuminemia: patologie trzustki. # Zaburzenia w obrazie α1-globulin • Podwyższony poziom: reakcje ostrej fazy. # Zaburzenia w obrazie α2-globulin • Obniżony poziom: uszkodzenie wątroby, hemoliza wewnątrznaczyniowa # • Podwyższony poziom: stany zapalne, zespół nerczycowy. # Zaburzenia w obrazie β-globulin • Obniżony poziom: niedożywienie, reakcje ostrej fazy. # • Podwyższony poziom: choroby wątroby. # Zaburzenia w obrazie γ-globulin • Obniżony poziom: leczenie immunosupresyjne, radio i immunoterapia.#

Diagnostyka hemoglobinopatii - wykrywanie odmian hemoglobiny • Prawidłowe typy hemoglobiny to: # - Hemoglobina A (95-98% całkowitej hemoglobiny i dorosłych) —> zawiera 2 łańcuchy alfa i 2 łańcuchy beta. # - Hemoglobina A2 (2-3% całkowitej hemoglobiny).# - Hemoglobina płodowa HbF (do 2% u dorosłych ludzi) —> ma większe powinowactwo do tlenu niż HbA, dzięki czemu jest w stanie pobrać tlen z krwi matki przez łożysko i uwolnić go w tkankach płodu. W życiu pozamacicznym jest zastępowana, gdyż słabiej uwalnia tlen w tkankach przy wyższym ciśnieniu parcjalnym tlenu.# Zmutowane formy hemoglobiny # • Hemoglobina S:# - Mutacja punktowa —> zmiana kwasu glutaminowego w walinę w łańcuchu beta. # - Anemia sierpowata.# • Hemoglobina C:# - Mutacja punktowa w łańcuchu beta —> zmiana kwasu glutaminowego na lizynę (poz 8).# • Hemoglobina D.# • Hemoglobina E.# Diagnostyka - elektroforeza • W pH 8,8 (octan celulozy):# - Wszystkie warianty hemoglobiny mają ładunek „-” i migrują do anody w zależności od wielkości tego ładunku. # - Zmiany w składzie aminokwasowym w przypadku wariantów hemoglobiny powodują zmiany ładunku a tym samym zmianę migracji. # • W pH 6,2 (agar kwaśny):# - Rozdział hemoglobiny na podstawie różnic w ładunku i wielkości lub kształcie cząsteczek.# - Hemoglobina S daje wyraźny prążek na środku żelu —> brak aktywności elektroforetycznej. # - Hemoglobina D migruje. # Hemoglobina glikowana (HbA1c) • Stabilna forma Hb po przyłączeniu glukozy do N-terminalnej reszty waliny w łańcuchu beta. # • Glikacja zmienia pI hemoglobiny —> różnice w wypadkowym ładunku hemoglobiny. # • Jedna z metod detekcji - ogniskowanie izoelektyrczne (IEF). # Przykłady zastosowania IEF • Wykrywanie izoform enzymów np. alfa-1-antytrypsyny (AATD) inhibitora proteaz serynowych.# • Mutacje punktowe i zmiana aminokwasów powoduje zmiany w pI. # • Wykrywanie prążków oligoklonalnych: # - Badanie ogólnego stężenia Ig w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy, a następnie analiza próbek metodą IE. # - Obecność prążków oligoklonalnych charakteryzuje takie schorzenia jak: stwardnienie rozsiane, kiła układu nerwowego, ostre zakażenie bakteryjne lub wirusowe OUN, chłoniak OUN. # Zastosowanie elektroforezy dwukierunkowej w proteomice • Porównanie materiału pochodzącego z komórek funkcjonujących prawidłowo i komórek wadliwych —> poszukiwanie biomarkerów. # • Choroby psychiczne: # - Depresja —> podwyższony poziom białki z grupy ostrej fazy stanu zapalnego np. antytrypsyny.# - Schizofrenie —> poszukiwanie markera schizofrenii w płynie mózgowo rdzeniowym np. apolipoproteina AIV oraz dysmutaza ponadtlenowa białko wiążące selen we krwi.# • Choroby naurogeneracyjne.# • Choroby nowotworowe:# - Porównanie profilu białkowego komórek zdrowych i transformowanych nowotworowo.# - Poszukiwanie biomarkerów w płynach ustrojowych. # • Alergie:# - Poszukiwanie substancji wywołujących alergie —> które białka wywołują reakcje alergiczną organizmu. #

Przebieg elektroforezy dwukierunkowej • Próba biologiczna (komórki, tkanki) —> ekstrakcja białek —> lizat komórkowy. # • Ogniskowanie izoelektryczne. # • Po zakończonym elektrogniskowaniu białka w żelu są tratowane SDS —> wszystkie uzyskują wypadkowy ładunek „-”.# • Żel po elektrogniskowaniu nanoszony jest na górę żelu PAGE-SDS —> białka rozdzielane są na podstawie masy. # Rak płuc • Wykrywanie białek do identyfikacji. # • Identyfikacja (nazwa i funkcja). # • Wytypowanie potencjalnego markera. # Rak pęcherza • Identyfikacja białka MLDI-TOF. # • Kalretikulina (białko opiekuńcze). # • Western blot z wykorzystaniem przeciwciał anty-kalretikuliny. #

Metody wyznaczania masy białek • Metody sedymentacyjne # • Elektroforeza denaturująca w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) —> względna ruchliwość elektroforetyczna białka rf. # • Filtracja żelowa (sączenie molekularne).# • Spektrometria mas: # - MALDI —> widmo masowe stanowi pojedynczy pik, ponieważ ta metoda prowadzi do pojedynczej protonacji białka. # - ESI —> widmo masowe stanowi liczne piki odpowiadające różnej protonacji białka.# Zastosowanie spektrometrii mas • Analiza skomplikowanych mieszanin białek zawierających kilkanaście tysięcy białek (osocze, homogenaty tkanek, płyn mózgowo-rdzeniowy.# • Wielowymiarowe techniki separacji. # • Techniki łączone.# Zasady tworzenia układów wielowymiarowych • Właściwości fizykochemiczne na podstawie, których będą zachodziły rozdziały muszą mieć końcowo różne mechanizmy.# • Rozdział w pierwszym wymiarze powinien być zachowany w drugim. # • W przypadku analizy proteomu lub metabolomu zdolność rozdzielcza stosowanej metody powinna być ok. 20 razy większa od ilości składników zawartych w mieszaninie.# Przebieg • Lizat komórkowy # • Ogniskowanie izoelektryczne # • Po zakończeniu elektroogniskowania białka w żelu są traktowane SDS —> wszystkie uzyskują ładunek ujemny.# • Żel po elektroogniskowaniu jest nanoszony na górę żelu PAGE-SDS —> białka są rozdzielane na podstawie masy.# Ograniczenia i wady technik łączonych # • Ogromna ilość danych. # • Problem z powtarzalnością. # • Problem z optymalizacją warunków rozdziału. # Najpopularniejsze techniki łączone • GC-MS - chromatografia gazowa-spektrometria mas.# • GC-MS/MS - chromatografia gazowa- tandemowa spektrometria mas.# • LC-MS - chromatografia cieczowa-spektrometria mas.# • LC-MS/MS - chromatografia cieczowa- tandemowa spektrometria mas.# • CE-MS - elektroforeza kapilarna - spektrometria mas.# • FT-ICR-MS - spektrometria mas z analizatorem cyklotronowego rezonansu jonów z furierowską transformacją wyników.# LC-MS/MS • Obecnie wykorzystuje się ją w wielu laboratoriach analitycznych. # • Podstawowa zaleta —> możliwość oznaczania wielu parametrów podczas jednej analizy. # • Badania przesiewowe noworodków —> wady wrodzone metabolizmu.# • Monitorowanie terapii.# • Toksykologia. #

Biochemiczne i molekularne podłoże chorób • Poszukiwanie nowych metod diagnostycznych. # • Wynalezienie nowych, skuteczniejszych leków.# Proteomika • Możliwość jednoczesnej obserwacji wielu białek. # • Obserwowanie zmian w stężeniu białka. # • Obserwacja zmian w modyfikacjach potranslacyjnych. # Podstawowe działanie proteomiki klinicznej

Czułość testu • Zdolność do wykrycia osób chorych wyraża się jako % wykrycia przypadków do całości osób chorych czułość 100% oznacza, że wszystkie osoby chore zostają rozpoznane. # Swoistość testu • Zdolność do wykrycia osób zdrowych. # • Wyraża się jako % pacjentów, u których nie wykryto choroby, do liczby zdrowych pacjentów. # • Swoistość 100% oznacza, że wszyscy ludzie zdrowi zostaną w wykonanym teście oznaczeni jako zdrowi. # Podział biomarkerów ze względu na stopień zaawansowania choroby • Diagnostyczne. # • Prognostyczne. # • Predykcyjne. # • Monitorowanie skutków leczenia. # Podział biomarkerów ze względu na typ makrocząsteczki • DNA. # • RNA. # • Białkowe. # • Cukrowe. #

Inny podział biomarkerów • Obrazowe. # • Kliniczne.# Idealny marker diagnostyczny • Wysoka czułość diagnostyczna.# • Wysoka swoistość. # • Wysoka swoistość narządowa. # Markery predykcyjne • Informują o prawdopodobieństwie uzyskania jakiegoś konkretnego efektu (np. uzyskanie remisji) w wyniku określonego sposobu leczenia. # Markery monitorowania skutków leczenia • Wprowadza się je po leczeniu. # • Sprawdza czy choroba została wyleczona. # • Czy będą nawroty. # Wprowadzanie biomarkerów • Odkrycie potencjalnego biomarkeru —> wybór odpowiedniego materiału do badań, duża liczba wyników. # • Etapy kwalifikacji potwierdzenie roli badanego białka —> eliminacja wyników fałszywych. # • Etapy weryfikacji potwierdzenia czułości testu. # • Walidacja i optymalizacja metody oznaczania biomarkera —> zmiana metody analizy na prostszą/bardziej popularną. # Szukanie biomarkerów • Analiza profili białkowych. # • MALDI-TOF lub SELDI-TOF. # • Porównanie profili białkowych badanej próbki z profilem proteomicznym charakterystycznym dla danej choroby. # • Zdiagnozowanie choroby. # Problemy proteomiki klinicznej • Złożoność próbki. # • Brak jednoznacznych standardów analizy. # • Brak określenia zakresu stężeń dla norm i patologii. # • Nieumiejętne wykorzystywanie narzędzia bioinformatyczne. # • Wyniki słabe statystycznie. # Medycyna tradycyjna • Poszukiwanie leku w oparciu o widoczne symptomy. # • Choroby są heterogeniczne od przyczyny przez przebieg po odpowiedz na leczenie. # Medycyna przyszłości • Podanie odpowiedniego leku, w odpowiedniej dawce, odpowiedniej osobie we właściwym czasie. # Problemy spersonalizowanie medycyny molekularnej • Poziom zmienności genetycznej. # • Dostęp do odpowiednich tkanek. # • Rozwój metod proteomicznych i obliczeniowych. # • Problemy etyczne. #

Immunocytochemia • Wykrywanie i lokalizowanie w komórkach (cy też w szerszym rozumieniu w tkankach) substancji o charakterze antygenowym, za pomocą znakowanych przeciwciał. # • Przebieg:# - Hodowla komórek na szkiełku. # - Uwalnianie i immunodetekcja. # - Obserwacja mikroskopowa. # - Analiza obrazu. # Immunocytochemia w diagnostyce • Zakażenie wirusami. # • Diagnostyka chorób tarczycy, ciąży i płodności, uszkodzenie mięśnia sercowego, niedokrwistość, wielu wrodzonych chorób genetycznych i chorób metabolicznych. . # • Toksykologia. # • Transplantologia. # • Nowotwory —> określanie typu i stopnia zróżnicowania. # • Obecność charakterystycznych marketów (takich jak np. enzymy, hormony, białka receptorowe), stanowi podstawę diagnostyki medycznej. # Znakowanie • Stosowane aby uwidocznić miejsce wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce, czy tkance należy użyć znakowanych przeciwciał.# • Znaczniki nie zmieniają właściwości przeciwciał, ale pozwalają na bezpośrednią lub pośrednią obserwację w mikroskopie. # • Fluorochromy (w metodach immunofluorescencyjnych). # • Enzymy (w metodach immunoenzymatycznych). # • Metale (preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym).# Metody detekcji • Bezpośrednie —> znaczniki bezpośrednio na przeciwciele pierwszorzędowym. # • Pośrednie —> znaczniki na przeciwciele drugorzędowym, silniejszy sygnał.# Metody immunofluorescencyjne • Np. bromek etydyny do barwienia DNA.# • Permeabilizacja: # - Naruszanie błony komórkowej. # - Prze jej wykonaniem komórki muszą być utrwalone. # Choroby z autoimmunizacją • Cecha wspólna —> występowanie w krążeniu autoprzeciwciał skierowanych przeciwko antygenom własnym gospodarza. # • Autoprzeciwciała skierowane przeciwko antygenom powszechnie występującym w organizmiem gospodarza, nieswoiste np. antygeny jądrowe-DNA, białka histonowe. # • Autoprzeciwciała swoiste-skierowane przeciwko antygenom swoistym tylko dla określonej tkanki.# Diagnostyka • Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy: # - Immunofluorescencja pośrednia. # - Metody immunoenzymatyczne ( Test ELISA). # - Western blot lub immunoblot.# - Metody radioizotopowe.# - Techniki żelowe.# • Wykrywanie kompleksów immunologicznych w tkankach (wymaga uzyskania bioptatów):# - Immunohistochemia. # - Immunofluorescencja bezpośrednia.#

Immunofluorescencja pośrednia # • Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy lub innych płynach ustrojowych. # • Metoda jakościowa. # • Stosowane s# Immunofluorescencja bezpośrednia • Wykrywanie antygenów w tkankach biopsyjnych. # • Polega na bezpośrednim znakowaniu antygenu przy pomocy swoistego przeciwciała znakowanego FITC. # • Najczęściej jest stosowana na materiale biopsyjnym z nerki. # Metody immunocytochemiczne i western blot —> nierozpuszczalny.# Test ELISA —> rozpuszczalny. #

Proces odkrywania leków • Wybór choroby. # • Izolacja czynnika (białka) związanego z chorobą —> 2-5 lat. # • Synteza nowego związku —> 2-5 lat. # • Testy przedkliniczne in vitro i in vivo (na zwierzętach) —> 1-3 lat # • Testy kliniczne —> 2-10 lat. # • Akceptacja FDA, w Polsce Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych oraz Komisja Europejska —> 2-3 lata. # Koncepcja poszukiwania leków • Szukanie igły w stogu siana —> testowanie tysięcy substancji pochodzenia naturalnego i znalezienie tej, która działa. # • Konstrukcja klucza pasującego do zamka: # - Określanie miejsca docelowego.# - Skonstruowanie leku działającego w tym miejscu. # / Koncepcja zamka i klucza # • Znajomość topologi miejsca wiązania —> dane z krystalografii i/lub NMR. # • Nawet poprawne wytypowanie miejsca wiążącego nie gwarantuje sukcesu. # Komputerowe wspomaganie projektowania leków • Identyfikacja celu. # • Krystalografia, NMR.# • Struktura 3D kompleksu ligand-receptor # • Farmakofor lub model miejsca wiążącego # • Poszukiwanie baz danych i dokowanie lub generowanie ligandów de novo. # • Synteza i analiza aktywności. # • Badanie biologiczne. # Farmakofor • Trójwymiarowe ułożenie grup chemicznych wspólnych dla związków aktywnych i niezbędnych dla ich aktywności. # Miejsca docelowe substancji terapeutycznych. • Enzymy. # • Receptory (30% leków):# • Receptory sprzężone z białkami G (GPCR). # • Zaburzenie prowadzą do astmy, nadciśnienia tętniczego, stanów zapalnych, chorób sercowonaczyniowych, nowotworów, układu nerwowego. # • Receptory kanałów jonowych —> choroby sercowo-naczyniowe i centralnego układu nerwowego. # Proces odkrywania leków • Struktura wiodąca to związek o właściwym działaniu. # • Nie musi działać silnie i może wykazywać działania niepożądane. # • Jest punktem wyjścia. # Źródła struktury wiodącej • Dawniej: # - Roślinne. # - Zwierzęce.# - Mikroorganizmy.# • Dziś:# - Medycyna ludowa. # - Istniejące leki. # - Naturalne ligandy i modulatory. # - Przypadek. # - Synteza kombinatoryczna. # - Projektowanie z wykorzystaniem NMR. # - Projektowanie wspomagane komputerowo. #

Nanotechnologie w biologii molekularnej i medycynie • Skala nano (jedna miliardowa metra). # • Odległości międzyatomowe. # • Systemy mikroelektromechaniczne (MEMS).# 1 Å = 10-10 m = 0,1 nm # Biochipy • Półprzewodnikowe czujniki chemiczne. # • Szybkie i dokładane pomiary. # • Miniaturyzacja sprzętu. # • Minimalne zużycie odczynników. # • Obecnie produkowane są biochipy przystosowane do określonych ...