Molbio Ausarbeitung SS17 von MMMayr PDF

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Ausarbeitung meiner Vorlesungsmitschriften und der PowerPoint-Folien...

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Molekularbiologie Die Beschreibung und Erklärung biologischer Zusammenhänge auf Ebene der Moleküle, vor allem geht es um DNA, RNA und Proteine. Nicht gebunden an Fachbereiche (Kommt in allen Bereichen der Biologie vor!!) Lediglich durch Einsatz chemischer, biochemischer und physikalischer Methoden definiert. Voka Vokabeln beln Nukleinsäure: Moleküle aus denen die DNA und RNA aufgebaut ist Gen: eine Einheit vererblicher Information im Genom Chromosom: entspricht einem DNA-Molekül mit Proteinen Genom: Gesamte genetische Material eines Organismus Transkriptom: Gesamtheit der aus dem Genom translatierten RNA Proteom: Gesamtheit der aus dem Genom kodierten Proteine Genotyp: die genetische Beschaffenheit des Organismus Phänotyp: die physische Beschaffenheit des Organismus Dogma

Hat Roger Kornberg einen Nobelpreis eingebracht Es geht aber auch anders: RNA Interferenz durch Dicer-Proteine (kann Genexpression steuern bei doppelsträngiger RNA) Weitere geschichtliche Entdeckungen o Nuklein aus Eiter isoliert o Einführung des Begriffs Nukleinsäure o Aufklärung der Struktur der 20 Aminosäuren o Verknüpfung von Aminosäuren in Proteinen gezeigt o Experiment zum Träger der Erbinformation (Frederic Griffith)

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Hitze-inaktivierte virulente Erreger der Lungenentzündung (IIIS) wurden der Maus injiziert -> Maus lebte Nicht virulente Erreger (IIR) wurden der Maus injiziert -> Maus lebte Virulente Erreger wurden der Maus injiziert -> Maus starb Hitze-inaktivierte virulente Erreger und nicht virulente Erreger wurden der Maus injiziert -> Maus starb -> lebende IIIS Bakterien konnten isoliert werden Infolge dessen wurden von Avery, MacLeod und McCarty IIIS Bakterien in Einzelteile zerlegt und das Experiment mit diesen Komponenten wiederholt. Nur beim Experiment mit DNA bildeten sich aus dem IIR-Typ ein IIIS-Typ Folgeru Folgerung ng ng:: Die DNA und nicht das Protein sind für die Virulenz verantwortlich. Interpretation:

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Beweis, dass DNA Erbinformation ist und nicht Virulenz indirekt verändert: Hershley und Chase:  T2-Phagen: gezüchtet in S35, der in die Proteine der Phagen eingebaut wurde  T2-Phagen: gezüchtet in P32, der in die DNA eingebaut wurde  T2-Phagen wurden zu Bakterien gegeben, anschließend die leeren Proteinhülsen der Phagen durch Scherkräfte im Mixer von den infizierten Bakterien getrennt und die Lösung zentrifugiert.  Bei S35-markierten Phagen befand sich die Radioaktivität in den leeren Hülsen  Bei P32-markierten Phagen befand sich die Radioaktivität in den infizierten Bakterien Was ist ein Gen? -> Ein Gen – ein Enzym – Hypothese o Beadle und Tatum  A-(G1->E1) B –(G2->E2)  C  Jedes Enzym kodiert durch ein Gen  Man verwendet einen haploiden Pilz, bei dem Mutationen sofort ausgeprägt werden  Mutagene Strahlung  Es kommt zur Mutation:  A-(G1->E1) B –(G2->E2) C  Auf einem Vollmedium kann der Pilz wachsen, da Vorstufe B für C vorhanden ist.  Auf einem Minimalmedium kann der Pilz nur dann wachsen, wenn Substanz B vorhanden ist!

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Im Aminosäurestoffwechsel gibt es 21 Aminosäuren. Wächst der Pilz beispielsweise nur auf Arginin, ist das ein Zeichen dafür, dass ihm das Gen für Arginin fehlt und er Arginin nicht selbst herstellen kann.  So kann man feststellen, welches Gen von der Mutation betroffen ist:  Enzymkette mit Vorstufen ist bekannt.  Pilz wird auf jeder Vorstufe kultiviert  Je nachdem, wo der Pilz wächst, ist die Mutation. Watson und Crick: DNA ist eine Doppelhelix (Aufklärung durch Röntgenstrukturanalyse) o Ein feststehender Einkristall (kristalline Form der Substanz) wird mit weißem Röntgenlicht durchstrahlt. Doppelstrang: o Semikonservative Replikation (Meselson-Stahl-Experiment) 

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Prote Proteinau inau inaufbau fbau Erste Sequenz wurde an Insulin aufgeschlüsselt (Sanger) o Endgruppenbestimmung

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Polypeptid wurde mit Dinitrofluorbenzol behandelt -> Reagiert mit dem NTerminus Teilweise Hydrolyse Chromatographische Auftrennung (Trennung von Stücken ohne N-Terminus) Totalhydrolyse Analyse der Aminosäuren -> Schlussfolgerung auf die Sequenz

  Später abgelöst durch Edman-Methode, heute Analyse massenspektrometrisch o Proteinsynthese durch RNA-haltige Organellen (Ribosomen) (Emil) -> herausgefunden durch Elektronenmikroskop! Inform Informati ati ations ons onsgehal gehal gehaltt der DNA Information steckt in der Sequenz, der genetische Code ist ein 3er Code Experiment: Matthaei und Nirenberg o Herstellung künstlicher RNA und Übersetzung in ein Peptid durch E. coli Proteinsynthese o 1. Durchgang: 1 Nukleotid (Poly-U) führt zu Polypheylalanin (Anticodon: UUU) o 2. Durchgang: 2 Nukleotide (U, G), die in allen möglichen Kombinationen aneinander gereiht sind; Wahrscheinlichkeitsmäßig ergeben sich gestimmte Verhältnisse Sharp und Roberts: Eukaryotengene sind unterbrochen; DNA und mRNA lagern sich nicht direkt nebeneinander an; DNA bildet loops -> Introns Arbeite Arbeiten nm mit it D DNA NA o Smith: Restriktionsenzyme -> Herstellung rekombinanter DNA -> Zerschneiden in reproduzierbar große Stücke -> ligieren mit anderer DNA o Southern: Untersuchung der geschnittenen DNA -> Southern blot o Sanger: Kettenabbruchsynthese o PCR:  Denaturieren des Doppelstrangs  Forward-Primer und Reverse-Primer hinzugeben -> Annealing  Elongation  Anfangs bilden sich Stränge beliebiger Länge, später Stränge mit definierter Länge. Die definierten Stränge vermehren sich exponentiell, die undefinierten nur linear.

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 Primer müssen neu hinzugegeben werden; sie werden beim Prozess verbraucht. Verbesserte Sequenziermethoden durch den Einsatz fluoreszenzmarkierter ddNTPs, ab 1986 automatisierte Sequenzierung -> Vereinfachung vieler Methoden, sensitivere Nachweisverfahren für Medizin, Forensik und Nahrungsmittelindustrie Seque Sequenzier nzier nzierun un ung: g: o Klassisch:  Denaturierung  Primer anbringen  Verlängerung  Diese Schritte wiederholen o Shotgun-Sequenzierung:  DNA in Stücke zerlegen  Die Enden mit bekannten Stücken flankieren (klonieren)  Ausgehend davon die unbekannte DNA sequenzieren  Überlappende Sequenzen werden vom Computer erkannt und zu einem Strang zusammengefügt. o Genomsequenzierung ist nur durch schnelle Methoden und leistungsfähige Computer möglich! o Man muss mit Shotgun-Sequenzierung so lange den Versuch wiederholen, bis alle Lücken aufgefüllt sind! o Anwendung: Personalisierte Medizin (manche Medikamente funktionieren bei manchen Leuten, bei anderen nicht) o

Das Prote Protein in Funktion o Gerüst von Zellen und Geweben, Katalysatoren, Rezeptoren, Schalter, Motoren, Pumpen... o Grundlage: können Bindungen für Interaktionen eingehen o Die Sequenz definiert die Art der Interaktion (z.B. den Liganden) o Die Bindung ist das zentrale Element der Funktion!  Antikörper: Leichte Kette und Schwere Kette tragen die Antigen-Bindestelle, welche variabel ist.

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Enzyme

Kinasen katalysieren das Anhängen von negativ geladenen Phosphatgruppen von ATP auf Proteine-> Konformationsänderung -> molekularer Schalter für Struktur, Aktivität, Lokalisierung  Phosphatasen können Phosphat wieder abspalten -> umgekehrter Effekt Anderer Schalter: G-Proteine G-Proteine:: Ras ist ein globuläres Protein mit Funktionen bei intrazellulärer Übermittlung von extrazellulären Wachstumssignalen. Bei Tumoren häufig Mutationen des ras-Gens.  Normal: GTP bindet: Aktiv. Phosphor wird abgespalten: Inaktiv. GDP wird langsam abgespalten: Inaktiv. GTP bindet (schnell): Aktiv  Mutation: GTP kann nicht in GDP umgewandelt werden: Dauerhaft aktiv -> onkogen G-Proteine können also durch Phosphorylierung oder durch GTP-Bindeproteine als Schalter funktionieren Motoren: Allosterische Wanderproteine sind verantwortlich für Muskelkontraktion, Zellwanderung, Vesikeltransport, Trennung der Chromosomen bei der Zellteilung...  Tubulin-Autobahnen reichen durch die Zelle  Wanderproteine: Streckt und haftet durch ATP-Bindung  Nach Hydrolyse zieht es sich wieder zusammen -> wandert Pumpen: Na-Cl-Pumpe  Baut Potentiale für Prozesse auf  Die Ionen werden unter Verbrauch von ATP in der Zelle eingelagert 

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Aufbau: o Makromoleküle aus L-Aminosäuren (20 versch.) o Primärstruktur: Sequenz der Aminosäuren (unter 20 AS: Peptide, darüber Polypeptide)  Aminosäure: Zentraler Kohlenstoff mit Säuregruppe, Aminogruppe und Seitengruppe.  Alle natürlichen Aminosäuren haben L-Konfiguration  Verknüpfung über Peptid-Bindung; die freie NH2-Gruppe am N-Terminus und die COOH-Gruppe am C-Terminus gehen eine Bindung ein.  Ausgehend von der Translationsrichtung ist der N-Terminus vorne

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Sekundärstruktur: Räumliche Anordnung  Starre Aminosäuren, flexible Verbindungen dazwischen  Dadurch nur bestimmte Strukturen möglich  Struktur wird durch Interaktion der Seitenketten definiert  H-Brücken  Elektrostatik  Hydrophobe Interaktion (Polare Seitenketten nach außen, apolare nach innen, um sie vor wässrigem Medium abzuschirmen -> Sequenz der Aminosäuren hat eine Funktion dabei)  Komplexe  Kovalente (Disulfid-Brücken bei Cystein)  Es kommt auch zu Renaturierungen! (manchmal aber nur mit Chaperonen)  Strukturen:  Alpha-Helix o H-Brücken zwischen CO und NH der viertnächsten Aminosäure o Kein Prolin! (Helix-Brecher) o Spezielle:  Transmembran-Domäne: bei 20 Aminosäuren mit unpolaren Seitengruppen  Signalpeptid: Transmembran am N-Terminus (liegt mit dem Anfang in der Membran drin)  Doppelwendel: nur eine Seite mit unpolaren Seitengruppen. Winden sich umeinander durch hydrophobe Wechselwirkungen. (Oft in zellulären Strukturelementen; Keratin oder Myosin)  Beta-Faltblatt o H-Brücken zwischen CO und NH von parallelen/antiparallelen Strängen o Sehr regelmäßige Struktur o Kann nicht allein entstehen o Beispiel: GFP (fluoresziert Grün unter blauem Licht) o Tertiärstruktur: Dreidimensionale Struktur des Proteins: Faltblätter und Helices zusammen genommen  Lässt sich schwer von der Sequenz aus vorhersagen; daher Computermodelle und Röntgenstrukturanalyse o Domänen: Untereinheiten, die charakteristische Faltungen einnehmen und spezifische Funktionen haben o Quartärstruktur: Aufbau von Proteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten, die miteinander interagieren und wechselwirken -> Proteinpolymere (Kollagenhelix und Elastin)  Disulfid-Brücken können formgebend sein (bilden sich nur bei entsprechendem Redox-Milieu) Interaktionen von DNA und Proteinen: o Manche Gene codieren für Transkriptionsfaktoren o Die Interaktion zwischen DNA und Protein läuft in der Regel über 10-20 Kontaktstellen. Erst die Summe stellt sicher, dass die Interaktion spezifisch ist und sie sorgt dafür, dass sie sehr stabil ist. o Bindende Motive:  Helix-Turn-Helix Motiv: Die Erkennungshelix lagert sich in die große Furche der DNA ein und bestimmt die Sequenzspezifizität. Die aminoterminale Helix hilft bei der Positionierung. o

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Homöodomäne: 60 Aminosäuren langes Helix-turn-Helix-Motiv, das sich in vielen DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren findet, unter anderem in den Hox-Proteinen. Struktur aus 3 Helices, meiste Bindungen von Helix 3, Helix 1 hat einen flexiblen Seitenarm, der in die kleine Furche passt. Die Homöodomäne ist im Genom vieler Organismen vorhanden, auch, wenn diese nicht nah miteinander verwandt sind (z.B. Pflanzen und Hefen). Eine ähnliche Struktur führt zu einer ähnlichen Funktion bei all diesen Organismen.  Helix-Loop-Helix-Motiv: Kurze Alpha-Helix, lange Schleife, Lange Alpha-Helix. Es kommt zur Dimerisierung. Zwei Proteine bilden eine Klammer, die sich auf die Helix setzt. Verkürzte HLH-Proteine werden verwendet, um die normalen HLHProteine zu deaktivieren.  DNA-bindende Faktoren binden DNA häufig als Dimere, da dies zu einer stabileren Interaktion und mehr Spezifität (binden an 2 Doppelwendel, damit nichts dem Zufall überlassen wird) führt (2 Proteine für 1 Bindung!)  Dabei können mehrere Binde-Motive in einem Protein verwendet werden.  Leucin-Zipper-Motiv: Lange Alpha Helix, die auf einer Seite an DNA bindet, mit der anderen Seite dimerisiert. Leucin-Reste halten die Protein-Protein-Bindung in einer Doppelwendel (coiled coil)  Heterodimerisierung: Dimere können auch aus verschiedenen Proteinen gebildet werden. Die Kombinationsfähigkeit ermöglicht die sogenannte Komb Kombinat inat inatorisch orisch orische e Kontr Kontrolle olle  Zinkfinger-Motiv: Unterschiedliche 3D-Strukturen von Zn2+-interagierenden Proteinen. Sind zusammengesetzt aus Alpha-Helix und Beta-Faltblatt. Können Spezifität definieren und die Interaktionsstärke erhöhen. Lassen sich zu Trioder Tetrameren zusammenlagern, von denen jedes 3 Basen erkennt. -> Selektivität  TALE: Eine Domäne erkennt genau eine Base, es gibt 2 Aminosäuren, die über die Base bestimmen. Verschiedene Kombinationen dieser Säuren erkennen jeweils eine andere Base. -> Verwendung, um gezielt Mutationen auszulösen (in Verbindung mit Nukleasen, die an bestimmten Stellen schneiden Untersuchung von Proteinen: o Aufreinigung:  Säulenchromatographie:  Probe auftragen  Oben Lösungsmittel auffließen lassen  Manche Proteine wandern schneller als andere durch die feste Matrix der Säule  Unten kann man die getrennten Moleküle getrennt auffangen. 

Verschiedene Matrizen: (auch verwendbar für DNA und RNA) o Ionenaustausch-Chromatographie: Ausgenutzt wird die Ladung der Proteine  Positiv geladene Perlen  Negative Moleküle werden gebunden o Gelfiltrations-Chromatographie: Ausgenutzt wird die Größe  Poröse Perlen  Kleine Moleküle werden in den Perlen eingebremst o Affinitäts-Chromatographie: Ausgenutzt werden die eingegangenen Interaktionen  Perlen, die Substrat kovalent binden  Enzyme binden an das Substrat  Die anderen Proteine passieren ungehindert. Gelelektrophorese: SDS-Page 

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Auftrennung nach Größe o In SDS-haltiger Lösung aufnehmen, sodass die Moleküle eine Ladung erhalten o Unter alkalischen Bedingungen (Denaturiert) auftrennen o Im Gel färben (Silberfärbung) oder auf Membran übertragen (blotten) o Protein mit Antikörper nachweisen 2D-Elektrophorese: Kombination der isoelektrischen Fokussierung und Gelelektrophorese  pH-Gradient im Gel  Bei niedrigem pH-Wert ist das Protein positiv geladen, bei hohem pHWert negativ  Elektrisches Feld anlegen  Proteine wandern auf die andere Seite des Gels, bis sie den Isoelektrischen Punkt erreichen und somit neutral geladen sind  Ist das erfüllt, trennt man die Proteine auf einer anderen Achse der Größe nach auf  Die Verschiebung eines Punkts kann eine Phosphorylierung bedeuten. 

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 -> Punkt ausschneiden und massenspektrometrieren. Massenspektrometer: MALDI-TOF  Probe wird mit unterstützendem Matrix-Material auf einem Träger fixiert  Ein Laserstrahl löst die Teilchen als heißes Gas aus der Probe  Abgabe oder Annahme von Protonen -> Ionisierung  Beschleunigung der Teilchen und die Flugzeit messen  Die Flugzeit (TOF) ist abhängig von der Größe und der Ladung  Peptidanalyse  Proteinfleck aus Gel ausschneiden  Tryptische Verdauung: Peptide freisetzen und mittels MALDI-TOF bestimmen  Datenbanken (enthalten theoretisch berechnete Massen aller Peptide) nach Übereinstimmung durchsuchen  Gen identifizieren und isolieren  ODER  Proteinfraktion aus der Säulenchromatographie  Trypsinverdauung -> Peptide  1. Massenspektrometer-Durchgang: Peptidmassen  2. Durchgang: Massen der Fragmente  Massenunterschiede verwenden, um die Aminosäuresequenz zu erstellen -> Identifizierung des Gens Nachweis eines Proteins: Unter Spannung auf eine Membran blotten und mit Antikörpern färben Indirekte Immunocytochemie:  Primärer Antikörper erkennt das Antigen  Ein markierter sekundärer Antikörper mit Marker erkennt den konstanten Teil des primären Antikörpers  Marker:  Enzyme, Fluoreszenz, Metalpartikel  Enzyme: Alkalische Phosphatase, Peroxidase Herstellung von Antikörpern:  Reines Antigen wird in Zielorganismus injiziert 

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 Immunisierung erfolgt  Bluttest: wird der gewünschte Antikörper gebildet?  Erneute Injektion-> Gedächtniszellen lassen wieder Antikörper frei: Boost  -> Wiederholen, bis gewünschte Menge Antikörper vorhanden  Entnahme des Bluts mit Antikörpern o Sekundärantikörper: Antikörper mit Fluoreszenz bestücken ist teuer. Daher lässt man in einem zweiten Organismus Antikörper auf die Antikörper des Primärorganismus bilden, die man dann mit Fluoreszenz bestückt. o Um nicht ständig die immunisierten Viecher töten zu müssen, um an die Antikörper zu kommen:  B-Lymphozyt wird mit unsterblicher Tumorzelle (Myelom-Zelle) hybridisiert  Zwei Zelltypen werden zusammen mit fusionsförderndem Mittel zentrifugiert-> Heterokaryons bilden sich (unter Stromstoß)  Zellkultur auf Selektivmedium, das nur Heterokaryons wachsen lässt  Hybridzellen klonieren o In Organismen werden Polyclonale Antikörper gebildet (Antikörper für verschiedene Bindungsstellen). Durch die Herstellung von Antikörpern durch B-Lymphozyten lassen sich monoclonale Antikörper herstellen. Dafür muss man aber erst die richtige B-Zelle finden. o Prüfen: Der Überstand wird auf Antikörper getestet, die das gewünschte Antigen binden. o Positive Zellkulturen werden vereinzelt und erneut auf Antikörper getestet. o Die positiven Klone sind eine stete Quelle für Antikörper für das gewünschte Antigen. o Untersuchung von Proteinen: An das Protein wird eine zusätzliche Domäne angehängt, die die Funktion des Proteins nicht beeinflusst, aber für die es bereits Antikörper gibt. o Besondere TAGs: Fluoreszierende Proteine (GFP: Green Fluorescent Protein) ermöglichen in-vivo-Analysen DNA als genetisches Material o Erinnerung an das Experiment von Griffith o Erinnerung an das Experiment von Hershey und Chase DNA ist ein unverzweigtes Nucleotidpolymer mit C5-C3-Phosphodiesterbrücken und Doppelhelix mit Major Groove und Minor Groove o Kommt auch als dehydrierte DNA vor; ist dann RNA-ähnlich o Z-DNA ist links herum gedreht o Bei Eukaryoten linear o Bei Prokaryoten ringförmig (freie Enden sind ein Alarmsignal bei Bakterien; haben den Nachteil, dass sie Telomere bräuchten, die sie nicht haben) o Bei Viren kommt beides vor o Superhelix: Verdrillte Doppelhelix o Supercoils: Zahl der Verdrillungen o Negative Supercoils: DNA ist leicht entwunden und steht dadurch unter Spannung -> komplexe Strukturen o Superhelical gewundene DNA wandert in der Gelelektrophorese weiter DNA in Elektrophorese auftrennen: o Gelelektrophorese (DNA ist geladen) o Glycerol zur DNA-Lösung geben, dass die DNA nicht aus dem Gel herausdiffundiert (Glycerol macht die Lösung schwerer, sodass sie nicht nach oben steigen kann) o Färben mit Ethidiumbromid  Lagert sich zwischen zwei benachbarte Basenpaare  Leuchtet im UV-Licht Informationsträger DNA o Schreibweise: von 5‘ nach 3‘ o Bei Proteinkodierenden Sequenzen wird immer der Sense-Strang angegeben

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Kodierende Gene befinden sich auf beiden Strängen Bei uns nur geringer Prozentanteil kodierend; Rest:  Transposons  Retroviren-artige Elemente (vermutlich wg. Einem früheren Angriff durch Retroviren)  Repetitive DNA  Nicht Repetitive DNA (weder Introns noch Kodons)  Introns Verpackung mithilfe von Proteinen => Chromatin o Nukleosomen o Nachweis:  Partieller Verdau führt zu DNA-Fragmenten mit 160-240 Basenpaaren  Elektrophorese: An manchen Stellen kann die Nuklease nicht schneiden,...