Wykład 4 mykologia - Notatki z wykładu 4 PDF

Preview

Summary

lecture four...

Description

Wykład 3: Pobranie materiału w przypadku grzybicy narządu rodnego - pobrany materiał w badaniu mikologicznym ocenia się mikroskopowo z zastosowaniem KOH – pozwala zaobserwować strzępki grzybni lub pączkujące komórki drożdży. KOH rozpuszcza komórki nabłonka oraz komórki zapalne pozostawiając dobrze widoczne elementy grzybni - preparat bezpośredni z 10% KOH i solą fizjologiczną - barwienie Grama - najczęstszą metodą jest hodowla Centralny system nerwowy Materiał do badań : płyn mózgowo-rdzeniowy – CSF- 3-5ml – przez nakłucie lędźwiowe Płyn zagęszcza się przez wirowanie; osad jest przeznaczony do posiewów, przygotowania preparatów bezpośrednich, ewentualnie zakażania zwierząt, supernatant do wykonania testów serologicznych Schorzenia laryngologiczne Materiał do badań: Wymazy z ucha, wydzielina z zatok szczękowych, wymazy z jamy ustnej, języka, dziąseł i podniebienia. Z jamy ustnej pobiera się wymaz wacikiem zwilżonym jałową wodą lub 0,9% NaCl. Gałka oczna Materiał do badań: wymazy z worka spojówkowego, zeskrobiny z owrzodzenia rogówki( podejrzenie o keratomycosis – pobranie platynową ezą), płyn z ciała szklistego poprzez wkłucie do gałki ocznej w przypadku podejrzenia o grzyba zapalenia struktury wewnętrznej oka. Grzybica uogólniona Materiał do badań: •

• •

Krew – pobrana bezpośrednio przy łózku chorego i posiana natychmiast do podłoża płynnego Sabourauda. Jeśli potrzebny jest transport, wówczas dodaje się środek zapobiegający krzepnięciu krwi, nie wykazującego działanie przeciwdrobnoustrojowego (np. cytrynian sodu) W przypadku podejrzenia grzybicę głęboką posiewy z krwi żylnej są negatywne – wówczas pobiera się krew tętniczą. Szpik – materiał pomocny w ustaleniu kilku grzybic głębokich (histoplazmoza, kryptokokoza, parakokeidiomykoza); pobiera się 3-5 ml aspirowanego materiału do pojemnika z rozcieńczoną heparyną 1:1000.

Grzybice narządowe Materiał do badań: • • •

Punktaty pobrane drogą biopsji narządów ( np. punkcje opłucnowo-płucne, jelitowe, wątroby i nerek) Płyny pochodzące z klatki piersiowej, jamy brzusznej i stawów, ropa z owrzodzeń lub ropni pobrana przez aspirację czy też z drenu DO WYKONANIA TESTÓW SEROLOGICZNYCH pobierana jest: SUROWICA, PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY, I INNE PŁYNY USTROJOWE

1

Pobieranie materiału w przypadku grzybicy narządowej Podejrzenie – grzybica narządowa (tj. głęboka), wykonuje się badanie bezpośrednie oraz hodowlę. Materiałem stosowanym do przeprowadzenia określonych badań : krew, płyny ustrojowe, plwocina, BAL, wymazy z ran, górnych dróg oddechowych, płyn mózgowo-rdzeniowy, kał, wycinki, biopłaty Materiały do wykonywania testów serologicznych - surowica - płyn mózgowo-rdzeniowy, lub inne płyny ustrojowe - 5- 10 ml do szklanej lub plastikowej probówki bez antykokoagulantów ( materiał do oznaczania stężenia leków przeciwgrzybiczych, bada się krew lub inne płyny ustrojowe (5-10 ml) do szkl. Lub plast. Probówek bez antykoagulantów) Uzyskanie wyniku negatywnego nie wyklucza rozpoznania zakażenia grzybiczego Klasyfikacja grzybów chorobotwórczych

2

Badania histologiczne w diagnostyce grzybicy •

•

•

Bioptaty pobierane drogą biopsji narządów Rzadko w przypadku grzybicy skóry, identyfikuje się infekcję na podstawie badania histologicznego skóry zmienionej chorobowo Metoda PAS Preparaty histologiczne barwią się – elementy grzyba fuksyną na ciemnoczerwono, tkanka pacjenta nie barwi się Srebrzenie Uwidocznienie się ostrych, czarnych kontur komórek grzyba ( iniekcja srebrem)

Sposób wykonywania preparatów histologicznych - materiał utrwala się 10% formaldehydem lub 70% alkoholem etylowym - przygotowuje się bloczki parafinowe - wykonuje się skrawki parafinowe na mikrotomie Barwienie preparatów histopatologicznych • • • • •

Hematotoksyna, eozyna – barwienie proste – Aspergillus, Mucor, Rhizopus Metoda PAS – fuksyna barwi grzybnię na ciemnoczerwono Impregnowanie srebrem (Grocott/Gomori) Barwienie mucykarminem – otoczki Cryptococcus neoformans Fiolet krezylowy – strzępki cenocetyczne Zygomycetes, Aspergillus się nie barwi

Identyfikacja grzybów drożdżopodobnych Grzyby drożdżopodobne – są czynnikami etiologicznymi grzybic narządowych, błon śluzowych i skóry. Materiał kliniczny zróżnicowany. Działania laboratoryjne w zakresie diagnostyki: - preparaty bezpośrednie - hodowla - ocena makroskopowa hodowli 3

- ocena mikroskopowa - próba filamentacji (test kiełkowania, germ tube test) – proces transformacji morfologicznej u niektórych grzybów, polegający na przechodzeniu z formy drożdżakowatej (blastospora) przez formy kiełkujące(germ tubes) z charakterystycznymi wypustkami nitkowatymi do nitkowatej pseudostrzępki. Służy do wykrywania Candida albicans. Hodowla grzyba w surowicy krwi (króliczej najczęściej). - ocena morfologii na podłożu zubożonym - identyfikacja na podstawie prób biochemicznych •

Preparaty bezpośrednie: ✓ Wilgotne np. wymaz z błon śluzowych ✓ Barwione metodą Grama – z większości materiału ✓ Rozjaśnione – łuski skórne, plwocina

Preparaty negatywno-pozytywne – w przypadku podejrzenia kryptokokozy z tuszem Glińskim •

Hodowla:

Uzyskanie wzrostu grzybów na podłożu, potwierdzenie ich obecności w preparacie z hodowli to dowód obecności grzybów w badanym materiale klinicznym. ✓ Podłoże agarowe Sabourauda ✓ Podłoże agarowe Sabourauda z dodatkiem antybiotyku przeciwbakteryjnego ( chloramfenikol, temp. Inkubacji 37°C i 27°C, czas 7-10 dni) Plwocina, mocz i kał – posiew ilościowy Krew – na podłoże płynne Sabourauda Grzyby Pityrosporium – na podłożu Sabourauda z dodatkiem oliwy z oliwek •

Ocena makroskopowa hodowli:

Tylko orientacyjne ustalenie rodzaju lub gatunków grzybów. Większość grzybów drożdżopodobnych: - kolonie gładkie - konsystencja gęstej śmietany - kolor: białe lub kremowe Kolonie szorstkie – Candida krusei Kolor koralowy – Rhodotorula Kolonia kremowa, śluzowata – Cryptococcus neoformans Kolonia skórzasta – Geotrichum •

Ocena mikroskopowa:

Ocena morfologii komórek w mikroskopie świetlnym – preparaty barwione. Obserwacja zarodników bezpłciowych: - blastospory – powstają w wyniku pączkowania - artrospory – powstające w wyniku segmentacji grzybni - oidia – powstające w wyniku odrywania się komórek od strzępek grzybni - chlamydospory – grubościenne komórki utworzone przez rozszczepienie strzępki, o charakterze przetrwalnikowym. Wstawowe – interkalarne, boczne – lateralne, szczytowe – terminalne ( wstawowaC.albicans, wszystkie rodzaje – C.dublinensis) - askospory – umieszczone w worku (ascus) pozwalają na odróżnienie drożdży właściwych (Ascomycota) od grzybów drożdżopodobnych. 4

Techniki bezpośrednie Wykonuje się je ze wszystkich materiałów biologicznych w 0,85% roztworze NaCl, także z dodatkiem 0,1% safraniny(wybarwia grzyby). Widoczne są: • • • • • • • •

Komórki pączkujące, strzępki i pseudostrzępki – Candida, Trichosporum, Geotrichum Komórki pączkujące lecz bez pseudostrzępek – Candida glabrata Szrokie otocznie – Cryptococcus Liczne komórki pączkujące związane z komórkami macierzystymi wąskimi połączeniami – Paracoccidioides brasiliensis Sporangia – Coccidioides immitis Strzępka z konidioforami na szczycie buławkowato rozszerzonymi – Apergillus Konidiofory na szczycie proste lub podzielone 2-3 razy lub wielokrotnie – Penicillium Sporangiofory tworzące na szczycie sporangia, wypełnione sporangia sporami – Zygomycetes( Rhizopus lub Mucor)

Podejrzenie zakażeniem dermatofitami: - zeskrobiny pobiera się jałowym skalpelem i materiał umieszcza się na szkiełku podstawowym w 1-20% roztwór NaOH lub KOH z dodatkiem 5% glicerolu lub 60% roztworu dwumetylosulfotlenku (DMSO) Preparaty barwione Rozmazy , preparaty histologiczne Rozmazy suszy się i utrwala w 70% alkoholu metylowym lub płynie Schaudinna, a następnie barwi. Strzępki barwi się hematoksyliną i eozyną, komórki drożdży i pseudostrzępki na G+. - barwnik Giemsy lub Wrighta – grzyby niebieskie - metoda Gridleja – kolor purpurowo-czerwony a tło żółte - metoda Gomoriego w modyfikajci Grocotta – wykrywanie strzępek (srebrzenie) - odczyn PAS – grzyby na czerwono, tło jasnozielone - preparaty w kropli tuszu chińskiego lub indyjskiego - barwienie mucykarminem – do uwidocznienia polisacharydowej otoczki Cryptococcus Barwnik Giemsy – wykrywanie Histoplasma capsulatum Fiolet krezolowy – sprzężniaki (Zygomycota) Fuksyna kwaśna – pleśniaki i kropidlaki Błękit laktofenolowy – barwienie drożdży Wartość diagnostyczna preparatów bezpośrednich Rozpoznanie zakażenia grzybiczego oparte na: ➢ ➢ ➢ ➢

Obserwacji klinicznej Bezpośredniego badania mikroskopowego Testy serologiczne Badania laboratoryjne : makrohodowla, testy biochemiczne, mikrohodowla

Badania mikroskopowe bezpośrednie - zakres i stopień rozwoju grzybów w organizmie - uzupełnienie obrazu zmian patologicznych 5

Cel: określenie wartości preparatów bezpośrednich Preparaty bezpośrednie: - obecność grzybów - stosunek ilościowy mikroorganizmów - obecność fazy rozwoju ( Y i M) Wykład 4: Podłoża do hodowli Podłoża stosowane w diagnostyce mikologicznej ➢ Klasyczne, przeznaczone do izolacji i przechowywania grzybów ➢ Różnicujące, pomocne przy identyfikacji grzybów Podłoża klasyczne 1. Naturalne – wyciągi roślin lub tkanek zwierzęcych, rzadko stosowane (agar z brzeczką) 2. Peptonowe – bulion i agar SA, stosowane często z dodatkiem antybiotyków lub cykloheksamidami 3. Syntetyczne - do hodowli grzybów pleśniowych Podłoża różnicujące Do wykrywania różnić morfologii oraz do określania aktywności biochemicznej grzybów P. Gorodkowej – do wykrywania aksospor, które odróżniają drożdże workowe od drożdży podstawkowych P. zubożone – do wykazywania chlamydospor oraz pseudogrzybni ( np. PCB,MAT) P. do zymogramu – do określenia zdolności fermentacyjnych węglowodanów P. do auksanografii węglowodanowej – do określenia zdolności asymilacji węgla ze związków węglowodanowych 5. P. do auksanografii związków azotowych – do oceny zdolności przyswajania azotu ze związków azotowych (pepton, mocznik, (NH)2SO4, KNO3) 6. P. z mocznikiem – do określenia zdolności do wytwarzania ureazy 7. P. YNB- do oznaczania wrażliwości grzybów

1. 2. 3. 4.

Identyfikacja grzybów Podział diagnostyczno-kliniczny: - grzyby drożdżopodobne – drożdże - grzyby pleśniowe - dermatofity - grzyby dimorficzne

6

Wstępne różnicowanie rodzaju grzybów (kolonie na agarze SA i cechy mikroskopowe)

Rhizopus + Rhizomucor

k. skórzasta

( Acremonium) Na powierzchni krople

Konidiofor+ szara kolonia = Cladosporium

Identyfikacja grzybów pleśniowych ➢ Preparaty bezpośrednie: - rozjaśniony - barwienie Grama 7

➢ Hodowla: - na podłożu SA z dodatkiem chloramfenikolu - na podłożu Czapek-Doxa – grzyby dobrze konidiują 27° i 37° C, 3-5 dni -> Inkubacja ➢ Ocena makroskopowa -zabarwienie -konsystencja ➢ Mikrocechy: - metody Gerlacha ( kształt konidiofora i zarodników oraz ułożenia) Dermatofity ➢ Preparaty bezpośrednie: - rozjaśnione z łusek skórnych i opiłków paznokciowych przy pobieraniu włosków – lampa Wooda ➢ Hodowla: - na SA bez dodatków - na SA z antybiotykiem - na SA z antybiotykiem i cykloheksymidem - podłoże z dodatkiem wzkaźnika barwnego np. DTM – w przypadku wzrostu dermatofitów wybarwia się podłoże. Temp. 27°C, czas do 6 tygodni. A. żółty – wynik negatywny, B. czerwony – wynik dodatni ➢ Ocena makroskopowa - specyficzne wybarwienie Trichophyton rubrum – czerwony barwnik T. violaceum – fiołkowe kolonie Epicoccum floccossum – kolonie oliwkowe - konsystencja kolonii Trichophyton mentagrophytes – mączysta Microsporum gypseum – gipsowata Trichophyton rubrum – puszysta Pleomorfizm – zanik narządów owocowania. Wynik: zmieniony obraz kolonii, utrudniający identyfikacje, przyczyna: wielokrotne przesiewanie dermatofitów ➢ Ocena mikroskopowa: - mikrohodowle szkiełkowe w wilgotnych komorach (płytki Petriego) temp. 27°C, czas 5 do 15 dni -preparaty barwione błękitem metylenowym z laktofenolem (wg. Gerlacha) - identyfikacja na podstawie makro – i mikrokonidiów oraz obecności i wyglądu owocników ➢ Próby biochemiczne: - na ureazę – na podłożu stałym z mocznikiem i wskaźnikiem barwnym( Trichophyton rubrum – próba ujemna, T. mentagrophytes – roszczepia mocznik) - test perforacji włosa – wykorzystuje aktywność metaboliczną dermatofitów w stosunku do keratyny. Różnica na podstawie szybkości perforacji włosa (akt. rozkł. I asymil. Keratyny)

8

ZYGOMYCOTA

ASCOMYCOTA

9

CHROMAGAR CANDIDA: Ma składniki chromogenne, 24h i 37°C -> inkubacja C. albicans – zielony C. tropicalis – niebieski C. kreusei - różowy ASCOMYCOTA – podłoże SA, Czapek-Dox

10...