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Simon DEGUINES

Licence Physique-Chimie Parcours Chimie Université du Littoral Côte d’Opale

RAPPORT DE STAGE

Effectué à l’institut de pharmacologie du

Synthèse d’un analogue de la deltorphine I ayant pour cible le récepteur delta

Du 2 mars au 29 mai 2015 Responsable de stage : Yves Dory Ph.D. directeur du laboratoire, en collaboration avec le laboratoire de Louis Gendron Tuteurs pédagogiques : Jean-Louis Beaudeau

Je tiens à remercier dans un premier temps Yves Dory et Louis Gendron sans qui cette expérience enrichissante au Canada n’aurait pas été possible, mais aussi de m’avoir donné la chance de découvrir un laboratoire de recherche, de travailler sur un projet intéressant et pluridisciplinaire en adéquation avec mes aspirations professionnelles dans le cadre de ce stage. Je remercie également et suis reconnaissant envers mes tuteurs Jean-Louis Beaudeau et Dominique Bella Ndong pour leur enseignement au quotidien et leurs conseils avisés tout au long de ces trois mois de stage, j’ai beaucoup appris et gagné en autonomie à leur côté. Enfin je remercie les autres étudiants gradués du laboratoire Thomas Marmin, Ha Dao Thi Thanh, Yanan Zhu, Vahid Dianati, Hui Xiao ainsi que Sophie Beauchemin assistante de recherche du laboratoire.

REMERCIEMENTS………………………………………………………………………..2 INTRODUCTION..................................................................................................................4 BIENVENUE A L’INSTITUT DE PHARMACOLOGIE DE SHERBROOKE...................4 1.

L’INSTITUT………...................................................................................................4 1. 1 HISTORIQUE..................................................................................................4 1. 2 PROJET ET OBJECTIFS...................................................................................4 1. 3 STRUCTURE ET GOUVERNANCE……………………………………………………...5

2.

LE LABORATOIRE DU PROFESSEUR YVES DORY..........................................6 2. 1 SUJET DE RECHECHE.....................................................................................6 2. 2

AU SEIN DU LABORATOIRE...........................................................................7

PRESENTATION DU PROJET…………………………………………………………….7 1.

SYNTHESE ORGANIQUE.......................................................................................9 1. 1 MANIPULATIONS ET RESULTATS.................................................................10 1. 2 PROBLEMES ET DIFFICULTES RENCONTRES...............................................14

2.

SYNTHESE EN PHASE SOLIDE………………………………………………...16 2.1 MANIPULATIONS ET RESULTATS.................................................................17 2.1.1 PRINCIPE DE LA SYNTHESE EN PHASE SOLIDE………………………17 2.1.2 2.1.3 2.2

CHOIX DE LA RESINE……………………………………………………...18 SYNTHESE DE L’ANALOGUE…………………………………………….18

PROBLEMES ET DIFFICULTES RENCONTRES………………………………20

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................22 BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………...23 GLOSSAIRE………………………………………………………………………………24 ANNEXES………………………………………………………………………………....25

J’ai effectué mon stage à l’institut de pharmacologie au sein du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke, sous la direction d’Yves Dory, professeur titulaire au département de chimie de l’université de Sherbrooke. J’ai ainsi eu le privilège de travailler dans un environnement de recherche scientifique et par conséquent enrichir mes connaissances et compétences en chimie organique et en chimie médicinale, travaillant en collaboration avec le laboratoire de Louis Gendron, professeur agrégé au département de physiologie et biophysique. Ce rapport attestera du travail accompli, des résultats obtenus et à améliorer ainsi que de l’expérience acquise d’un point de vue chimique mais également humain au cours de mon premier stage. Mon projet comportait deux parties, la première, prédominante constituée de synthèse organique pure et la seconde, de chimie médicinale. Je suivrai cette même logique au cours de mon développement en explicitant pour chaque phase du projet le contenu de mon travail, les résultats obtenus et les difficultés rencontrées.

1.

L’institut

1.1 Historique La recherche en pharmacologie et l’université de Sherbrooke sont intimement liées depuis plus de 40 ans. Au début des années 90, la création d’un institut de recherche en synthèse de biomolécules est envisagée à Sherbrooke par le professeur Pierre Deslongchamps. Il s’allia alors au professeur Pierre Sirois avec un groupe de professeur pour fonder ce qui allait devenir l’institut de pharmacologie de Sherbrooke (IPS), un édifice de plus de 2500 m 2 d’espace laboratoire. Il fut officiellement lancé en décembre 1997. 1.2 Projet et objectifs Le projet de l’IPS prend ses racines dans deux disciplines dans lesquelles l’université de Sherbrooke s’est distinguée au niveau international, la pharmacologie et la chimie organique. Le rapprochement de ces deux disciplines d’excellence a permis de jeter les bases du projet scientifique de l’IPS. Il trouve son essence dans une définition très simple de la pharmacologie : la science de l’étude des mécanismes d’interaction entre un principe actif et sa cible cellulaire.

Pour l’institut, la pharmacologie intègre des concepts et données issus de disciplines telles que la physiologie, la biochimie, la chimie médicinale et organique pour ne citer qu’elles et les applique à la validation de nouvelles cibles, la découverte de médicaments ou d’outils moléculaires diagnostiques qui bénéficieront aux patients, ainsi que l’optimisation de technologies de pointe. Le projet fondamental de l’institut vise :  

La mise en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires importants pour le développement de pathologies humaines. La découverte de nouvelles molécules bioactives possédant un potentiel diagnostique ou thérapeutique agissant sur ces mécanismes.

Les domaines médicaux ciblés par les applications issues de l’institut comprennent les maladies cardiovasculaires, respiratoires, les cancers, les maladies infectieuses et la douleur. Dans l’esprit du professeur Domenico Regoli, ancien directeur du département de pharmacologie en 1968 et aujourd’hui professeur émérite, les études en pharmacologie se doivent de côtoyer celles de la chimie médicinale : « c’est fondamental pour l’avancement des connaissances sur le médicament ». C’est avec cette philosophie que le département se développe et devient, grâce à ses succès et ceux de l’équipe de chercheurs une référence mondiale en pharmacologie respiratoire et cardiovasculaire. Aujourd’hui, l’IPS rassemble 33 chercheurs en 10 départements et 3 facultés (faculté de médecine et des sciences de la santé, faculté des sciences et faculté de génie). Il vise à valoriser les expertises et les réalisations de ses chercheurs via le partenariat avec des institutions académiques et des compagnies dont les axes de recherche recoupent ceux de ses chercheurs. C’est maintenant un partenaire de premier choix des entreprises de l’industrie pharmaceutique et biotechnologique. L’institut est donc un lieu de rencontres et d’échanges entre chercheurs et possédant des expertises diversifiées, un lieu où la combinaison et la cohabitation des expertises mènent à l’éclosion de projets scientifiques interdisciplinaires. L’IPS est avant tout un projet de synergie. 1.3 Structure et gouvernance L’institut de pharmacologie est constitué principalement d’un conseil d’institut qui assure le lien entre la direction universitaire et l’institut, approuve le budget, veille à ce que les initiatives scientifiques soient cohérentes et représente l’instance qui exerce l’autorité sur le directeur de l’institut. Le comité d’orientation externe, identifie quant à lui les domaines en émergence en pharmacologie ou en chimie pharmaceutique et reconnait les opportunités de collaboration scientifique avec des partenaires extérieurs.

Puis le comité de direction et d’orientation stratégique qui soutient la direction dans l’animation scientifique en assurant également la diffusion et le transfert d’informations entre les membres, les équipes et partenaires scientifiques, nécessaires à l’avancement des travaux de recherche. Et enfin l’équipe de direction nommée dernièrement en 2013. Organigramme de l’institut

Figure.1

2.

Le laboratoire du professeur Yves Dory

2.1 Sujets de recherche Le professeur Dory porte son attention sur la chimie médicinale, la chimie supramoléculaire ainsi que sur la modélisation. Il travaille notamment sur la conception de nanotubes et de nanosphères supramoléculaire. Son laboratoire travaille en collaboration avec celui du professeur Louis Gendron dans un projet ayant pour but l’obtention de molécules biologiquement actives pouvant conduire à un traitement de la douleur par activation du récepteur opioïde delta. A sa disposition pour aboutir à des conclusions le laboratoire dispose d’une RMN (300 MHz), d’une UPLC couplée à un spectromètre de masse, d’un Biotage, d’une HPLC analytique, HPLC préparatoire, d’un lyophilisateur.

2.2 Au sein du laboratoire

Il est constitué par 7 étudiants dont 5 en doctorat : Thomas Marmin, Jean-Louis Beaudeau, Ha Dao Thin Thanh, Vahid Dianati et Hui Xiao, 2 en maîtrise : Dominique Bella Ndong et Yanan Zhu ainsi que Sophie Beauchemin l’assistante de recherche. Divers projets sont en cours de recherche, chaque étudiant travaille sur le sien. Cependant l’entraide est omniprésente, chacun peut apporter ses connaissances pour éviter d’éventuelles déconvenues même si toute erreur est bonne à faire et source d’apprentissage. De ce fait, une certaine complicité y règne.

J’ai travaillé sur le projet coopératif entre les chimistes du laboratoire du professeur Dory et les pharmacologues de celui du professeur Gendron. Projet portant sur la synthèse de molécules biologiquement actives ayant pour cible le récepteur opioïde delta (DOPR). Ces composés appelées peptidomimétiques auraient pour rôle d’activer le récepteur delta via une bonne sélectivité pour ce dernier, une bonne résistance au métabolisme ainsi que la spécificité d’être hydrophobe, tout cela en minimisant les effets secondaires observés avec le récepteur mu et kappa. La pharmacologie est une grande consommatrice de peptides : un grand nombre de peptides sont synthétisés et testés pour leur interaction avec un récepteur ou leur capacité à induire une réponse biologique. Dans quel but ? Déterminer la valeur thérapeutique de ces molécules agonistes sélectives, par exemple pour le récepteur delta, afin de traiter la douleur inflammatoire chronique, en comprenant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la désensibilisation du récepteur. En effet la prise en charge de la douleur chronique est une problématique reconnue depuis peu, devenant une réelle priorité. Une application directe de ce projet de recherche pourrait être la substitution de la morphine, aujourd’hui utilisée à grande échelle et qui présente des effets indésirables tels que la dépendance physique et psychique, les vomissements ou encore la dépression respiratoire pour ne citer qu’eux. Le problème se pose lorsqu’aucun antalgiques n’est efficace et qu’une prescription morphinique est appliquée malgré tous les effets secondaires possibles, dans l’unique but de soulager le symptôme subjectif qu’est la douleur. Ainsi nous pensons que l’activation sélective du récepteur delta, présenterait moins d’effets secondaires et deviendrait une alternative aux opiacés, classe de médicaments dans laquelle la morphine est répertoriée.

Les questions à se poser sont : existe-t-il d’autres récepteurs opioïdes ? Comment fonctionne le mécanisme d’activation des récepteurs ? Et pourquoi cibler précisément le récepteur delta ? Les récepteurs opioïdes ou opiacés sont des récepteurs de neurotransmetteurs. Il en existe trois sortes : mu (μ), delta (δ) et kappa (κ), distribués en grande quantités dans le cerveau. Ces récepteurs et les peptides opioïdes endogènes produit naturellement par l’organisme forment ce que l’on appelle le système opioïdes endogène. Ce système, neuromodulateur contrôle une série de fonctions ou réponses de l’organisme dont la perception de la douleur (nociception), la réponse au stress et le contrôle des émotions (anxiété, dépression). L’effet euphorisant des opiacés est contrôlé par les récepteurs mu et delta, tandis que l’activation du récepteur kappa entraîne des troubles de l’humeur. L’étude des récepteurs a montré qu’ils appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G avec des opiacés comme ligands. Ces protéines G permettent le transfert d’informations dans la cellule déclenchant ou inhibant ainsi des réactions biochimiques dans celle-ci. Le couplage entre le récepteur et la protéine s’effectue à la surface interne de la membrane cellulaire. Lorsqu’un ligand, ici les peptidomimétiques opiacés qu’il s’agit de synthétiser dans le projet, active le récepteur couplé à la protéine, la protéine G se lie au récepteur, libère ses informations dans la cellule et déclenche différentes « signalisations en cascade » selon le type de récepteur. Le récepteur est capable quant à lui de moduler sa conformation pour accueillir le ligand et d’activer une nouvelle protéine G et ainsi de suite. Structure 3D d’une protéine G

Figure.2

Les études pharmacologiques en cours démontrent que la cible moléculaire majoritaire de la morphine est le récepteur mu car lorsque celui-ci est absent des souris étudiées, tous les effets de la morphine tels que la dépendance physique, la dépression respiratoire, l’analgésie sont abolis. Le récepteur kappa qui lui provoque les troubles de l’humeur est écarté, ne reste que le delta dont les récentes évaluations (2006) montrent qu’il joue un rôle important dans le contrôle de la douleur, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle pour le traitement des douleurs chroniques. Les ligands les plus utilisés jusqu’à présent pour activer ce récepteur sont des ligands peptidiques tels que la deltorphine.

Cependant des problèmes de sélectivité subsistent, notamment entre le récepteur mu et delta, d’où la nécessité de trouver une molécule de plus en plus spécifique pour le récepteur delta, stimulant seulement celui-ci et non ceux qui seraient responsables des effets secondaires les plus gênants tout en gardant l’effet antalgique, ceci étant le but recherché de mon projet. L’identification de peptides à activité biologique est à la base du développement de nombreuses thérapies : de nombreux peptides naturels ont été caractérisés et portent des activités biologiques très diverses. Citons par exemple les hormones, les inhibiteurs d’enzymes, les facteurs de croissance etc. La molécule agoniste que j’ai pour but de synthétiser est un analogue de la deltorphine I, présente ci-contre :

Figure.3

La particularité de ce peptide est qu’il comporte deux N-terminaux à l’inverse des autres qui comportent un N-terminal et un C-terminal. Ce qui, d’un point de vue métabolique, lui permet de se dégrader plus facilement dans l’organisme. 1.

Synthèse organique

Cette partie du projet a consisté à synthétiser une molécule qui a été ensuite rattachée à la chaîne peptidique également synthétisée, et dont je parlerai par la suite, pour ainsi former l’analogue de la deltorphine I. C’est une synthèse en huit étapes que j’ai entreprise sous la supervision de Jean-Louis Beaudeau. Cette molécule est la suivante :

Figure.4

Comme dit précédemment, la sélectivité des récepteurs restent un problème. Ces trois récepteurs lient les peptides opioïdes endogènes avec une faible sélectivité. La cause, une forte homologie de séquence protéique qui rend la sélectivité et l’évaluation comme cible thérapeutique du récepteur delta, difficile. De plus une substance donnée peut interagir avec les trois récepteurs différents de manière différente. Il peut donc pour cette raison exister des différences d’effets entre les opioïdes disponibles. La deltorphine I présente déjà une bonne sélectivité pour le récepteur delta, ceci est dû dans un premier temps aux cycles aromatiques qui augmentent la rigidité du peptide, puis dans un second temps au fait qu’il soit idéalement présenté devant certaines chaînes latérales de la séquence protéique du récepteur delta et enfin liée à l’occupation de la poche hydrophobe du récepteur. Or, cela reste insuffisant pour étudier convenablement le récepteur delta sans stimuler le récepteur mu. La molécule ci-dessus (figure.4) attachée au peptide constituerait une solution, en effet elle augmente davantage cette sélectivité attendue pour le récepteur delta toujours avec les mêmes raisons, présence de cycles aromatiques supplémentaires, position idéale devant le récepteur que l’on pourrait expliciter par le concept de « clef-serrure » entre les deux et enfin occupation de la poche plus importante. En plus de la sélectivité qui est accrue, le peptide possède l’énorme avantage de ne pas générer de métabolites toxiques et se dégrade rapidement in vivo, à contrario de la morphine. 1.1 Manipulations et résultats Pour obtenir celle-ci, j’ai suivi une partie d’un protocole en y apportant quelques modifications (voir annexe 1). Cependant j’ai tout de même testé au préalable le protocole pour vérifier si les résultats et rendements étaient probants. La molécule finale sans modifications de protocole était :

Figure.5

La voie de synthèse est la suivante :

MeONH2.HCl ; EtOH ; Pyridine

Bromure de crotyle ; Zn ; NH4Cl (aq) : THF

Reflux 15 h

3 h, rt

55 %

58 %

Anhydride phtalique ; Et3N Dean Stark over night 57 % 1) (COCl)2 ; CH2Cl2 ; DMF ; 0°C

1) Cat. H-G (5 mol %) ; toluène ; benzoquinone (15 mol %) 110°C reflux 3 h

5 h, rt 2 h, rt

2) Et3N ; CH2Cl2 ; 0°C

55 %

2) Reflux 6 h DMSO 1 h, rt 64 % 1) Quinuclidine ; tamis ; méthanol 24 h, rt

2) Méthylamine ; 60°C 30 min 50 %

Les résultats obtenus ont été satisfaisants avec un rendement global de 57 %. J’ai donc adopté cette partie de protocole pour la molécule désirée :

Bromure d’allyle ; Zn ; NH4Cl (aq) : THF

MeONH2.HCl ; EtOH ; Pyridine Reflux 15 h

3 h, rt

41 %

62 %

Anhydride phtalique ; Et3N Dean Stark over night 22 % 1) (COCl)2 ; CH2Cl2 ; DMF ; 0°C

5 h, rt 2 h, rt

2) Et3N ; CH2Cl2 ; 0°C

52 % 1) Cat. H-G (5 mol %) ; toluène ; benzoquinone (15 mol %) 110°C reflux 3 h 2) Reflux 6 h DMSO 1 h, rt 1) Quinuclidine ; tamis ; méthanol 24 h, rt

100 %

LiOH (1N) : THF 2) Méthylamine ; 60°C 30 min

Over night 100 %

28 %

J’ai recommencé la synthèse en utilisant tout d’abord du bromure d’allyle plutôt que le bromure de crotyle lors de la seconde étape afin d’éviter le groupement méthyle attaché à

l’aromatique, et ainsi avoir un encombrement moindre lors du couplage avec la chaîne peptidique. J’ai ensuite hydrolysé l’ester à la fin de la synthèse pour obtenir l’acide carboxylique, le méthyle de la fonction ester stabilise la molécule, on l’hydrolyse donc pour avoir une meilleure réactivité. Et enfin la molécule devait être protégée avec un Fmoc. L’hydrolyse et la protection étant deux étapes nécessaires afin de pouvoir coupler la molécule à la résine utilisée par la suite pour la synthèse du peptide. Le rendement global de cette deuxième synthèse fut de 58 % ; 0,34 g de composé désiré obtenu, avant protection. En ce qui concerne les méthodes et techniques utilisées pour l’ensemble de la synthèse, elles ont été généralement identiques. Les réactions étaient lancées, certaines de 24 h ou plus avec ajout de réactifs au bout d’une certaine durée, le suivie de la réaction...