Chapitre Phototropisme PDF

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Mr ST MARCOUX...

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CHAPITRE SUR LE TROPISME I. Les tropismes! " Un tropisme est une courbure du a un stimulus. Ce stimulus n’est pas homogène et va permettre la réponse d’un organisme qui engendre un mouvement orienté. La courbure de l’organe est du a un différentiel de croissance des cellules. Cette courbure va donc être irréversible. Nous allons trouver deux types de tropismes : le phototropisme et le gravitropisme. Il y a aussi l’hydrotropisme et le thigmotropisme (ou haptotropisme, qui est la réponse au contact). Ces tropismes sont des adaptations physiologique à la vie fixée des plantes (car les plantes ne peuvent pas se déplacer). Le repose du tropisme peut être positive ou négative. Cela dépend de l’organe et du type de signal reçu. Le type de réponse a ces tropisme vont influencer la forme de la plante. Qui dit croissance, dit auxine. L’auxine a un rôle extrêmement important dans les réponses tropiques chez les végétaux.!

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A. Le phototropisme!

" Le phototropisme fait que, quand l’éclairement est homogène, les plantes poussent vers le ciel. Si l’éclairement n’est plus homogène mais plutôt unilatéral, les plantes vont pousser vers la lumière. Il va donc y avoir une réorientation pour optimiser la lumière qu’elles reçoivent. Il y a donc un phototropisme positif pour les parties aérienne. Malgré le gravitropisme qui devrait tendre la tige a être droite, les parties aériennes se réadaptent. Ainsi, le phototropisme est plus important pour les plantes que le gravitropisme. Si on essaye d’éclairer les racines sans toucher a la gravité, elles vont essayer de fuir la lumière (elle va pousser en biais). Le phototropisme est donc négatif pour les racines.! " L’héliotropisme des tournesols n’est pas de la croissance. Ce n’est donc pas vraiment de tropisme. !

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1. Quelques expériences historiques!

" Nous travaillons souvent avec des monocotylédones. Le coléoptile des monocotylédones est un organe qui est très interessant pour les expériences car il n’y a pas de méristeme. Il n’y aura donc pas de multiplication cellulaire mais uniquement de l’élongation/de la croissance cellulaire. ! " Si nous travaillons sur des dicotylédones, nous allons utiliser un organe : l’hypocotyle. ! " Nous avons donc effectuer des expériences sur les hypocotyles ou sur les coléoptiles, et nous avons déterminer un modèle pour toutes les plantes par la suite. ! " Darwin s’est intéressé a comment réagissait les plantes au phototropisme (a un éclairement non homogène). Il a donc fait une suite de petites expériences. Il y a une plante témoin (avec un éclairement homogène, puis unilatéral) qui se réoriente après éclairage unilatéral. Darwin a donc voulu savoir ou était perçu le signal. Il a donc couper la tête du coléoptile et il s’est aperçu qu’il n’y avait pas de courbure. Si, au lieu de couper, on cache la tête, il n’y a pas de réponse non plus. Si on place le cache sous l’apex, il y a courbure de la plante. Le signal lumineux est donc capté au niveau de l’apex du coléoptile. De plus, la courbure se fait dans la zone d’élongation en dessous : ceci implique donc un transport, une transmission du signal. ! " 40 ans après, des scientifiques ont décider de déterminer quel était le signal trouvé par Darwin. Il y a donc eu une série d’expérience sur des coléoptiles de graminées. Ils ont insérer entre l’apex et la zone d’élongation un bloque d’agar. Il y a quand même réponse : ainsi, le message est bien transporté malgré la présence du bloque d’agar. Ce n’est donc pas un signal de type nerveux. Si, au lieu de mettre de l’agar, nous mettons du mica ou du beurre de cacao (gras), il n’y a pas de réponse. C’est donc un signal Page 1 sur 13

chimique (car ne passe pas le mica) hydrosoluble (car ne passe pas le corps gras). Ils ont ensuite insérer une feuille de mica du coté obscur : il n’y a pas de courbure. Si on met la feuille de mica du coté de l’éclairement : il y a courbure. Le signal passe donc du coté opposé a l’éclairement. ! " Nous avons ensuite imbibé un bloc d’agar avec ce qui est produit par l’apex. Nous avons posé ce bloc sur le coté d’un coléoptile, il y a courbure a l’opposé du bloc. Il y a donc croissance du coté du bloc, et courbure. Il y a donc une molécule formée par l’apex qui est capable d’induire de la croissance cellulaire. ! " Nous avons essayé de trouver cette molécule. Les scientifiques ont montré que cette molécule est présente dans l’urine (on mange des végétaux, et ce que nous avons mangé se retrouve dans l’urine). Cette molécule est l’auxine. ! " Il y a plusieurs molécules d’auxine. La molécule qu’ils ont trouvé a l’époque était la forme AIA. ! " Vers la fin des années 30, nous avons vu immerger le modèle de Cholodny-Went, qui permettait d’expliquer le p hot ot rop i s me : l e li e u d e perception de la lumière est l’apex. L’apex va relocaliser sa production d’auxine vers une seule face du coléoptile (sombre) et, sur cette partie la, il y a croissance, et donc courbure. Notons que si la lumière est homogène, l’auxine est distribuer de manière homogène. ! " Cependant, quel est le mécanisme en lui même ? Et comment est capté la lumière ? !

" " PHOT1!

2. La perception de la lumière et la caractérisation du photorécepteur

" Les première expérience qui se sont intéressées a la perception de la lumière ont eu lieu en 1864 par monsieur Sachs. Il a utiliser des couleurs différentes pour éclairer les plantes. Il avait une réponse maximale avec de la lumière bleue. Les UV aussi permettait la réponse phototropisme. On a donc un récepteur qui est sensible aux UV et a la lumière bleue (350-500 nm).! " Au fin du XXème siècle, nous avons fait des expérience dans le but de caractériser ce récepteur. En voici quelques unes. ! " A la fin des années 80, on a pris des coléoptiles éclairés dans toutes les directions puis ils les ont découpé en morceaux de 5 mm. Ils ont enlever les membranes puis ont incubé avec des ATP radioactif (avec du Phosphate radioactif). Ils ont ensuite regarder l’ensemble des protéines sur un gène. Nous observons une bande a 116kD qui apparait a la lumière et qui est absente a l’obscurité. De plus, plus nous sommes vers l’apex, plus il y a de protéines radioactives. Cette expérience montre qu’il y a une protéine membranaire de 116kD qui, en présence de lumière bleue, est phosphorée uniquement a la lumière. ! " Si on éclaire avec un éclairement unilatéral et que nous fendons dans toute la longueur du coléoptile en séparant la partie lumière de la partie obscurité et que nous faisons pareil. Nous obtenons une protéine marquée (phosphorylée) que du coté de la lumière. La question que nous pouvons nous posée est : est ce que cette protéine est bien le récepteur que nous cherchons ? ! " Pour aller plus loin, il nous fallait Arabidopsis et des mutants pour trouver un gène qui servirait au phototropisme. Une équipe de chercheurs ont donc utilisé deux mutant d’Arabidopsis : Phot1 et Phot2. Ces deux mutants ont des réponses altérées de phototropisme (pas de réorientation). Cependant, n’importe quelle étape peut être concernée (mutée). Ainsi, quand nous regardons la protéines précédemment découvertes avec un Western Blot (détection avec des Page 2 sur 13

anticorps). Dans le mutant 1, il n’y en a presque plus. Quand nous faisons la même expérience que précédemment avec l’ATP radioactif, nous n’avons plus de protéines. Phot1 code donc pour le récepteur. ! " Par la suite, le gène Phot1 a été cloné. Nous avons regardé son niveau d’expression (la quantité d’ARNm) : nous avons remarqué que le gène s’exprime plus dans la pointe de la partie apicale (vers 2 à 3 mm de distance par rapport a l’apex du coléoptile). Chez les dicotylédones (comme Arabidopsis), Phot1 est plutôt au niveau des cotylédons et de l’hypocotyle.! " Nous avons ensuite étudier le mode d’action de la protéine Phot1. Nous avons trouvé des domaines LOV1 et LOV2. Ce sont des domaines qui sont retrouvé dans beaucoup de protéines qui répondent a la lumière. Ces domaines ont la capacité de lié des cofacteurs : chez Phot1, ils lient les FMN (flavine mononucléotides) qui sont des photophores (qui change leur conformation selon la lumière). Il y a en plus de ces domaine LOV, un domaine Kinase qui est capable de phosphorer d’autres protéines. Dans ce domaine kinase, il y a une serine (S851) qui, si on la mute, abolit complètement la fonction de la protéine. Cette sérine peut être phosphorylée : c’est en réalité la perte de la phosphorylation qui entraine la perte du fonctionnement de Phot1. Cette protéine Phot1 a donc a la fois une fonction de phos phor yl at ion, e t q ui d oi t a us si ê tre phosphorylée pour être active. ! " Quand on passe la protéine Phot1 de l’obscurité a la lumière, nous avons une liaison covalence qui se fait entre les cystéines du domaine LOV et entre les FMN. Le souffre de la cystéine est réduit et forme une liaison covalente. Ceci entraine un changement de configuration et le domaine Kinase se décale du domaine LOV2. Par conséquence, ce domaine devient actif. LOV 2 est donc le domaine de perception de la lumière. LOV1 est peu être impliqué dans la régulation de la protéine, ou dans la dimérisation des protéines Phot1. ! " Quand ce domaine Kinase est actif, il y a une autophosphoryation de la Kinase et ce domaine va aller prosphoryler d’autres protéines. ! " Pour information, il y a une deuxième photorécepteur qui a été trouvé : Phot2. Il a les même fonction que Phot1 mais n’intervient pas dans les mêmes conditions.!

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3. La relocalisation de l’auxine!

" On sait que l’auxine est produite dans les tissus jeunes et elle circule dans la plante plutôt de haut en bas, vers les partie les plus anciennes. Comment peut on faire circuler des molécules ? Entre les cellules (paroi) ou dans les cellules. L’auxine a des transporteurs d’influx (entrée dans la cellule) dont une des grandes classes est la classe AUX. L’auxine a aussi des transporteurs de déflux qui font sortir l’auxine des cellules (comme PIN ou ABC). ! " L’auxine peut se protonnée, notamment quand elle est dans l’apoplasme (dans la paroi, qui est plus acide). L’auxine protonnée est capable de passer assez facilement entre les membrane, sans transporteurs. Il y a donc une partie de l’auxine qui rentre d’elle-même dans la cellule. La polarisation des transporteurs est très importante pour la circulation de l’auxine. Si nous devons changer la circulation de l’auxine, il faut changer l’emplacement des transporteurs. ! "

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a. Mise en évidence!

" Nous avons essayé de comprendre si le parcours de l’auxine était modifié. Nous avons pris des coléoptiles séparés en deux par une lame de verre. Soit cette séparation est jusqu’en haut, soit nous laissons la partie apicale libre. Nous mettons un éclairement unilatéral. Nous dosons le taux d’auxine a gauche (obscurité) et a droite (lumière). Quand la lame de verre va jusqu’en haut, il y a autant d’auxine a droite qu’a gauche. Si la lame de verre Page 3 sur 13

ne monte pas jusqu’en haut, il y a 30 unités d’auxine coté obscurité et 10 unités d’auxine coté lumière. Lorsque nous empêchons le déplacement avec le témoin (lame de verre jusqu’en haut), nous observons que la synthèse est la même des deux coté. L’expérience en plus (lame de verre qui ne monte pas jusqu’en haut) nous montre que l’auxine est transportée d’un coté (obscurité). De plus, en marquant l’auxine, nous avons pu déterminer qu’il n’y avait pas de dégradation. Ainsi, ce n’est pas un problème de dégradation ou de synthèse mais bien de transport. ! " De plus, nous avons analysé des hypocotyles de l’apex a la partie d’en bas, et nous déterminer le taux d’auxine a la lumière (asymétrique) et a l’obscurité. Lorsque nous faisons cela, nous observons que la quantité d’auxine est très importante dans la partie apicale. De plus, nous observons qu’au bout de 20 minutes, il y a une différence entre la quantité d’auxine a l’obscurité et celle a la lumière. La relocalisation de l’auxine affecte principalement la partie apicale. Si nous mettons des inhibiteurs d’auxine, il n’y a pas de courbure de l’hypocotyle. " ! " D’autres scientifiques permettent de mettre en évidence l’auxine via une construction particulière. Cette construction s’appelle pDR5-GFP : c’est un gène qui répond a l’auxine car sa partie promotrice contient des elements qui répondent a la présence d’auxine (ARE). Ainsi, nous allons faire un montage au laboratoire avec la partie promotrice de DR5 et la gène GFP (fluorescence). Ainsi, lorsque nous fais cela, nous allons avoir des protéines GFP la ou il y aura de l’auxine (c’est un gène rapporteur d’auxine). ! " Nous mettons notre construction dans une plante sauvage et dans une plante mutante phot1. Chez le sauvage, nous observons de l’auxine coté sombre et pas coté éclairé. Chez le sauvage, nous n’avons pas d’auxine coté sombre et pas coté éclairé non plus. Il y a donc une lien entre l’activité de phot1 et le transport de l’auxine. Comment est ce que cette relocalisation d’auxine se fait ? ! "

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b. PIN3!

" La transporteur PIN3 est un transporteur d’auxine. C’est un transporteur d’efflux, qui fait sortir l’auxine de la cellule. ! " Nous avons fusionner PIN3 avec la GFP. Devant cette construction, nous avons mis une partie promotrice PPIN3 devant. Ainsi, cela va donner une protéine PIN3 qui va être fonctionnelle et repérable dans les tissus. Nous observons qu’a l’obscurité, nous avons du PIN3 principalement dans le cylindre vasculaire et dans l’endoderme autour de ce cylindre (de partout). Si nous éclairons latéralement la plante, nous avons :! - 4h et 12h après l’éclairage : la fluorescence dans la membrane des cellules de l’endoderme diminue coté éclairement. Cette diminution est uniquement vers le coté extérieur (pas vers le coté cylindre vasculaire). La protéine PIN3 n’est donc pas présente coté externe éclairé. ! - Eclairage des deux cotés : la fluorescence disparait des deux cotés coté externe toujours (pas coté interne vers le cylindre). ! " S’il n’y a pas de PIN3 dans la paroi externe, alors l’auxine ne peut pas passer dans le cortex. Dans ce cas, les cellules n’ont pas d’élongation. Tout le flux d’auxine géré par PIN3 va aller dans le cylindre central. Il va y avoir des maximas d’auxine dans le cylindre (notons que quand il y a maxima, il y a croissance). ! " Si nous effectuons en même temps un montage DR5-GFP (gène rapporteur a auxine). Nous observons les deux sans et avec BFA (inhibiteur du transport de vésicules intracellulaires), Page 4 sur 13

avec un éclairement unilatéral de gauche. Lorsqu’il y a présence de BFA, nous avons toujours PIN3 localisé sur la membrane externe de l’endoderme et l’auxine n’est présente ni coté sombre ni coté éclairé. Nous pouvons donc déduire que les transporteurs PIN3 doivent, pour être retiré de la membrane externe, avoir des trafic de vésicules. Si on empêche le trafic vésiculaire, alors nous n’avons pas de relocalisation de l’auxine. ! " Ce qui est bizarre c’est que, lorsque nous avons du BFA, nous nous attendons a avoir de l’auxine des deux cotés (car PIN3 fait passé des deux cotés) : cependant nous en avons que dans le cylindre central. Ceci est surement du au fait qu’il n’y a pas que le tropisme qui agit et qu’il n’y a pas qu’un type de transporteur. ! " Quand nous effectuons un mutant PIN3 (pas de fonction de la protéine PIN3), nous observons que le mutant se courbe un peu moins que le témoin sauvage mais il se courbe quand même. Il y a donc un effet mais ce n’est pas le seul qui joue (autres protéines PIN par exemple).! " De plus, l’auxine n’agit pas que dans le cas du phototropisme : ainsi, l’analyse est compliqué (car le flux d’auxine est perturbé a chaque fois que nous avons un processus de croissance cellulaire). On ne sait pas encore si tout cela a un lien avec Phot1. S’il y a un lien entre Phot1 et PIN3, il n’est pas évident. On sait que Phot1 (qui est une kinase qui phosphoryle) ne phosphoryle pas PIN3 directement ! ! " Nous avons trouvé PID qui est une qui agit sur PIN3 (en la phosphorylant). PID était réprimé par la lumière : cette répression entraine la polarisation et la relocalisation de PIN3. ! " " " c. ABCB19! ! " Ce sont des transporteurs d’efflux de l’auxine. ! " Nous avons mis des ABCB19 dans des membrane de levure et nous avons ajouté des protéines Phot1 purifié et de l’ATP radioactif. ! " Quand nous sommes a l’obscurité, Phot1 peut se phosphorylée seule (un peu plus a la lumière). Si nous prenons ABCB19 seule a la lumière, nous n’avons rien. Si nous prenons B19 et Phot1 a l’obscurité, nous n’avons rien. Cependant, a la lumière, il y a phosphorylation de B19 par Phot1 (bande noir qui apparait en plus). ! " Deuxième expérience : nous avons pris des cellules HeLa (lignée de cellule humaine immortelle avec lesquelles ont travail en laboratoire) et nous avons exprimé B19, Phot1, ou les deux. Nous avons pré-incubé les cellules avec de l’auxine radioactive (qui rentre dans les cellules HeLa). Par la suite, nous lavons les cellules : nous obtenons un milieu dit «& froid& » sans radioactivité a l’extérieur des cellules. Quand nous ajoutons du ABCB19, l’auxine sort énormément (flux important). Si on ne met que Phot1, l’auxine ne sort pas. Quand on met les deux, on a une sortie d’auxine que lorsque nous sommes en obscurité. En effet, Phot1 est active a la lumière : elle va donc pouvoir phosphorylé B19 et donc désactiver B19 (donc pas de sortie d’auxine). ! " Ainsi, du coté lumière, nous n’avons pas de sortie d’auxine par B19. Du coté obscurité, nous avons flux d’auxine par B19, ce qui entraine un élongation des cellules coté obscurité et une courbure. ! " Le modèle retenue est que la phosphorylation de B19 entraine un bloquage de l’auxine et donc une accumulation de l’auxine dans les partie à l’apex (image 2) : ceci entrainera un bloquage de la croissance des parties a l’apex. Ceci est validée par le fait qu’avant la courbure, il y a un bloquage de courbure. Par la suite, il y aurai des transporteurs qui induiraient la passage de l’auxine vers le coté sombre, ce qui entraine une descente de l’auxine du coté sombre et donc l’accumulation de k’auxine dans l’épiderme coté sombre. Cette accumulation dans l’épiderme coté sombre va Page 5 sur 13

entrainer une élongation des cellules coté sombre et donc une courbure. ! "

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d. Questions ouvertes!

" Finalement, est ce qu’il y a un seul transporteur impliqué dans le phototropisme ? C’est une question flou mais on pense que c’est l’action conjointe de plusieurs transporteurs. ! " Quel est le lien entre Phot1 et les transporteur ? On ne sait pas encore.! " Ou est relocalisé l’auxine ? On ne sait pas réellement ou, pourquoi et comment vu que nous n’avons pas les transporteurs précis. !

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4. Le rôle de l’auxine sur la croissance cellulaire!

" " L’auxine va premièrement permettre le relâchement des parois. Lorsque cette paroi est suffisamment lache, alors la cellule pourra «& pousser dessus&» et va pouvoir permettre l’élongation. Comment ce relâchement a lieu ? L’auxine va agir sur le transporteur membranaire ABP : ABP va activé une pompe a proton qui va permettre la venu de protons dans la paroi. Les protons vont agir sur la liaison entre les peptines et le calcium. Ces peptines interagissent entre elle avec des calcium, de base, ce qui fait que la paroi est dure. Les protons vont donc acidifier la paroi et donc enlever les Calcium (car les protons prennent la place des Ca). En plus de cela, dans l’apoplasme (dans la membrane), nous avons des protéases : ce protéases deviennent actives que lorsque le pH est acide. Ceci va entrainer la dégradation de certaines partie de la paroi. ! " En plus de cela, nous avons une entrée d’eau et de potassium dans une vacuole. Cette vacuole va donc entrainer une croissance : nous allons obtenir une cellule turgescente qui va entrainer une pression sur la paroi relâchée : ceci va permettre l’élongation. ! " Il semble que le transporteur ABP est impliqué dans le phototropisme. ! " De plus, l’auxine va permettre une modification de la transcription dans les cellules via un système complexe : l’auxine va être réceptionné par un récepteur intr...