Compte rendu génétique moléculaire S5 BCP PDF

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Mr Magnard...

Description

MARTINEZ Anaëlle, LOUREIRO Justine! L3 BCP!

COMPTE RENDU TRAVAUX PRATIQUES DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

Introduction! Des bactéries résistantes à l’ampicilline ont été isolées. Un insert ADN a été inséré dans un vecteur de polyclonage (Promega) au niveau du gène LacZ des plasmides contenant le gène de résistance à l’ampicilline et une origine de réplication. Deux souches bactériennes ont été mises à disposition, une souche contenant le plasmide i et la seconde contenant le plasmide v. Le plasmide i est le plasmide contenant l’insert et le plasmide v ne contient pas l’insert.! Les objectifs de ce TP est d’effectuer différentes techniques expérimentales associées au clonage moléculaire. Les plasmides i et v seront extraits des souches bactériennes i et v par la technique de mini-préparation d’ADN plasmidique. Ils seront ensuite amplifier par PCR étant une technique d’amplification à la fin de laquelle un grand nombre de copies d’ADN plasmidique est obtenu. De plus, la cartographie du plasmide i sera effectuée grâce aux digestions enzymatiques effectuées sur les deux plasmides avec différentes enzymes de restriction. Enfin, la transformation bactérienne permet d’intégrer les deux plasmides dans des bactéries qui seront mises en cultures afin de se multiplier et de multiplier en même temps l’ADN plasmidique, les différents milieux de cultures permettent de distinguer l’effet produit par l’ajout de l’insert dans les différentes cultures bactériennes. ! Ces manipulations permettent de répondre à différentes questions :! La quantité d’ADN (Q) obtenue par amplification PCR devrait théoriquement suivre une évolution exponentielle en fonction du nombre de cycles (n) telle que Qn = 2n x Q0 , en pratique la quantité obtenue en fonction du nombre de cycle suit-elle une loi exponentielle ? Quelle quantité de plasmide contient le tube de départ ?! Quelle est la taille de l’insert cloné dans le plasmide i ? ! Où sont situés les différents sites de restriction sur le plasmide i ? ! Quels sont les effets phénotypiques de l’ajout de cet insert à l’intérieur d’un gène fonctionnel (Lac Z) ? !

Matériels et méthodes ! Mini-préparation d’ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes! L’objectif de cette manipulation est d’isoler l’ADN plasmidique des bactéries auparavant mises en culture. ! Après centrifugation d’environ 1,5 ml de culture bactérienne et retrait du surnageant une première solution a été ajoutée. !

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Elle est constituée de :! • Glucose (50 mM) permettant permettant de modifier la pression osmotique de la solution, ! • Tampon Tris (25 mM) maintenant des conditions favorables de pH pour la cellule, ! • l’EDTA (agent chélatant) agissant sur la paroi bactérienne en piégeant les ions calciums et favorisant la lyse de la cellule,! • Lysozyme (4mg/ml) fragilisant les parois bactériennes en catalysant l’hydrolyse des peptidoglycannes ! Après l’ajout de cette solution, le tube contient l’ADN génomique, les ARNs, les protéines, les plasmides et les lipides. ! Une seconde solution contenant du SDS 10% et du NaOH 0,2N est ajoutée et permet de dénaturer l’ADN génomique et plasmidique. ! Une dernière solution d’acétate de potassium 5M est ajoutée et l’ADN génomiques ainsi que les protéines et débris précipitent au niveau du culot. Dans le surnageant, que l’on récupère, les ARNs, les plasmides ainsi que l’acétate de potassium sont présents. L’ADN plasmidique est précipité par de l’éthanol à 100°,rincé à l’éthanol 70° et séché. ! L’ajout de tampon TE (10mM Tris et 1mM EDTA) et de RNase permettent de dégrader l’ARN et de dissoudre l’ADN plasmidique dans le tampon. ! Réaction d’ amplification PCR ! Pour la réaction d’amplification par PCR effectuée à partir de l’échantillon contenant le plasmide i, 5 tubes ont été préparés dont l’un est un témoin négatif. Les 5 tubes auront un nombre de cycles chacun différents correspondant à : 5,10,20,30 cycles.! Chacun des quatre tubes comprend de l’eau, la solution de plasmide diluée à 1/50 ème, un tampon dilué 5 fois permettant des conditions de pH et de salinité optimale pour le fonctionnement de l’enzyme, des amorces sens et antisens, des désoxyribonucléotides permettant la synthèse d’ADN et en dernier lieu la Taq DNA polymérase.! Un dernier tube servant de témoin négatif est préparé, il contient tous les réactifs et le tampon mais pas d’ADN, dans le but de vérifier la possibilité de contamination de nos échantillons. ! Séparation par électrophorèse sur gel d’agarose! Cette technique a pour but de séparer et de quantifier (approximativement grâce à une échelle de poids moléculaire) de l’ADN en fonction de leur taille. L’ADN étant chargé négativement va pouvoir migrer et les fragments de plus petite taille se déplaceront plus rapidement que les fragments de plus grande taille. ! La migration s’effectue sur un gel d’agarose à 1,2 %. ! Lorsque la migration est terminée, le gel est plongé dans du bromure d’éthidium étant un agent intercalant de l’ADN permettant de le colorer et les résultats sont observés sous lumière UV. ! Pour la séparation par électrophorèse des produits PCR, deux tubes ont été préparés par dilution des produits correspondants à 20 et 30 cycles dans lesquels le rajout de tampon de charge a été effectué. Le tampon de charge permet d’alourdir ces échantillons pour qu’il reste dans le fond du puit et les colorer pour suivre la migration. ! 2

Les dilutions de ces deux produits permettent de diminuer la taille des bandes leur correspondant pour rendre possible leur quantification. ! Sur le gel d’électrophorèse, les migrations effectuées correspondent donc aux produits PCR de 5, 10, 20 (non dilué), 20 (dilué), 30 (non dilué), 30 (dilué) cycles ; le produit témoin, et l’échelle de poids moléculaire.! Pour les produits des digestions enzymatiques, 12 migrations ont été effectuées, les 6 digestions effectuées pour le plasmide i (simples et doubles) puis le plasmide i seul, deux migrations ont été effectuées pour l’échelle de poids moléculaire, puis les digestions simples du plasmide v et le plasmide v seul. ! Établissement d’une carte de restriction d’un plasmide par digestion enzymatique! La digestion enzymatique consiste à fragmenter l’ADN au niveau des sites de restriction grâce à des enzymes de restriction. Le but ici est d’établir la cartographie des deux plasmides, et principalement celle du plasmide i qui contient l’insert. De ce fait, il sera possible de déterminer la taille de l’insert ADN présent dans le plasmide i.! Pour cela 8 digestions sont effectuées dont 6 digestions simples, c’est à dire qu’une seule enzyme de restriction sont utilisées. ! Ces digestions simples sont effectuées par trois enzymes de restrictions : Eco R1, Hind3 et Sac1 pour chacun des plasmides i et v. ! De plus, 2 digestions doubles sont effectuées uniquement sur le plasmide i, la première est effectuée avec Hind3 et EcoR1 et la seconde est effectuée avec Hind3 et Sac1. ! Les tampons choisis pour réaliser ses digestions correspondent aux tampons dont l’activité enzymatique est optimale. ! Pour résumer : ! Plasmide I

Enzyme(s) de restriction

Tampon utilisé

Digestion 1 (simple)

Eco R1

H

Digestion 2 (simple)

Hind 3

E

Digestion 3 (simple)

Sac 1

E

Digestion 4 (double)

Hind 3 + Eco R1

E

Digestion 5 (double)

Hind 3 + Sac 1

E

Plasmide V

Enzyme de restriction

Tampon utilisé

Digestion 1 (simple)

Eco R1

H

Digestion 2 (simple)

Hind 3

E

Digestion 3 (simple)

Sac 1

E

Pour chacune des digestions, en plus du plasmide, du tampon et des enzymes la BSA (Albumine de sérum bovin) est ajoutée pour améliorer le fonctionnement des enzymes. ! 3

Le travail s’effectue sur glace, les digestions sont ensuite incubées à 37 °C température optimale pour le fonctionnement des enzymes. ! Transformation bactérienne des bactéries avec les plasmides v et i! La transformation bactérienne sera effectuée à partir des plasmides i et v. ! Des bactéries compétentes E.Coli sont utilisées pour cette transformation bactérienne. À ces bactéries sont ajoutés chacun des plasmides i et v. ! Chacun des mélanges sont placés durant une minute à 43°C pour créer un choc thermique aux bactéries, puis le mélange est placé environ deux minutes sur la glace puis deux minutes température ambiante.! Les bactéries sont ensuite transférées dans du milieu liquide LB puis placez sur agitateur durant 45 minutes à 37°C. ! Les bactéries sont ensuite mises en culture dans milieu contenant du X-Gal et contenant de l’ampicilline. ! Une troisième boite témoin est effectuée sur laquelle les bactéries non transformées sont mises en culture dans un milieu contenant ni X-Gal ni ampicilline. ! Chacune des boites seront placées à 37°C pendant une nuit. !

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Résultats! Figure 01 : Résultats de l’électrophorèse de la réaction d’amplification par PCR du plasmide i!

A

B

C

D

E

F

G

H

! ! Amorces

A. B. C. D. E. F. G. H.

Pour 5 cycles d’amplification! Pour 10 cycles d’amplification ! Pour 20 cycles d’amplification ! Pour 20 cycles d’amplification (produit PCR dilué)! Pour 30 cycles d’amplification ! Pour 30 cycles d’amplification (produit PCR dilué)! Produit d’amplification témoin ! Échelle de poids moléculaire !

Les résultats de l’électrophorèse montrent l’absence d’une bande pour le produit PCR ayant effectué 5 cycles. L’absence de bande signifie que le l’ADN plasmidique a été amplifié mais la quantité d’ADN est faible et n’est pas apparent sur le gel d’électrophorèse. Pour les produits PCR ayant effectué 10,20,30 cycles, la taille des bandes augmente en fonction du nombre de cycles, ce qui montre que dans chacun des cycles, la quantité de plasmide amplifié augmente. ! Pour le produit d’amplification témoin, l’absence de bande montre une absence (ou très peu) de contaminations. ! Les résultats obtenus suite à cette amplification sont donc exploitables.!

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Figure 02 : Graphique représentant la quantité d’ADN amplifié en ng par nombre de cycles et les différentes phases de la courbe sur papier millimétré! La courbe semble montrer une évolution exponentielle de la quantité d’ADN en fonction du nombre de cycles, notamment entre 10 et 20 cycles d’amplification. À partir de 20 jusqu’à 30 cycles, l’évolution de la courbe semble linéaire. ! !

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B

A

Figure 03 : Graphique représentant le log (quantité d’ADN amplifié en ng) en fonction du nombre de cycles sur papier semi log! A. Courbe représentant l’évolution de la quantité d’ADN amplifiée en pratique! B. Courbe représentant l’évolution de la quantité d’ADN amplifiée théorique! Sur le papier semi log, une courbe exponentielle doit être traduite par une droite, modélisée par la courbe B (théorique). Ici, la courbe (pratique) montre éventuellement une évolution exponentielle entre 10 et 20 cycles. Néanmoins, sur l’ensemble de l’amplification la courbe n’est pas linéaire et montre une évolution non exponentielle de la quantité d’ADN en ng par rapport aux nombre de cycles. !

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! A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

Figure 04 : Résultats d’électrophorèse de la digestion enzymatique des plasmides i et v! A. B. C. D. E. F. G. H. I. J.

Digestion du plasmide i par Eco R1! Digestion du plasmide i par Hind3! Digestion du plasmide i par Sac1! Digestion du plasmide i par Eco R1 et Hind 3! Digestion du plasmide i par Hind 3 et Sac 1! Plasmide i (non digéré)! Échelle de poids moléculaire! Digestion du plasmide v par Eco R1! Digestion du plasmide v par Hind 3! Digestion du plasmide v par Sac 1!

!

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!

Figure 05 : Photographie de la boite témoin constituée du milieu LB sans X-Gal et sans ampicilline placée à 37°C pendant une nuit. ! Le tapis bactérien obtenu dans la boite témoin est constitué de bactéries E.Coli non transformées, constituant des colonies incolores. !

! Figure 06 : Photographie de la boite contenant les bactéries E.Coli transformées avec le plasmide i dans un milieu LB supplémenté de X-Gal et d’ampicilline! Le tapis bactérien présente des colonies bactériennes incolores. !

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Figure 07 : Photographie de la boite contenant les bactéries E. Coli transformées avec le plasmide v dans un milieu LB supplémenté de X-Gal et d’ampicilline ! Le tapis bactérien présente des colonies bactériennes colorées en bleu. !

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Discussion ! Amplification PCR! Sur l’électrophorese le produit PCR témoin ne présente pas de bande apparente, ce qui prouve qu’il n’y a pas, ou très peu, de contaminations. ! Les bandes ont toutes migrées sur la même distance. La taille du produit amplifié est d’environ 450 pb. ! Pour l’échantillon correspondant à 5 cycles, les résultats montrent l’absence de bande, la quantité de produit obtenu est donc impossible à calculer. ! Pour l’échantillon correspondant à 10 cycles, l’intensité de la bande montre une quantité d’ADN proche de 60 ng. Cette valeur est obtenue en comparant l’intensité de la bande et l’échelle. ! Pour l’échantillon correspondant à 20 cycles, l’échantillon «$pur$» ne permet le calcul de la quantité d’ADN, donc le calcul s’effectue à partir de la l’échantillon dilué. L’échantillon dilué montre une bande avec une intensité correspondant à 60 ng, or puisque cet échantillon est dilué 10 fois la quantité d’ADN correspondant au produit 20 cycles «$pur$» est de 600 ng. ! Le même calcul est effectué pour l’échantillon de 30 cycles, pour le produit PCR dilué 10 fois on l’intensité de la bande correspond à environ 150 ng. Le produit PCR «$ pur$ » possède donc une quantité d’ADN de 1500 ng. ! Les quantités d’ADN théoriquement attendues peuvent être calculées à partir de la quantité d’ADN obtenue à 10 cycles. Les calculs sont effectués pour 15, 20, 25 et 30 cycles. ! Nombre de cycles

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Quantité d’ADN obtenue en pratique

Quantité d’ADN théoriquement attendue

60 ng

60 ng

15

20

600 ng

25 30

1500 ng

Calcul effectué Qn = 2n x Q0

1,96 mg

Q15 = 215 x 60 = 1,96.106 ng!

62,91 mg

Q20 = 220 x 60 = 62,91.106 ng

2g

Q25 = 225 x 60 = 2.109 ng = 2g

64 g

Q30 = 230 x 60 = 64,44.109 ng = 64g

Ratio : quantité ADN théoriquement attendue/ quantité ADN pratique

104

5.107

Les valeurs obtenues pour la quantité d’ADN théoriquement attendue sont nettement supérieures aux valeurs obtenus dans la pratique. Pour les valeurs correspondant à 20 cycles, la quantité d’ADN théoriquement attendue est 104 fois supérieur à la quantité d’ADN obtenue en pratique. ! Pour les valeurs correspondant à 30 cycles, la quantité d’ADN théoriquement attendue est 5.107 fois supérieure à la quantité d’ADN obtenue. !

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Sur le graphique représentant la quantité d’ADN en ng obtenue en pratique en fonction du nombre de cycles effectué sur papier millimétré, la courbe montre une évolution exponentielle. Cependant, sur le graphique sur papier semi-log, la courbe représentant la quantité d’ADN attendue (B) forme une droite, ce qui montre que sont évolution est exponentielle. La courbe obtenue dans la pratique contient non seulement des quantités d’ADN bien inférieures aux quantités attendues mais la courbe ne forme pas une droite. L’évolution de la quantité d’ADN en pratique en fonction du nombre de cycle n’est pas exponentielle. ! Cette différence peut être expliquée par la quantité de chacun des produits présentes dans la réaction. La quantité d’amorces, de nucléotides, d’enzymes pourraient être insuffisantes pour effectuer un grand nombre d’amplifications. De plus, il est possible que les amorces s’auto-hybrident ou qu’elles s’hybrident avec des séquences provenant de contaminations. ! Il est aussi probable que l’amplification de l’ADN n’ai pas le temps de se terminer avant la fin de la phase d’élongation, ce qui donnera un brin avec des extrémités incomplètes empêchant la fixation des amorces. !

Sur la courbe représentant la quantité d’ADN en ng en fonction nombre de cycles (Figure 04) montrent 3 phases : ! 1. Phase d’initiation : la quantité de fragment amplifié est insuffisante pour générer une bande sur le gel d’électrophorèse! 2. Phase exponentielle : l’amplification débute et suit une évolution exponentielle! 3. Phase de la cinétique où la polymérase devient un facteur limitant. L’accumulation de fragments amplifiés s’effectue de manière constante! Pour calculer la quantité de plasmide contenu dans le tube PCR de départ, la quantité de fragments obtenue à 10 cycles est utilisée telle que : ! & Q10 = 210 x Q0 = 60 ng! & Q0 = 60/210 = 5,8.10-2 ng d’ADN plasmidique contenu dans le tube PCR de départ. ! Cartographie du plasmide! Les plasmides i et v non digérés montrent sur l’électrophorèse 3 bandes correspondant aux trois conformations prises par l’ADN qui sont des formes circulaire relachées, linéaire et super enroulées (respectivement aux bandes présentes sur le gel, de haut en bas). Ces différentes bandes montrent que les molécules d’ADN peuvent aussi migrer en fonction de leur conformation sur un gel d’électrophorèse. ! &

Calcul de la quantité de plasmide i obtenue dans 50 ul de mini préparation!

Le résultat obtenu dans l’électrophorèse pour le plasmide i non digéré (F) montre une bande d’intensité correspondant à 60 ng. ! Donc parmi les 20 ul chargés sur l’électrophorèse, 5 ul de ce volume correspondent à 60 ng de plasmide i. Les 5 ul ajoutés proviennent directement de la mini-préparation d’ADN. ! Donc pour 50 ul de préparation : ! & & Quantité de plasmide i = (60 x 50)/5 = 600 ng de plasmide i présent dans la mini-préparation d’ADN !

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Le résultat obtenu dans l’électrophorèse pour le plasmide v non digéré (K) montre une bande d’intensité correspondant à 150 ng. ! En utilisant le même raisonnement : ! & & Quantité de plasmide v = (150 x 50)/5 = 1500 ng de plasmide v présent dans la mini-préparation d’ADN! & Vérification de la quantité de plasmide i présent dans les 50 ul de mini préparation d’ADN par rapport à la quantité d’ADN de départ dans le tube PCR! La quantité d’ADN de départ contenue dans le tube PCR, précédemment calculée, correspond à 5,8.10-2 ng de plasmide. Cette quantité correspond à la quantité d’ADN présent dans 18 ul de chargement sur le gel d’électrophorèse. `' Donc dans les 20 ul préparés : ! & & & Quantité d’ADN = (5,8.10-2 x 20)/ 18 = 6,4.10-2 ng dans 20 ul. ! Dans le tube préparé contenant 20 ul, les 6,4.10-2 ng d’ADN correspondent au 5ul de la solution de plasmide dilué au 1/50ème.! Donc dans les 50 ul de solution diluée au 1/50 ème : ! & & & Quantité d’ADN = (6,4.10-2 x 50)/5 = 0,64 ng dans 50 ul de plasmide i dilué au 1/50 ème ! Puisque la dilution est effectuée au 1/50 ème, 5 ul de plasmide i non dilué ont été utilisé pour effectuer la dilution : ! &

&

Quantité ADN = 0,64 x 50 = 32 ng de plasmide i pour 5 ul de solution !

Donc pour 50 ul de mini-préparation d’ADN :! & & Quantité ADN = (32 x 50)/5 = 320 ng de plasmide i contenu dans 50 ul de la mini préparation d’ADN. ! Alors, la quantité de plasmide i obtenue à partir du résultat d’électrophorèse du plasmide i non digéré, soit 600 ng, est inférieure à la quantité obtenue grâce au calcul effectué à partir des résultats obtenus grâce à la PCR, soit 320 ng. ! Cette différence de résultats peut provenir de plusieurs faits : ! - Des erreurs de pipetages lors de la réalisation des dilutions ou du chargement des gels d’électrophorèse! - Insuffisance de mélanges des solutions obtenues avant le pipetage! - Une différence de résultats dus à la PCR...